Patroongeneratie voor micropatterntractiemicroscopie

Dit protocol zorgt voor de consistente creatie van high-fidelity eiwit micropatronen van elke gewenste vorm, met name geïsoleerde eilanden van patroon voor de studie van celclusters. Deze techniek kan worden gebruikt om geïsoleerde eilandmicropatronen van elke vorm en grootte in slechts één stap te maken, terwijl voorheen het maken van dergelijke patronen twee afzonderlijke stappen vereiste. Begin met het mengen van PDMS in de juiste uithardingsmiddel-basisverhouding zoals beschreven in de instructies van de fabrikant.

Incubeer bij kamertemperatuur en druk gedurende 15 minuten en ontgaad het mengsel vervolgens gedurende 15 minuten onder vacuüm. Giet de PDMS in de hoofdvorm en breng het over naar een incubator die is ingesteld op 37 graden Celsius om 's nachts uit te harden. Verwijder de hoofdvorm uit de incubator en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur.

Terwijl de hoofdmal afkoelt, soniceer je 25 millimeter coverslips in ethanol gedurende 10 minuten. Gebruik evenveel coverslips als het aantal postzegels dat wordt voorbereid. Spoel de coverslips grondig af met DI-water en droog ze met een gefilterd luchtpistool.

Behandel de coverslips gedurende één minuut met plasma met behulp van de plasmareiniger onder een hoog vacuüm. Laat het vacuüm na de behandeling langzaam los om te voorkomen dat de dekzeilen in de kamer bewegen. Bestrijk elke coverslip met 100 microliter van de fluorescerende gelabelde eiwitoplossing in een ruimte zonder direct zonlicht of bovenlicht.

Dek de monsters af voor extra bescherming tegen licht en incubeer ze gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Spoel elke afdekplaat grondig af met DI-water. Verwijder overtollig water van het oppervlak door voorzichtig op de zijkanten van elke dekplaat op een papieren handdoek of een vergelijkbaar absorberend materiaal te tikken.

Laat de dekens volledig drogen door ze minstens 30 minuten onbedekt in het donker te laten. Terwijl de met eiwitten gecoate coverslips drogen, verwijdert u de PDMS-stempel uit de hoofdvorm door deze te snijden met een scalpel of een scherp mes. Behandel de PDMS-stempels met plasma gedurende twee minuten onder een hoog vacuüm.

Plaats de stempels in een container met een deksel onder de zuurkast en bedek vervolgens elke stempel met een dunne laag van 10% 3-APTMS verdund in 100% ethanol. Bedek de container met de stempels en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Spoel elke stempel aan beide zijden grondig af met DI-water.

Plaats de stempels in een schone container en bekleed ze met 2,5% glutaaraldehyde bereid in DI-water. Bedek de stempels en incubeer ze op kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Spoel de stempels grondig af met DI-water.

Verwijder overtollig water van het oppervlak zoals eerder beschreven en laat de stempels 30 minuten onbedekt drogen. Als na 30 minuten de met eiwitten bedekte coverslips of de stempels niet volledig droog zijn, gebruik dan een gefilterd luchtpistool om ze volledig te drogen. Duw de patroonzijde van de stempels op de dekplaten met voldoende druk om ze volledig contact te laten maken.

Laat het 15 minuten ongestoord. Pel vervolgens voorzichtig de PDMS-stempels van de coverslips. Controleer met behulp van een fluorescerende microscoop met het juiste filter de getrouwheid van de patroondeksels.

Gebruik de patroondeksels onmiddellijk of bewaar ze uit de buurt van direct licht tot verder gebruik. Voordat u de PAA hydrogel-precursor bereidt, verwijdert u de acrylzuur NHS-ester uit de koelkast om op kamertemperatuur te komen voordat u deze opent. Bereid een verwisselbare coverslip schotelset door deze te steriliseren met 70% ethanol en incubaleer deze vervolgens onder UV-licht in een bioveiligheidskast gedurende ten minste 30 minuten voor gebruik.

Voeg onder de zuurkast 1,25 milliliter 40% acrylamide bereid in DI-water toe aan een conische buis van 15 milliliter. Voeg aan dezelfde buis 175 microliter bis-acrylamideoplossing toe, bereid in DI-water. Voeg vervolgens 500 microliter 10X PBS toe, gevolgd door 2.915 milliliter DI-water.

Pipetteer 969 microliter van deze precursor in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en bewaar de rest bij vier graden Celsius gedurende maximaal twee weken. Meet 50 tot 100 milligram APS in een verse microcentrifugebuis en verdun deze tot 100 milligram per milliliter in DI-water. Open de NHS-ester in de kap en meet zorgvuldig tot drie milligram NHS in een microcentrifugebuis.

Verdun de NHS-ester tot één milligram per milliliter in 1X PBS. Voeg onder de zuurkast twee microliter TEMED toe aan de microcentrifugebuis die het aliquot van 969 microliter PAA-precursor bevat. Voeg 15 microliter van één molaire HCL toe om de pH van de hydrogeloplossing te verlagen en hydrolyse van de NHS-ester te voorkomen.

Voeg 10 microliter van de NHS-esteroplossing toe aan de buis. Voer de volgende stappen uit in een bioveiligheidskast. Plaats de 30 millimeter coverslip voorzichtig in het middelste deel van de coverslip schotelset met de 3-APTMS en glutaraldehyde behandelde kant naar boven en schroef de plastic ring erop.

Stel de patroondeksellip in met minimale blootstelling aan licht om u voor te bereiden op de volgende stap. Pipetteer vijf microliter APS-oplossing in de PAA-voorloper aliquotbuis, keer vervolgens om en meng. Pipetteer onmiddellijk 35 microliter van deze oplossing op de afdekplaat van 30 millimeter.

Plaats de patroondeksel op de oplossing met de eiwitzijde naar beneden. Pas op dat u geen luchtbellen in de hydrogel creëert. Bescherm de hydrogel tegen licht en laat hem 90 minuten polymeriseren.

Zodra de hydrogel is gepolymeriseerd, gebruik je een scheermesje of scalpel om de bovenste coverslip te verwijderen, zorg je ervoor dat de coverslip niet terugvalt of van de gel glijdt zodra deze is verwijderd om te voorkomen dat het patroon op het oppervlak van de gel wordt verpest. Om de resterende NHS-ester in de hydrogel te passiveren, voegt u twee milliliter steriel PBS toe aan de gel en incubeert u gedurende 45 minuten bij 37 graden Celsius. Bereid de gels onmiddellijk voor op experimenten of bewaar ze een nacht in steriel PBS bij vier graden Celsius tot verder gebruik.

De hydrogels werden indirect gemodelleerd met fluorescerend fibronectine om cellulaire tractiekrachten binnen clusters te visualiseren en te meten en eilandpatronen van vooraf bepaalde grootte en vorm te creëren. De patroonkwaliteit was direct gerelateerd aan de getrouwheid van de meestermal waaruit de PDMS-stempel was gegoten. Deze methode zou geïsoleerde, goed gedefinieerde eilandpatronen van vooraf bepaalde vorm kunnen fabriceren.

De fibronectine adhesie stippen waren alleen aanwezig binnen het gewenste gebied van het eiland. Deze geïsoleerde eilanden van adhesiepunten maakten het verder mogelijk om de clustervorm beter te beheersen. Het coaten van PDMS-stempels met twee kleine 3-APTMS is van cruciaal belang omdat het de effectiviteit van de verwijderingsmethode zal beperken, terwijl te veel een oranje residu op het stempeloppervlak zal creëren.

De patronen die hier worden gecreëerd, kunnen worden gebruikt om cellulaire tractiekrachten in zowel individuele cellen als clusters te bepalen, wat inzicht geeft in hun vermogen om mechanische homeostase te behouden.