Bacteriële expressie en zuivering van humane matrix metalloproteinase-3 met behulp van affiniteitschromatografie
30 maart 2022
His-tag zuivering, dialyse en activering worden gebruikt om de opbrengst van oplosbare, actieve matrix metalloproteinase-3 katalytische domein eiwitexpressie in bacteriën te verhogen. Eiwitfracties worden geanalyseerd via SDS-PAGE gels.
Dit gedetailleerde protocol beschrijft een zeer efficiënte en kosteneffectieve methode van bacteriële expressie voor recombinant MMP-3 katalytisch domein in E.Coli, die kan worden toegepast op andere MMP therapeutische doelen. E.coli mist een complex eiwitvouwings- en posttranslationele verwerkingssysteem. Deze methode maakt gebruik van de R2DP-celstam om de expressie van eukaryote eiwitten in E.coli te verbeteren.
Overproductie van specifieke MMP's leidt tot verschillende ziekten zoals kanker, cardiovasculaire en neurodegeneratieve ziekten. Actieve oplosbare MMP's zijn nodig voor de ontwikkeling van MMP-remmende therapieën. Ent een enkele geïsoleerde kolonie van pET His-tag pro MMP-3 katalytische domeintransformatiemiddel uit een LB-ampicilline chlooramfenicolresistente plaat in vijf milliliter LB-ampicilline chlooramfenicolresistente media bij 37 graden Celsius.
Bewaar aliquots van elke cultuur en bereid 40% glycerol aandelen. Ent een kolf van één liter met 500 milliliter LB ampicilline chlooramfenicolbestendig medium tot een optische dichtheid van 0,05 tot 0,1 bij 600 nanometer met de nachtcultuur. Meet de optische dichtheid op 600 nanometer op verschillende tijdstippen, meestal gedurende drie tot vier uur totdat deze tussen 0,4 en 0,6 valt.
Induceer de culturen met één molaire IPTG-stam tot een eindconcentratie van één millimolar. Incubeer nog eens drie tot vier uur in de shaker van 37 graden. Centrifugeer de cellen in conische flessen van 250 milliliter bij 13.000 G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten en herhaal totdat de culturen volledig zijn gepelletiseerd.
Voeg drie milliliter lysisbuffer per gram pellet toe en reuspend de pellet door vortexing of pipetteren. Voeg 1,25 milliliter 10%volumegewicht natriumdeoxycholaat per liter cultuur toe. Voeg 10 microliter DNase I toe per liter cultuur.
Schud bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten bij 150 RPM. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 13.000 G en vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg.
Resuspend de pellet in 100 milliliter per liter cultuur van inclusielichaambuffer door op en neer te pipetteren. Houd de monsters op ijs tijdens ultrasoonapparaat om oververhitting te voorkomen. Soniceer elk monster gedurende zes cycli van 15 seconden, een output van vijf en een 50% puls.
Centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 13.000 G en vier graden Celsius. Controleer de pellet. Als de pellet compact is, gooit u het supernatant weg.
Resuspend elke pellet uit een cultuur van één liter en vijf milliliter oplosbuffer. Incubeer gedurende ten minste 30 minuten op ijs om de eiwitten te laten oplossen. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 13.000 keer G in vier graden Celsius.
Als de pellet zich na centrifugeren vormt, giet het supernatant dan in een aparte conische buis van 50 milliliter. Resuspend de pellet in nog eens vijf milliliter oplosbuffer per liter cultuur door op en neer te pipetteren. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 13.000 G en vier graden Celsius.
Trek vervolgens de supernatanten. Gooi de pellet weg of bewaar deze bij min 80 graden Celsius voor extra ultrasoonapparaat. Maak een oogje in het zeil tegen de HT-wasbuffer en noteer de A280 van de eerste wasfractie.
Herhaal dit met andere breuken totdat A280 de basislijn nadert. Eluteer onmiddellijk His-tagged eiwitten door vijf milliliter HT-elutiebuffer toe te voegen. Verzamel de doorstroom bij 0,5 tot één milliliterfractie in microfugebuizen met het label HT-elutie.
Meet de A280 van de elutiedractie. Als de A280 groter is dan 0,3 milligram per milliliter, verdunt u de fractie met HT-equilibratiebuffer. Dompel de geëlueerde MMP-fracties onder in dialysebuizen in een liter dialysebuffer één en roer de slang en de inhoud ervan gedurende ten minste acht uur op een magnetische roer bij vier graden Celsius.
Breng over op één liter dialysebuffer twee en roer de slang en de inhoud ervan op een magnetische roer gedurende ten minste acht uur bij vier graden Celsius. Breng vervolgens over naar één liter dialysebuffer drie en roer de slang en de inhoud ervan op een magnetische roer gedurende maar liefst acht uur bij vier graden Celsius. Breng het monster over in een geschikte container en label ze als gebeld MMP.
Onderzoek de buis op neerslag. Voeg per één milliliter aliquot van één milligram per milliliter MMP 50 microliter van 20 millimolaire APMA toe om een uiteindelijke APMA-concentratie van één millimolar te bereiken. Als zich een neerslag vormt, centrifugeer het dan op maximale snelheid gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.
Bewaar het supernatant in een microfugebuis van 1,5 milliliter met het label geactiveerde MMP. Gooi het neerslag weg in een container die is gemarkeerd voor APMA-afval. SDS-PAGE werd uitgevoerd om de His-tag zuiveringsemissiefracties van His-tag pro MMP-3 katalytisch domein van BL21 DE3-cellen in R2DP-cellen te vergelijken.
De eerste acht elutiefracties van het His-tagged MMP katalytische domein en BL21 DE3 cellen vertoonden minder eiwit dan die in het His-tagged MMP katalytische domein in R2DP cellen. De geïnduceerde, opnieuw gevouwen, geconcentreerde, geactiveerde en ontzoute fracties van MMP3 CD- en R2DP-cellen worden getoond. Bij activering is het molecuulgewicht van de geactiveerde MMP-3 CD-band ongeveer 20 kilodalton, in tegenstelling tot het His-tagged zymogeen dat op ongeveer 30 kilodalton blijft.
Wanneer het centrifugeren van cellen lyseert, zijn pellets mogelijk niet compact. Wanneer dat gebeurt, soniceer dan meer en centrifugeer langer. Bij het reconcentreren van het eiwit kan neerslag optreden.
Los het op in oplosbuffer en herhaal het proces. De hier beschreven procedure biedt een gedetailleerde methode voor oplosbare expressie van actieve menselijke MMP's die uiteindelijk kan worden gebruikt om het moleculaire mechanisme van MMP-enzymatische activiteit te begrijpen. Alternatieve eiwitzuiveringsmethoden zoals FPLC kunnen worden uitgevoerd op gezuiverde MMP-eiwitten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor de expressie van het recombinante MMP-3 katalytische domein in E. coli, waarbij de R2DP cellijn wordt gebruikt om de eiropbrengsten te verhogen. Het proces omvat His-tag zuivering, dialyse en activatie om een oplosbaar, actief eiwit te verkrijgen dat geschikt is voor therapeutische toepassingen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Proteïne-engineering
- Ontwikkeling van therapeutica
Achtergrond
- Matrixmetalloproteïnasen (MMP's) zijn betrokken bij diverse ziekten, waaronder kanker en neurodegeneratieve aandoeningen.
- Actieve oplosbare MMP's zijn essentieel voor de ontwikkeling van MMP-remmers.
- E. coli wordt veelvuldig gebruikt voor eiwitexpressie vanwege de eenvoud en kosteneffectiviteit.
- De R2DP-stam verhoogt de expressie van eukaryote eiwitten in bacteriële systemen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een kosteneffectieve methode voor de productie van een actief MMP-3 katalytisch domein in E. coli.
- Het bieden van een protocol dat kan worden aangepast voor andere therapeutische MMP-doelen.
- Het faciliteren van onderzoek naar MMP's en hun rol in ziektemechanismen.
Gebruikte methoden
- Inoculatie van getransformeerde E. coli vanuit selectieve media.
- His-tag zuivering om het katalytische domein van MMP-3 te isoleren.
- Dialyse om onzuiverheden te verwijderen en het eiwit te concentreren.
- Analyse van eiwitfracties met behulp van SDS-PAGE gels.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle expressie van het oplosbare katalytische domein van MMP-3 in E. coli.
- Hoge opbrengsten van actief eiwit dat geschikt is voor therapeutische toepassingen.
- Gedemonstreerde effectieve zuiverings- en analysemethoden.
- Protocol toepasbaar op andere MMP's en vergelijkbare eiwitten.
Conclusies
- De beschreven methode biedt een betrouwbare aanpak voor de productie van MMP-3 in een bacterieel systeem.
- Verbeteringen in de eiwitopbrengst en oplosbaarheid kunnen bijdragen aan de therapeutische ontwikkeling.
- Dit protocol kan dienen als basis voor toekomstige studies naar MMP's.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit protocol maakt een kosteneffectieve productie met een hoog rendement van het actieve menselijke MMP-3 katalytische domein in E. coli mogelijk, waarmee een belangrijke bottleneck in de validatie van targets voor MMP-gerelateerde therapieën wordt weggenomen. Door de opbrengst van oplosbare expressie en zuivering te verbeteren, ondersteunt het vroege hypothesetoetsing en mechanistische risicoreductie in programma's voor geneesmiddelenonderzoek op het gebied van oncologie, neurodegeneratieve ziekten en cardiovasculaire aandoeningen. De methode verbetert de portfoliobereidheid door betrouwbare toegang te bieden tot bioactief eiwit voor inhibitor-screening en assay-ontwikkeling.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar de therapeutische hypothese van MMP-3 mogelijk door de productie van een actief, oplosbaar katalytisch domein voor functionele assays.
- Operationele waarde: Vermindert de afhankelijkheid van dure zoogdiersystemen door de bacteriële expressieopbrengst en oplosbaarheid te verbeteren via de R2DP-stam.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in het target door het leveren van een consistent eiwit in natuurlijke conformatie voor downstream validatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gezuiverd MMP-3 dat geschikt is voor de ontwikkeling van biochemische en celgebaseerde assays om de potentie en selectiviteit van inhibitoren te evalueren.
- Operationele waarde: Levert een gestandaardiseerde, kwantificeerbare proteïneopbrengst via His-tag zuivering en dialyse, wat reproduceerbare screening van verbindingen mogelijk maakt.
- Schaalbaarheid: Maakt gebruik van eenvoudige inductie- en lysestappen die compatibel zijn met opschaling naar cultuurschalen van meerdere liters voor de productie van assay-reagentia.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Ondersteunt de overgang van targetvalidatie naar preklinische studies door actieve MMP-3 te leveren voor onderzoeken naar het werkingsmechanisme en biomarkers.
- Mechanistische Risicoreductie: Maakt het mogelijk om de effecten van MMP-3-inhibitie op ECM-remodelleringstrajecten die gekoppeld zijn aan ziektefenotypes te beoordelen.
- Voorspellende Betrouwbaarheid: Maakt structuur-functiecorrelatie mogelijk met behulp van gezuiverd eiwit om de optimalisatie van leadverbindingen te onderbouwen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het vroege stadium van het ontdekkingsproces, waardoor doelwitvalidatie via de productie van recombinant eiwit mogelijk wordt, wat vervolgens de identificatie van lead-verbindingen en de preklinische evaluatie van MMP-remmers ondersteunt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door actief MMP-3 te leveren om de rol ervan in proteolytische paden en ziekteverschijnselen te verduidelijken.
- Screening: Levert gezuiverd eiwit dat geschikt is voor high-throughput biochemische assays om inhibitor-kandidaten te identificeren en te rangschikken.
- Analytica: Maakt kwantitatieve beoordeling mogelijk via A280-meting en SDS-PAGE om expressieopbrengsten en zuiveringsefficiëntie tussen verschillende stammen te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt ontdekking met preklinisch werk door eiwit te leveren voor ex vivo weefseldegradatie en studies naar cytokine-interacties.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een schaalbaar, aanpasbaar platform voor de productie van andere MMP-katalytische domeinen, waardoor de inspanning voor heroptimalisatie over verschillende targets wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in MMP-3 als therapeutisch doelwit door de consistente productie van actief eiwit mogelijk te maken.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en opbrengst in vergelijking met BL21(DE3), waardoor batchfouten en reagenskosten bij de eiwitproductie worden verminderd.
- Strategische waarde: Versnelt go/no-go-beslissingen door betrouwbare toegang tot het doeleiwit te bieden voor vroege inhibitor-profilering.
- Portfolio-impact: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van MMP-gerichte programma's door een verbeterde doorvoersnelheid van doelwitvalidatie.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist moleculair-biologische expertise in klonering, transformatie en induceerbare expressiesystemen.
- Afhankelijk van standaard laboratoriumapparatuur, waaronder schudmachines, centrifuges, sonicators en dialyseapparatuur.
- Optimalisatie van inductietijd en temperatuur is noodzakelijk voor de oplosbaarheid van verschillende MMP-targets.
- Omvat het werken met denaturerende en solubiliserende middelen, waarvoor passende veiligheidsprotocollen vereist zijn.
- De activatie-efficiëntie kan variëren en moet worden gemonitord via APMA-behandeling en SDS-PAGE om de splitsing van het zymogeen te bevestigen.
