Bacteriële expressie en zuivering van humane matrix metalloproteinase-3 met behulp van affiniteitschromatografie

Dit gedetailleerde protocol beschrijft een zeer efficiënte en kosteneffectieve methode van bacteriële expressie voor recombinant MMP-3 katalytisch domein in E.Coli, die kan worden toegepast op andere MMP therapeutische doelen. E.coli mist een complex eiwitvouwings- en posttranslationele verwerkingssysteem. Deze methode maakt gebruik van de R2DP-celstam om de expressie van eukaryote eiwitten in E.coli te verbeteren.

Overproductie van specifieke MMP's leidt tot verschillende ziekten zoals kanker, cardiovasculaire en neurodegeneratieve ziekten. Actieve oplosbare MMP's zijn nodig voor de ontwikkeling van MMP-remmende therapieën. Ent een enkele geïsoleerde kolonie van pET His-tag pro MMP-3 katalytische domeintransformatiemiddel uit een LB-ampicilline chlooramfenicolresistente plaat in vijf milliliter LB-ampicilline chlooramfenicolresistente media bij 37 graden Celsius.

Bewaar aliquots van elke cultuur en bereid 40% glycerol aandelen. Ent een kolf van één liter met 500 milliliter LB ampicilline chlooramfenicolbestendig medium tot een optische dichtheid van 0,05 tot 0,1 bij 600 nanometer met de nachtcultuur. Meet de optische dichtheid op 600 nanometer op verschillende tijdstippen, meestal gedurende drie tot vier uur totdat deze tussen 0,4 en 0,6 valt.

Induceer de culturen met één molaire IPTG-stam tot een eindconcentratie van één millimolar. Incubeer nog eens drie tot vier uur in de shaker van 37 graden. Centrifugeer de cellen in conische flessen van 250 milliliter bij 13.000 G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten en herhaal totdat de culturen volledig zijn gepelletiseerd.

Voeg drie milliliter lysisbuffer per gram pellet toe en reuspend de pellet door vortexing of pipetteren. Voeg 1,25 milliliter 10%volumegewicht natriumdeoxycholaat per liter cultuur toe. Voeg 10 microliter DNase I toe per liter cultuur.

Schud bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten bij 150 RPM. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 13.000 G en vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg.

Resuspend de pellet in 100 milliliter per liter cultuur van inclusielichaambuffer door op en neer te pipetteren. Houd de monsters op ijs tijdens ultrasoonapparaat om oververhitting te voorkomen. Soniceer elk monster gedurende zes cycli van 15 seconden, een output van vijf en een 50% puls.

Centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 13.000 G en vier graden Celsius. Controleer de pellet. Als de pellet compact is, gooit u het supernatant weg.

Resuspend elke pellet uit een cultuur van één liter en vijf milliliter oplosbuffer. Incubeer gedurende ten minste 30 minuten op ijs om de eiwitten te laten oplossen. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 13.000 keer G in vier graden Celsius.

Als de pellet zich na centrifugeren vormt, giet het supernatant dan in een aparte conische buis van 50 milliliter. Resuspend de pellet in nog eens vijf milliliter oplosbuffer per liter cultuur door op en neer te pipetteren. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 13.000 G en vier graden Celsius.

Trek vervolgens de supernatanten. Gooi de pellet weg of bewaar deze bij min 80 graden Celsius voor extra ultrasoonapparaat. Maak een oogje in het zeil tegen de HT-wasbuffer en noteer de A280 van de eerste wasfractie.

Herhaal dit met andere breuken totdat A280 de basislijn nadert. Eluteer onmiddellijk His-tagged eiwitten door vijf milliliter HT-elutiebuffer toe te voegen. Verzamel de doorstroom bij 0,5 tot één milliliterfractie in microfugebuizen met het label HT-elutie.

Meet de A280 van de elutiedractie. Als de A280 groter is dan 0,3 milligram per milliliter, verdunt u de fractie met HT-equilibratiebuffer. Dompel de geëlueerde MMP-fracties onder in dialysebuizen in een liter dialysebuffer één en roer de slang en de inhoud ervan gedurende ten minste acht uur op een magnetische roer bij vier graden Celsius.

Breng over op één liter dialysebuffer twee en roer de slang en de inhoud ervan op een magnetische roer gedurende ten minste acht uur bij vier graden Celsius. Breng vervolgens over naar één liter dialysebuffer drie en roer de slang en de inhoud ervan op een magnetische roer gedurende maar liefst acht uur bij vier graden Celsius. Breng het monster over in een geschikte container en label ze als gebeld MMP.

Onderzoek de buis op neerslag. Voeg per één milliliter aliquot van één milligram per milliliter MMP 50 microliter van 20 millimolaire APMA toe om een uiteindelijke APMA-concentratie van één millimolar te bereiken. Als zich een neerslag vormt, centrifugeer het dan op maximale snelheid gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Bewaar het supernatant in een microfugebuis van 1,5 milliliter met het label geactiveerde MMP. Gooi het neerslag weg in een container die is gemarkeerd voor APMA-afval. SDS-PAGE werd uitgevoerd om de His-tag zuiveringsemissiefracties van His-tag pro MMP-3 katalytisch domein van BL21 DE3-cellen in R2DP-cellen te vergelijken.

De eerste acht elutiefracties van het His-tagged MMP katalytische domein en BL21 DE3 cellen vertoonden minder eiwit dan die in het His-tagged MMP katalytische domein in R2DP cellen. De geïnduceerde, opnieuw gevouwen, geconcentreerde, geactiveerde en ontzoute fracties van MMP3 CD- en R2DP-cellen worden getoond. Bij activering is het molecuulgewicht van de geactiveerde MMP-3 CD-band ongeveer 20 kilodalton, in tegenstelling tot het His-tagged zymogeen dat op ongeveer 30 kilodalton blijft.

Wanneer het centrifugeren van cellen lyseert, zijn pellets mogelijk niet compact. Wanneer dat gebeurt, soniceer dan meer en centrifugeer langer. Bij het reconcentreren van het eiwit kan neerslag optreden.

Los het op in oplosbuffer en herhaal het proces. De hier beschreven procedure biedt een gedetailleerde methode voor oplosbare expressie van actieve menselijke MMP's die uiteindelijk kan worden gebruikt om het moleculaire mechanisme van MMP-enzymatische activiteit te begrijpen. Alternatieve eiwitzuiveringsmethoden zoals FPLC kunnen worden uitgevoerd op gezuiverde MMP-eiwitten.