Efficiënte zoogdiercelexpressie en Single-step Zuivering van extracellulaire Glycoproteïnen voor kristallisatie

Het algemene doel van deze techniek voor eiwitexpressie in zoogdieren is het produceren van milligramhoeveelheden natuurlijk gevouwen eiwitten die geschikt zijn voor structurele, biofysische en functionele studies. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een snel en eenvoudig protocol is voor het verkrijgen van gesecreteerde eiwitten uit zoogdieren in een zuiverheid en concentratie die vereist zijn voor structurele studies. Over het algemeen stellen we vast dat de meeste problemen met de eiwitopbrengst te wijten zijn aan de gezondheid en levensvatbaarheid van de cellen.

Door de cellevensvatbaarheid nauwgezet in de gaten te houden en daarnaast de suikerspiegels in het medium te monitoren, verbetert u zowel de eiwitopbrengst aanzienlijk als de bruikbaarheid van de cellen. Het is daarnaast zeer belangrijk om de celdichtheid te bewaken. Wij hebben vastgesteld dat wanneer de cellen op enig moment vóór transfectie een dichtheid van 2 miljoen cellen per milliliter overschrijden, de eiwitopbrengst sterk afneemt. Om grootschalige kweek van 2 93 F-cellen uit te voeren, vult u één liter 2 93 F-medium aan met 10 milliliter 100 x glutamine en vijf milliliter 100 x pen strep.

Het antibioticum heeft in serumvrije condities een voldoende sterkte en de verlaagde antibioticaconcentratie verbetert de celviabiliteit tijdens transfectie, wat de eiwitopbrengst van de cultuur verbetert. De 293 F-cellen worden gekweekt in 300 milliliter medium in polycarbonaat gebaffelde erlenmeyers van één liter met geventileerde doppen bij 37 °C met 8% koolstofdioxide, onder schudden in een standaard weefselkweekincubator één dag vóór transfectie. Verdun de cellen op de dag van transfectie tot een dichtheid van 0,5 miljoen cellen per milliliter. Vul het kweekmedium aan door 10% volume van 2% gewicht per volume cell boost in 293 F-medium toe te voegen.

Voeg kafu toe zoals te zien in deze stap om de glycosylering van eiwitten te controleren. Bereid de DNA- en transfectiereagensoplossingen voor in serumvrij medium en laat deze vijf minuten incuberen. Voeg vervolgens het transfectiereagens in stappen van één milliliter toe aan de DNA-oplossing onder mengend.

Incubeer voorzichtig gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur zodat de reagent-DNA-complexen zich kunnen vormen. Voeg de oplossing vervolgens druppelsgewijs toe aan de cellen; laat de getransfecteerde cellen 72 tot 96 uur de tijd om het eiwit tot expressie te brengen om het glycoproteïne te zuiveren. Giet eerst de kweek over in een centrifugebuis en centrifugeer 20 minuten bij 1300 Gs om de cellen te pelletteren. Verzamel het supernatant en centrifugeer indien nodig een tweede keer of gebruik een 0,22 micron filter om het supernatant te klaren.

Voeg vervolgens 10% volume van 10 x nikkel nitro load, tri azijnzuur of nikkel NTA-bindingsbuffer toe. Bereid daarna een gravitatiekolom voor bij vier graden Celsius door twee milliliter van het nikkel NTA-slurry aan een kolom toe te voegen en deze te equilibreren met 10 kolomvolumes van één x bindingsbuffer bij vier graden Celsius. Laat het supernatant door de hars stromen om de doorloopfractie op te vangen.

Nadat het supernatant is doorgegoten, wordt de kolom gewassen met 10 kolomvolumes washbuffer. Elueer vervolgens het eiwit in vijf kolomvolumes elutiebuffer. Als deglycosylering vereist is voor een eindvolume van 0,5 milliliters, concentreer EIT dan tot 0,43 milliliters met behulp van een centrifugatieconcentrator; pelleteer eventuele resten door centrifugatie bij 16.000 GS en vier graden Celsius.

Voeg vervolgens 50 µL 500 mM natriumcitraat, pH 5.5 en 20 µL endo HF toe. Incubeer het mengsel twee uur bij kamertemperatuur om de endo HF te verwijderen. Was de amylosehars vervolgens drie keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing. Incubeer het eiwit gedurende één uur bij 4 °C met de gewassen hars.

Centrifuge na incubatie vijf minuten bij 1000 Gs om de hars te pelletteren en verzamel het supernatant. Concentreer het eiwit met een passende molecular weight cutoff, centrifugatiefilter en bufferuitwisseling naar de getoonde opslagbuffer. Hier zijn representatieve SDS-PAGE resultaten voor een gesecretteerd eiwit dat is tot expressie gebracht in cine-behandelde cellen na nikkel-affiniteitschromatografie.

De eerste baan bevat het eiwit vóór deglycosylering en de tweede baan het eiwit na deglycosylering door endo hf. Het geglycosyleerde eiwit migreert ongeveer 10 kilodalton hoger en convergeert vervolgens naar één enkele band die consistent is met het voorspelde molecuulgewicht na deglycosylering, volgend op de enkele zuiveringsstap. Kristalschermen werden opgezet met de hanging-drop methode.

De bovenste afbeelding toont de initiële kristalhit en de onderste afbeelding toont geoptimaliseerde kristallisatiecondities. Dit demonstreert dat de biochemische homogeniteit van het eiwit van belang kan zijn als bepalende factor voor het succes van de kristallisatie, en dat een geoptimaliseerd mammaliaan expressiesysteem eiwitten produceert die geschikt zijn voor deze kristallisatie. Verdere zuivering van nikkelgezuiverd eiwit kan eenvoudig worden uitgevoerd via grootte-uitsluitingschromatografie.

Dit is ook een nuttige stap bij het evalueren van de eiwitproductie en het optimaliseren van de condities om correct gevouwen eiwitten te verkrijgen. Het eiwit van belang moet de belangrijkste component zijn in de chromatografische elutie, en het elutievolume moet overeenkomen met het molecuulgewicht van het eiwit. Eerdere EEU-tijden kunnen wijzen op aggregatie of misvouwen van het eiwit zodra dit beheerst is.

Deze techniek kan in vier dagen worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om steriele omstandigheden voor de celkweek te handhaven. Andere methoden, zoals grootte-uitsluitingschromatografie, multi-angle light scattering en differentiële scanning-fluorometrie, kunnen worden uitgevoerd om de oligomerisatiegraad en de thermische stabiliteit van het eiwit te beoordelen.