Efficiënte zoogdiercelexpressie en Single-step Zuivering van extracellulaire Glycoproteïnen voor kristallisatie

Het algemene doel van deze technieken voor eiwitexpressie bij zoogdieren is het produceren van milligramhoeveelheden van natuurlijk gevouwen eiwitten die geschikt zijn voor structurele, biofysische en functionele studies. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een snelle en eenvoudige protocol is voor het verkrijgen van uitgescheiden zoogdiereiwitten en een concentratie in zuiverheid die vereist is voor structurele studies. Over het algemeen merken we dat de meeste problemen met eiwitopbrengst te wijten zijn aan de gezondheid en levensvatbaarheid van de cellen.

Door de levensvatbaarheid van cellen nauwlettend te monitoren en ook de suikerniveaus in het medium te controleren, verbetert u zowel de eiwitopbrengst als verlengt u het nut van de cellen. Het is ook erg belangrijk om de celdichtheid te controleren. We merken dat als de cellen op enig moment voorafgaand aan transfectie 2 miljoen cellen per milliliter overschrijden, de eiwitopbrengst aanzienlijk wordt verminderd. Om grootschalige kweek van 2 93 F cellen uit te voeren, suppleeërt u een liter van 2 93 F medium met 10 milliliters van 100 x glutamine en vijf milliliters van 100 x pen strep.

Het antibioticum is voldoende sterk in serumvrije omstandigheden en de verminderde antibioticumconcentratie verbetert de celviabiliteit tijdens transfectie, wat de eiwitopbrengst verbetert. De 2 93 F cellen in 300 milliliters medium in een liter, polycarbonaat baffles erlenmeyer kolven met ontluchtingsdoppen bij 37 graden Celsius met 8% koolstofdioxide terwijl geschud in een standaard weefselkweekincubator een dag voor transfectie, verdund de cellen tot 0,5 miljoen cellen per milliliter dichtheid op de dag van transfectie. Supplementeer het kweekmedium door 10% volume van 2% gewicht per volume celboost in 2 93 F medium toe te voegen.

Voeg kafu in seen toe in deze stap om eiwitglycosylering te controleren. Bereid DNA en transfectiereagensoplossingen in serumvrij medium, incubeer gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens het transfectiereagens toe aan de DNA-oplossing in stappen van één milliliter met mixen.

Incubeer zachtjes gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om reagens-DNA complexen te laten vormen. Voeg vervolgens de oplossing druppelsgewijs toe aan de cellen. Laat de getransfecteerde cellen het eiwit 72 tot 96 uur laten uitdrukken om het glycoproteïne te zuiveren. Decanteer eerst de kweek in een centrifugeerkolf en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 1300 Gs. Om de cellen te pelleten, verzamel het supernatant en indien nodig, centrifugeer een tweede keer en/of gebruik een 0,22 micrometer filter om het supernatant te klaren.

Voeg vervolgens 10% volume van 10 x nikkel nitro load, tri-azijnzuur of nikkel NTA binding buffer toe. Bereid vervolgens een zwaartekrachtkolom voor bij vier graden Celsius door twee milliliter van de nikkel NTA slurry toe te voegen aan een kolom en te gelijken met 10 kolomvolumes van een x binding buffer die werkt bij vier graden Celsius. Laat het supernatant over de hars stromen en verzamel het doorlaat.

Na het gieten van het supernatant doorlaat over de kolom, was met 10 kolomvolumes wasbuffer. Eluteer vervolgens het eiwit in vijf kolomvolumes elutiebuffer. Als deglycosylering vereist is voor een eindvolume van 0,5 milliliters, concentreer EIT tot 0,43 milliliters met behulp van een centrifugatieconcentrator en pellet eventueel puin door centrifugatie bij 16.000 GS en vier graden Celsius.

Voeg vervolgens 50 microliters van 500 millimolair natriumcitraat, pH 5,5 en 20 microliters van endo hf toe. Incubeer het mengsel gedurende twee uur bij kamertemperatuur om de endo HF eerst te verwijderen, was amylosehars drie keer in fosfaat gebufferd zoutoplossing. Incubeer het eiwit met de gewassen hars gedurende één uur bij vier graden Celsius.

Na incubatie, centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1000 Gs om de hars te pelleten en verzamel het supernatant. Concentreer het eiwit met behulp van een geschikte molecuulgewichtsafsnijding, centrifugatiefilter, en bufferuitwisseling naar de opslagoplossing zoals getoond. Hier zijn representatieve SDS-pagina resultaten voor een uitgescheiden eiwit dat tot expressie gebracht is in cine behandelde cellen na nikkel affiniteitschromatografie.

De eerste baan is het eiwit voorafgaand aan deglycosylering, en de tweede baan is het eiwit na deglycosylering door endo hf. Het geglycosyleerde eiwit draait ongeveer 10 kilodaltons hoger en zakt dan samen tot een enkele band die consistent is met het voorspelde molecuulgewicht na deglycosylering, na de enkele zuiveringsstap. Kristalschermen zijn ingesteld met behulp van de druppelmethode.

De bovenste afbeelding toont de initiële kristalhit en de onderste afbeelding toont geoptimaliseerde kristallisatiecondities. Dit toont aan dat biochemische homogeniteit van het eiwit van belang kan zijn als bepalende factor voor kristallisatiesucces, en een geoptimaliseerd zoogdierexpressiesysteem produceert eiwitten die geschikt zijn voor deze kristallisatie. Verdere zuivering van nikkel gezuiverd eiwit kan gemakkelijk worden gedaan door middel van grootte-uitsluitingschromatografie.

Dit is ook een nuttige stap voor het evalueren van eiwitproductie en het optimaliseren van omstandigheden om goed gevouwen eiwitten op te leveren. Het eiwit van belang zou de belangrijkste soort in de chromatografische elutie moeten zijn, en het elutievolume moet overeenkomen met het molecuulgewicht van het eiwit. Eerdere EEU-tijden kunnen wijzen op aggregering of verkeerd vouwen van het eiwit Eenmaal beheerst.

Deze techniek kan in vier dagen worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om steriele omstandigheden voor celkweek te handhaven. Na deze procedure. Andere methoden zoals grootte, uitsluitingschromatografie, multi-angle lichtverstrooiing en differentiële scanning, fluorometrie kunnen worden uitgevoerd om de oligomerisatietoestand en de thermische stabiliteit van het eiwit te beoordelen.