Name: Efficiënte zoogdiercelexpressie en Single-step Zuivering van extracellulaire Glycoproteïnen voor kristallisatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Leer een efficiënte methode voor zoogdiercelexpressie en zuivering van glycoproteïnen met 293F-cellen. Dit protocol levert milligramhoeveelheden eiwitten geschikt voor kristallisatie en structurele studies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH R01-HL119813 (aan T.J.B.), American Lung Association RG-196051 (aan T.J.B.), een CIMED Pilot and Feasibility-subsidie (aan T.J.B.), American Heart Association Predoctoral Fellowships 14PRE19970008 (aan Z.Y.) en 15PRE22110004 (aan D.L.K.).

1. De productie van Milligram hoeveelheden van plasmide DNA voor grootschalige tijdelijke transfectie <ol><li> Kloon het eiwit van belang in een groot aantal kopieën zoogdierexpressievector behulp restrictieplaats klonering of andere geschikte techniek. <ol><li> Voor optimale resultaten gebruikt pHLsec 7 vector, die een ingebouwde C-terminaal 6His-tag, een sterke promoter Kozak-sequentie en een geoptimaliseerde secretiesignaal. </li></ol></li><li> Transformeer het plasmide op competente cellen. <ol><li> Voeg 20 pi competente E. coli cellen op 1 ug plasmide DNA en incubeer op ijs gedurende 30 min. </li><li> Heat shock cellen bij 42 ° C gedurende 35 seconden, vervolgens incuberen op ijs gedurende 2 minuten. </li><li> Voeg 300 ul van microbiële groeimedium (SOC) en incubeer bij 37 ° C gedurende 45 minuten, onder schudden bij 220 rpm. </li><li> Plaat cellen op agar plaat met de juiste antibiotica selectie. <ol><li> Met 100 ug / ml carbenicilline indien het plasmide in de vector pHLsec. </li></ol></li></ol></li><li> Cultuur kolonies in 250 ml Luria Broth (LB) medium aangevuld met 100 ug / ml antibioticum (carbenicilline) O / N bij 37 ° C, onder schudden bij 220 rpm. </li><li> Zuiver DNA van cultuur met Hi-Speed ​​Plasmid Maxi Kit volgens het protocol van de fabrikant. <ol><li> Elueer DNA in buffer EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) in plaats van buffer TE. </li><li> Aliquot het gezuiverde plasmide in hoeveelheid die nodig is voor transfectie en bewaar bij -20 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Grootschalige Cultuur en Transient Transfectie van 293F-cellen <ol><li> Supplement 1 L 293F medium met 10 ml glutamine en 5 ml Pen / Strep (beide 100x). Bewaar bij 4 ° C. 5 ml Pen / Strep een voldoende sterkte in serumvrije omstandigheden en de verlaagde antibioticumconcentratie verbetert levensvatbaarheid van de cellen gedurende transfectie, welk eiwit opbrengst verbetert. </li><li> Cultuur 293F cellen in 300 ml media in 1 L polycarbonaat verbijsterd erlenmeyers met geventileerde dops bij 37 ° C met 8% CO 2, onder schudden in een standaard weefselkweek incubator. </li><li> Verdun cellen tot 5 x 10 5 / ml dichtheid één dag voor transfectie. </li><li> Op de dag van transfectie supplement kweekmedium door toevoeging van 10% volume van 2% w / v Cell Boost in 293F media. <ol><li> Meet glucoseconcentratie met een glucosemonitor volgens de instructies van de fabrikant en gebruikt supplementen nodig is om een ​​glucoseconcentratie van 500 mg / dl te bereiken. </li></ol></li><li> Voeg kifunensine (1 ug / ml eindconcentratie) in deze stap proteïneglycosylering beheersen. </li><li> Bereken hoeveelheid DNA die nodig is voor 1 ug plasmide per 1 x 10 6 cellen. Onder steriele omstandigheden, verdund DNA in 5 ml serumvrij medium. </li><li> Bereken volume transfectiereagens vereist 1 ug plasmide per 2 pl transfectiereagens. Onder steriele omstandigheden verdunde transfectiereagens (PEI-TMC-25) in 5 ml serumvrij medium. </li><li> Toevoegentransfectiereagens in DNA-oplossing in stappen van 1 ml, voorzichtig mengen. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur reagens-DNA-complexen te vormen. Voeg vervolgens de oplossing op de cellen in een druppelsgewijze manier. </li><li> Sta getransfecteerde cellen om eiwitten te uiten voor 72-96 uur. Aanvullen met ~ 10% celvolume Boost Media dag, of zoals nodig blijven lezen glucose 400-600 mg / dl. </li></ol> 3. Zuivering <ol><li> Giet cultuur in een kolf centrifuge gecentrifugeerd gedurende 20 minuten bij 1300 xg om cellen te pelletiseren en verzamel de bovenstaande vloeistof. Eventueel spin tweede en / of gebruik 0,22 urn filter om supernatant te verduidelijken. </li><li> Voeg 10% volume 10x Ni-NTA bindingsbuffer (1,5 M NaCl, 0,5 MK 2 HPO 4, 0,1 M Tris pH 8,5, 50 mM imidazool). </li><li> Bereid een zwaartekracht kolom door toevoeging van 2 ml Ni-NTA slurry in een kolom en het equilibreren met 10 kolomvolumes (CV) 1x bindingsbuffer. Indien mogelijk, doe alle kolom stappen in een 4 ° C kamer. AlternativEly, chill eiwit en alle buffers op het ijs voordat kolom stap, en houdt eiwit en verzamelde doorstroming op het ijs. Opmerking: Ni-NTA brij 50% hars vol en verklaard bindingscapaciteit van de fabrikant is 50 mg / ml. Ni-NTA korrels kan worden opgeladen voor meerdere doeleinden </li><li> Stromen de bovenstaande vloeistof over de hars en het verzamelen van doorstroming. Herhaal deze stap. </li><li> Wassen met 10 CV wasbuffer (300 mM NaCl, 50 mM K 2 HPO 4, 20 mM imidazol pH 8). </li><li> Elueer het eiwit in 5 CV elutiebuffer (300 mM NaCl, 50 mM K 2 HPO 4, 250 mM imidazol pH 8). </li><li> Indien deglycosylatie vereist: <ol><li> Voor een eindvolume van 0,5 ml, concentraat eluaat 0,43 ml via een centrifugatie concentrator. Indien neerslaat vorm pellet vuil door centrifugatie bij 16000 xg en 4 ° C. </li><li> Voeg 50 ul van 500 mM Na-citraat pH 5,5. </li><li> Voeg 20 ul van EndoHf (1 x 10 6 U / ml). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. NietE: Het enzym werkt optimaal bij 37 ° C, hetgeen kan de geconcentreerde proteïneoplossing te aggregeren. Verleng de RT incubatie, indien deglycosylatie, bepaald door SDS-PAGE en immunoblotting, onvolledig. Het enzym heeft geen activiteit bij 4 ° C. </li><li> Om EndoHf verwijderen: Wash amylosehars 3x in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of definitieve opslag buffer. Incubeer eiwit met hars gedurende 1 uur bij 4 ° C. Spin 5 min bij 1000 xg om kralen pellet en verzamel de bovenstaande vloeistof. </li><li> Concentreer eiwit met behulp van geschikte moleculair gewicht cutoff centrifugeren filter en buffer uitwisseling in opslag buffer (150 mM NaCl en 20 mM HEPES pH 7,5). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-host+expression+system+for+recombinant+production+of+challenging+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins.</a> PLoS One. 8, e68674(2013).</li>
<li>Chang, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+structural+genomics%3A+solving+the+glycosylation+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem.</a> Structure. 15, 267-273 (2007).</li>
<li>Rich, J. R., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+methods+for+the+production+of+homogeneous+human+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins.</a> Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).</li>
<li>Wu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-2+promotes+macrophage+survival+and+lung+disease+after+respiratory+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection.</a> J Exp Med. 212, 681-697 (2015).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitigated+cytotoxicity+and+tremendously+enhanced+gene+transfection+efficiency+of+PEI+through+facile+one-step+carbamate+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification.</a> Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).</li>
<li>Elbein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosidase+inhibitors%3A+inhibitors+of+N-linked+oligosaccharide+processing%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing.</a> FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).</li>
<li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).</li>
<li>Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+mouse+triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells+1+%28TREM-1%29+at+1.76+A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A.</a> J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).</li>
<li>Kober, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+crystallization%2C+and+preliminary+crystallographic+analysis+of+wild-type+and+mutant+human+TREM-2+ectodomains+linked+to+neurodegenerative+and+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases.</a> Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).</li>
<li>Yurtsever, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-cleavage+of+human+CLCA1+protein+by+a+novel+internal+metalloprotease+domain+controls+calcium-activated+chloride+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation.</a> J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).</li>
<li>Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+CLCA1+modulates+TMEM16A+to+activate+Ca-dependent+chloride+currents+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

HEK 293F cellen bieden robuuste productie van eiwitten die posttranslationele modificaties. Dit systeem maakt een snelle en schaalbare expressie van natief gevouwen eiwitten die disulfiden, glycosylering, en fosforylering die anders afwezig zou zijn het gebruik van meer routine expressie gereedschappen. Bovendien kan dit systeem worden gebruikt voor de expressie en zuivering van multi-eiwit complexen eenvoudig door co-transfectie van meerdere plasmiden. Naast TREM2, heeft dit systeem uitgebreid gebruikt voor functionele...

Inzicht eiwitstructuur op atomair niveau is de sleutel tot het blootleggen van de moleculaire basis van biologische processen en ziekten. X-ray kristallografie eiwit is het meest gebruikte / toepasbare methode voor de bepaling van macromoleculaire structuren. De belangrijkste uitdaging van deze methode is het verkrijgen van voldoende hoeveelheden correct gevouwen, zuiver eiwit. Dit wordt een probleem in het bijzonder bij het werken met uitgescheiden eiwitten van zoogdieren, welke specifieke post-translationele modificaties ondergaan. Bacterieel tot expressie gebrachte eiwitten zijn de primaire bron van de gekristalliseerde eiwitten gedeponeerd in de Protein Data Bank 1. Bacteriële expressiesystemen zijn grotendeels de voorkeur omdat zij snel, goedkoop en typisch van hoge opbrengsten aan eiwit. Echter, extracellulaire domeinen van zoogdiereiwitten expressie in bacteriën vaak niet goed gevouwen, waarbij opnieuw vouwen en uitgebreide zuiveringsstappen nodig zijn voorliet verkrijgen homogeen folded eiwit. Bovendien, veel zoogdiereiwitten vereisen posttranslationele glycosylering op correcte vouwing 2 bereiken. Hoewel expressie en glycosylering in gist of insectencellen kunnen overwinnen van de problemen vouwen, post-translationele modificaties, zoals glycosylering, verschillen aanzienlijk van die van zoogdiercellen 3, waardoor eiwitten onjuiste of niet-homogene modificaties. Zoogdierlijke cellen brengen de vereiste moleculaire machinerie te zorgen voor een juiste post- translationele modificaties en vouwen; Echter, deze expressiesystemen niet typisch voorkeur van de meeste laboratoria, vanwege de beperkte opbrengsten en hoge kosten van reagentia en hulpstoffen. Polyethyleenimine (PEI), een standaard transfectie reagens is relatief goedkoop, maar legt aanzienlijke cytotoxiciteit en lage transfectie efficiëntie, resulterend in verhoogde kosten celmedia, DNA en kweken materiaal. Veel alternatieven voor PEI zijn onbetaalbaar. We pakkendeze problemen door het beschrijven van een combinatie van verbeterde celcultuur gereedschappen en chemisch gemodificeerde PEI voor de snelle en relatief goedkope werkwijze voor de expressie van gesecreteerde zoogdiereiwitten, gevolgd door enkelvoudige stap zuivering. Deze robuuste methode geeft voldoende opbrengst van functionele en biochemische studies 4, en in sommige gevallen resulteert in eiwitten vatbaar voor kristallisatie zonder verdere zuivering. Dit protocol beschrijft verschillende technieken om expressie te optimaliseren en de opbrengst van uitgescheiden zoogdiereiwitten in humane embryonale nier (HEK) 293F cellen gekweekt in suspensie. Transfectie-efficiëntie (en kosten), eiwitproductie en zuivering zijn allemaal sterk verbeterd door het volgen van dit protocol. PEI gemodificeerd door de toevoeging van carbamaten door middel van een eenstaps ringopeningsreactie (PEI-TMC-25, synthese en eigenschappen in detail beschreven in referentie 5) verbetert transfectie-efficiëntie, vermindert de cytotoxiciteit van kationischemembraan verstoring en dienovereenkomstig vermindert experiment kosten. Bovendien worden cellevensvatbaarheid en eiwitexpressie sterk verbeterd met de toevoeging van cultuur aanvullingen op glucose en vitaminen leveren. Belangrijk voor de productie van geglycosyleerde eiwitten behandeling met kifunensine een niet-giftige chemische remmer van mannosidase I, produceert eiwitten met gedefinieerde, onrijpe glycanen die kan worden verwijderd door endoglycosidase EndoHf om eiwitten te leveren met een N-acetylglucosamine in plaats van een full-length N-gelinkte glycan 6. Tenslotte, de uitscheiding van eiwitten in een serumvrij, chemisch gedefinieerd medium maakt een snelle en gemakkelijke zuivering structurele en biochemische studies. Single-step nikkel-nitrilotriazijnzuur (Ni-NTA) hars zuivering verwijdert de meeste verontreinigende soorten in de bovenstaande vloeistof en in sommige gevallen kunnen eiwit voldoende zuiver verkregen voor kristallisatie.

<table><tbody><tr><td>Culture Flasks</td><td>GeneMate</td><td>F-5909B</td><td></td></tr><tr><td>293 Freestyle Media</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>Gebruik in plaats van Glutamine</td></tr><tr><td>Hype 5 transfection reagent</td><td>Oz Biosciences</td><td>HY01500</td><td></td></tr><tr><td>293fectin transfection reagent</td><td>Life Technologies</td><td>12347019</td><td></td></tr><tr><td>PEI transfection reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Endo Hf</td><td>NEB</td><td>P0703L</td><td></td></tr><tr><td>Amylose Resin</td><td>NEB</td><td>E8021S</td><td></td></tr><tr><td>Cell Boost R05.2</td><td>HyClone</td><td>SH30584.02</td><td>Cel Cultuur Supplement</td></tr><tr><td>GlucCell</td><td>CESCO Bioengineering</td><td>DG2032</td><td>Glucose Monitoring Systeem</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>519850.91</td><td>Serum Vrij Medium voor DNA transfectie</td></tr><tr><td>Luria Broth (LB Media)</td><td>Life Technologies</td><td>10855-001</td><td></td></tr><tr><td>GC10 Competent Cells</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2919</td><td></td></tr></tbody></table>

efficiënte zoogdiercelexpressie en single-step zuivering van extracellulaire glycoproteïnen voor kristallisatie

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

De productie van uitgescheiden zoogdier-eiwitten voor structurele en biofysische studies kan uitdagend, tijdrovend en kostbaar zijn. Hier wordt een tijd- en kostenefficiënt protocol beschreven voor de expressie van uitgescheiden eiwitten in zoogdiercellen en een stap zuivering met behulp van nikkel-affiniteitschromatografie. Het systeem is gebaseerd op grootschalige tijdelijke transfectie van zoogdiercellen in suspensie, wat de tijd om eiwitten te produceren aanzienlijk verkort, omdat het stappen elimineert, zoals het ontwikkelen van expressievirussen of het genereren van stabiele cellijnen die eiwitten aanmaken. Dit protocol maakt gebruik van goedkope transfectiemiddelen, die eenvoudig kunnen worden gemaakt door eenvoudige chemische modificatie, of matig geprijsde transfectiemiddelen, die het rendement verhogen door een verhoogde transfectie-efficiëntie en verminderde cytotoxiciteit. Zorgvuldige bewaking en het handhaven van glucoseniveaus in het medium verhoogt het eiwitrendement. Het controleren van de rijping van native glycanen in de expressiestap verhoogt het uiteindelijke rendement van goed gevouwen en functionele zoogdier-eiwitten, wat ideale eigenschappen zijn om röntgenkristallografie na te streven. In sommige gevallen produceert een enkele zuiveringsstap eiwit van voldoende zuiverheid voor kristallisatie, wat hier als voorbeeld wordt gedemonstreerd.

Hierbij volgt de resultaten van dit expressiesysteem toegepast op een 13 kDa uitgescheiden immunoglobuline (Ig) domein van het humane eiwit triggering receptor tot expressie gebracht op myeloïde cellen 2 (hTREM2, residuen 19-132). TREM2 is een type I transmembraan eiwit dat een enkel extracellulair Ig-domein dat twee disulfidebindingen en twee N-gebonden glycosyleringsplaatsen heeft. In tegenstelling tot veel andere Ig-domein eiwitten 8, TREM2 was niet ontvankelijk voor hervouwing uit bacteriële inclusielicha...

Dit is een snel, kosteneffectief protocol voor de productie van uitgescheiden, geglycoseerde zoogdier-eiwitten en daaropvolgende eenstapszuivering met voldoende opbrengsten van homogeen eiwit voor röntgenkristallografie en andere biofysische studies.

Efficiënte zoogdiercelexpressie en Single-step Zuivering van extracellulaire Glycoproteïnen voor kristallisatie

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

Het algemene doel van deze techniek voor eiwitexpressie in zoogdieren is het produceren van milligramhoeveelheden natuurlijk gevouwen eiwitten die geschikt zijn voor structurele, biofysische en functionele studies. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een snel en eenvoudig protocol is voor het verkrijgen van gesecreteerde eiwitten uit zoogdieren in een zuiverheid en concentratie die vereist zijn voor structurele studies. Over het algemeen stellen we vast dat de meeste problemen met de eiwitopbrengst te wijten zijn aan de gezondheid en levensvatbaarheid van de cellen.Door de cellevensvatbaarheid nauwgezet in de gaten te houden en daarnaast de suikerspiegels in het medium te monitoren, verbetert u zowel de eiwitopbrengst aanzienlijk als de bruikbaarheid van de cellen. Het is daarnaast zeer belangrijk om de celdichtheid te bewaken. Wij hebben vastgesteld dat wanneer de cellen op enig moment vóór transfectie een dichtheid van 2 miljoen cellen per milliliter overschrijden, de eiwitopbrengst sterk afneemt. Om grootschalige kweek van 2 93 F-cellen uit te voeren, vult u één liter 2 93 F-medium aan met 10 milliliter 100 x glutamine en vijf milliliter 100 x pen strep.Het antibioticum heeft in serumvrije condities een voldoende sterkte en de verlaagde antibioticaconcentratie verbetert de celviabiliteit tijdens transfectie, wat de eiwitopbrengst van de cultuur verbetert. De 293 F-cellen worden gekweekt in 300 milliliter medium in polycarbonaat gebaffelde erlenmeyers van één liter met geventileerde doppen bij 37 °C met 8% koolstofdioxide, onder schudden in een standaard weefselkweekincubator één dag vóór transfectie. Verdun de cellen op de dag van transfectie tot een dichtheid van 0,5 miljoen cellen per milliliter. Vul het kweekmedium aan door 10% volume van 2% gewicht per volume cell boost in 293 F-medium toe te voegen.Voeg kafu toe zoals te zien in deze stap om de glycosylering van eiwitten te controleren. Bereid de DNA- en transfectiereagensoplossingen voor in serumvrij medium en laat deze vijf minuten incuberen. Voeg vervolgens het transfectiereagens in stappen van één milliliter toe aan de DNA-oplossing onder mengend.Incubeer voorzichtig gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur zodat de reagent-DNA-complexen zich kunnen vormen. Voeg de oplossing vervolgens druppelsgewijs toe aan de cellen; laat de getransfecteerde cellen 72 tot 96 uur de tijd om het eiwit tot expressie te brengen om het glycoproteïne te zuiveren. Giet eerst de kweek over in een centrifugebuis en centrifugeer 20 minuten bij 1300 Gs om de cellen te pelletteren. Verzamel het supernatant en centrifugeer indien nodig een tweede keer of gebruik een 0,22 micron filter om het supernatant te klaren.Voeg vervolgens 10% volume van 10 x nikkel nitro load, tri azijnzuur of nikkel NTA-bindingsbuffer toe. Bereid daarna een gravitatiekolom voor bij vier graden Celsius door twee milliliter van het nikkel NTA-slurry aan een kolom toe te voegen en deze te equilibreren met 10 kolomvolumes van één x bindingsbuffer bij vier graden Celsius. Laat het supernatant door de hars stromen om de doorloopfractie op te vangen.Nadat het supernatant is doorgegoten, wordt de kolom gewassen met 10 kolomvolumes washbuffer. Elueer vervolgens het eiwit in vijf kolomvolumes elutiebuffer. Als deglycosylering vereist is voor een eindvolume van 0,5 milliliters, concentreer EIT dan tot 0,43 milliliters met behulp van een centrifugatieconcentrator; pelleteer eventuele resten door centrifugatie bij 16.000 GS en vier graden Celsius.Voeg vervolgens 50 µL 500 mM natriumcitraat, pH 5.5 en 20 µL endo HF toe. Incubeer het mengsel twee uur bij kamertemperatuur om de endo HF te verwijderen. Was de amylosehars vervolgens drie keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing. Incubeer het eiwit gedurende één uur bij 4 °C met de gewassen hars.Centrifuge na incubatie vijf minuten bij 1000 Gs om de hars te pelletteren en verzamel het supernatant. Concentreer het eiwit met een passende molecular weight cutoff, centrifugatiefilter en bufferuitwisseling naar de getoonde opslagbuffer. Hier zijn representatieve SDS-PAGE resultaten voor een gesecretteerd eiwit dat is tot expressie gebracht in cine-behandelde cellen na nikkel-affiniteitschromatografie.De eerste baan bevat het eiwit vóór deglycosylering en de tweede baan het eiwit na deglycosylering door endo hf. Het geglycosyleerde eiwit migreert ongeveer 10 kilodalton hoger en convergeert vervolgens naar één enkele band die consistent is met het voorspelde molecuulgewicht na deglycosylering, volgend op de enkele zuiveringsstap. Kristalschermen werden opgezet met de hanging-drop methode.De bovenste afbeelding toont de initiële kristalhit en de onderste afbeelding toont geoptimaliseerde kristallisatiecondities. Dit demonstreert dat de biochemische homogeniteit van het eiwit van belang kan zijn als bepalende factor voor het succes van de kristallisatie, en dat een geoptimaliseerd mammaliaan expressiesysteem eiwitten produceert die geschikt zijn voor deze kristallisatie. Verdere zuivering van nikkelgezuiverd eiwit kan eenvoudig worden uitgevoerd via grootte-uitsluitingschromatografie.Dit is ook een nuttige stap bij het evalueren van de eiwitproductie en het optimaliseren van de condities om correct gevouwen eiwitten te verkrijgen. Het eiwit van belang moet de belangrijkste component zijn in de chromatografische elutie, en het elutievolume moet overeenkomen met het molecuulgewicht van het eiwit. Eerdere EEU-tijden kunnen wijzen op aggregatie of misvouwen van het eiwit zodra dit beheerst is.Deze techniek kan in vier dagen worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om steriele omstandigheden voor de celkweek te handhaven. Andere methoden, zoals grootte-uitsluitingschromatografie, multi-angle light scattering en differentiële scanning-fluorometrie, kunnen worden uitgevoerd om de oligomerisatiegraad en de thermische stabiliteit van het eiwit te beoordelen.

efficient-mammalian-cell-expression-single-step-purification

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In de post-humane genomics-tijdperk, de beschikbaarheid van recombinante eiwitten in de moedertaal van conformaties is cruciaal voor structurele, functionele en therapeutisch onderzoek en ontwikkeling. Hier beschrijven we een test-en grootschalige eiwitexpressie systeem humane embryonale nier 293T cellen die kunnen worden gebruikt om een ​​verscheidenheid van recombinante eiwitten.

Een handig en algemene uitdrukking platform voor de productie van de uitgescheiden eiwitten uit menselijke cellen

Eiwitcomplexen katalyseren belangrijke cellulaire functies. Gedetailleerde functionele en structurele karakterisering van vele essentiële complexen vereist recombinante productie. MultiBac is een baculovirus / insectencelsysteem vooral afgestemd voor het uitdrukken van eukaryote eiwitten en hun complexen. MultiBac werd geïmplementeerd als een open-access platform en standaard operationele procedures ontwikkeld om het nut te maximaliseren.

De MultiBac Protein Complex Production Platform in het EMBL

De expressie van recombinante eiwitten door zoogdiersystemen wordt een aantrekkelijke methode voor het produceren van eiwitcomplexen voor structurele biologie. Hier presenteren we een eenvoudig maar zeer efficiënt expressiesysteem dat gebruik maakt van in suspensie gekweekte zoogdiercellen om eiwitcomplexen te zuiveren voor structurele studies.

Recombinante eiwitexpressie voor Structurele Biologie in HEK 293F Suspension cellen: een nieuwe en toegankelijke aanpak

Zinkvinger domeinen zijn intrinsiek cel permeabel en geschikt mediëren eiwit plaatsing in een breed scala aan zoogdier celtypen. Hier wordt een uitvoerige stap-voor-stap-protocol voor de uitvoering van zink-vinger-technologie voor intracellulaire eiwit levering gepresenteerd.

Direct Eiwit Levering aan zoogdiercellen behulp van Cell-permeabel Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Zijn<sub&gt; 2</sub&gt; Zinkvinger Domeinen

We beschrijven hier een kosteneffectief granzyme-expressiesysteem met behulp van HEK293T-cellen dat hoge opbrengsten produceert van zuivere, volledig geglycoseerde en enzymatisch actieve protease.

Een hoge opbrengst en kosten-efficiënte Expression System van Human granzymen in zoogdiercellen

De productie op laboratoriumschaal van eukaryote eiwitten met passende post-translationele modificatie vormt een belangrijke barrière. Hier is een robuust protocol met snelle implementatie en doorlooptijd voor eiwitexpressie met behulp van een zoogdier-expressiesysteem. Dit systeem ondersteunt selectieve aminozuren, selectieve markering van eiwitten en kleine moleculaire modulatoren van glyconsamenstelling.

High Yield Expressie van recombinante humane eiwitten met de Transient Transfectie van HEK293 cellen in suspensie

Benaderingen voor de biofysische en structurele karakterisatie van glycoproteïnen presenteren wij met de immunoglobuline vouw door biolayer interferometrie, isothermische titratie calorimetrie en röntgendiffractie.

Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

De zuivering van ionenkanalen is vaak uitdagend, maar eenmaal bereikt, kan het potentieel toestaan in vitro onderzoeken van de functies en structuren van de kanalen. Hier beschrijven we de stapsgewijze procedures voor de expressie en de zuivering van eiwitten van zoogdieren bestrophin, een familie van Ca2 +-geactiveerd Cl- -kanalen.

Meningsuiting en zuivering van zoogdier Bestrophin ionenkanalen

Dit protocol beschrijft technieken gebruikt om te bepalen van ion kanaal structuren door cryo-elektronenmicroscopie, met inbegrip van een systeem van de baculovirus gebruikt om genen in zoogdiercellen met minimale inspanning en toxiciteit, eiwit winning, zuivering, efficiënt en kwaliteit controleren, Raster monstervoorbereiding en screening, evenals gegevensverzameling en verwerking.

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

Dit protocol beschrijft een opstelling voor de kristallisatie van de steroltransporter ABCG5/G8. ABCG5/G8 wordt gereconstitueerd tot bicelles voor kristallisatie met hangende druppels. Het protocol vereist geen gespecialiseerde materialen of substraten, waardoor het toegankelijk en gemakkelijk aan te passen is in elk laboratorium voor het bepalen van de eiwitstructuur door middel van röntgenkristallografie.

ABCG5/G8-kristallisatie in een lipidenbicelle-omgeving voor röntgenkristallografie

Structurele en biochemische studies van menselijke membraantransporters vereisen milligramhoeveelheden stabiel, intact en homogeen eiwit. Hier beschrijven we schaalbare methoden om transporteurs van menselijke opgeloste stoffen te screenen, tot expressie te brengen en te zuiveren met behulp van codon-geoptimaliseerde genen.

High-Throughput expressie en zuivering van menselijke opgeloste stoffen voor structurele en biochemische studies

Leer een efficiënte methode voor zoogdiercelexpressie en zuivering van glycoproteïnen met 293F-cellen. Dit protocol levert milligramhoeveelheden eiwitten geschikt voor kristallisatie en structurele studies.

Efficiënte zoogdiercelexpressie en Single-step Zuivering van extracellulaire Glycoproteïnen voor kristallisatie

Meer video's verkennen