Engineering en karakterisering van een optogenetisch model van de menselijke neuromusculaire junctie

Dit protocol beschrijft hoe functionele 3D in vitro menselijke neuromusculaire juncties kunnen worden ontworpen die kunnen worden gebruikt om neuromusculaire pathologieën te onderzoeken en potentiële therapeutica te testen. Deze techniek maakt gebruik van gelijktijdige optogenetische stimulatie en videoverwerking. Het is gekwantificeerd veranderingen in neuromusculaire junctiefunctie tijdens de ontwikkeling en als gevolg van externe factoren, zoals neurotoxinen en serum van myasthenia gravis-patiënten.

De stappen waarbij de spiercel en motorneuronen in de bioreactor worden gezaaid, kunnen in het begin een uitdaging zijn. Door het collageengelmengsel op ijs te houden, kan de beschikbare tijd om alle cellen te zaaien worden verlengd voordat de gel stolt. Begin met het mengen van een 10-op-1 basis tot uithardingsmiddelmengsel van polydimethylsiloxaan of PDMS en plaats het mengsel in een vacuümkamer.

Sluit alle kleppen en zet het vacuüm aan om het mengsel gedurende ten minste 30 minuten te ontgassen totdat er geen luchtbellen achterblijven. Giet het mengsel in mallen en ontgas de mallen gedurende 1 uur in de vacuümkamer en sluit vervolgens de mallen met de bovenste helft van de mal in de juiste richting. Plaats een zeshoekige stalen staaf over het midden en klem aan beide zijden.

Vul vervolgens de bovenkant opnieuw met PDMS en hard de mallen minstens 4 uur uit in een oven van 65 graden Celsius. Nadat de mallen zijn afgekoeld tot kamertemperatuur, verwijdert u de platforms van de mallen. Ondertussen glijdt de glazen afdekking gedurende 30 minuten in 1% niet-ionische oppervlakteactieve polyol, zodat de afdekslips niet stapelen en allemaal goed zijn gecoat, spoel ze vervolgens goed af met gedestilleerd water en droog ze een nacht op 65 graden Celsius.

Behandel de glazen afdeksel en het PDMS-platform met een plasmareiniger op hoog met 6 liter zuurstof per minuut gedurende 1 tot 2 minuten. Na behandeling verlijmt u de twee met elkaar door het PDMS minstens 30 seconden op de afdekslip te drukken. Bereid een 4-op-1 mix van 3 milligram per milliliter collageen 1 en opgeloste keldermembraanmatrix en resuspendeer vervolgens de myoblasten in dit vers bereide collageenmengsel.

Voeg vervolgens 15 microliter van deze celcollageensuspensie toe aan elke spierkamer van de bioreactor en zorg ervoor dat de suspensie over beide pilaren wordt verspreid met behulp van de pipetpunt. Laat het celgelmengsel gedurende 30 minuten polymeriseren bij 37 graden Celsius en vul vervolgens elke bioreactor goed met 450 microliter myotone groeimedia. Breng op dag 11 van motoneurondifferentiatie de cellen en media over naar een buis van 50 milliliter en laat de neurosferen gedurende 5 minuten naar de bodem zakken.

Aspirateer het supernatant en resuspendeer de cellen in 15 milliliter motoneuron suspensie cultuurmedium aangevuld met 20 nanogram per milliliter van de hersenen afgeleide neurotrofe factor en 10 nanogram per milliliter van gliacel afgeleide neurotrofe factor. Op dag 14 van de differentiatieprotocollen zaai je de motoneurons in het platform. Bereid een 4-op-1 gelmengsel van 2 milligram per milliliter collageen 1 en opgeloste keldermembraanmatrix.

Gebruik een celzeef van 400 nanometer om grote neurosferen te selecteren en deze in het bereide gelmengsel te resuspeneren. Zuig voorzichtig media uit het reservoir en de neurosfeer goed op en voeg vervolgens 15 microliter van het gelmengsel toe aan het neurosfeerkanaal. Laad een pipet van 10 microliter met 10 microliter gel en kies één neurosfeer.

Deponeer de neurosfeer in het neurosfeerkanaal, zorg ervoor dat deze zich in de kamer bevindt en til vervolgens langzaam de pipet op terwijl de resterende gel wordt vrijgegeven zodra de neurosfeer is afgezet. Laat de gel gedurende 30 minuten polymeriseren bij 37 graden Celsius en voeg vervolgens 450 microliter NbActiv4 aangevuld met 20 nanogram per milliliter van de hersenen afgeleide neurotrofe factor en 10 nanogram per milliliter van gliacel afgeleide neurotrofe factor toe aan de reservoirs. Gebruik voor beeldvorming een omgekeerde fluorescerende microscoop met een wetenschappelijke complementaire metaaloxide halfgeleidercamerasoftware.

Stel de Binning in op 2-bij-2, Belichting op 20 milliseconden, Rolling shutter aan, Uitleessnelheid op 540 megahertz, dynamisch bereik op 12-bits en Gain 1 en Sensormodus op Overlap. Gebruik een 2x objectief op de microscoop om de microtissues in beeld te brengen en bevestig een levende celkamer aan het microscoopstadium. Selecteer het interessegebied dat de geïnnerveerde skeletweefsels bevat om de bestandsgrootte en verwerkingstijd te minimaliseren en plaats vervolgens een 594 nanometer long-pass emissiefilter tussen het monster en het beelddoel om blauwe lichtpulsen uit de camera te filteren.

Plaats vervolgens een rechthoekige 4-well plaat met vier bioreactoren in de live-celkamer, klik vervolgens op live view en center en focus het beeld met de gewenste ROI. Download de aangepaste macrocode uit de GitHub-map om de podiumpositie, het Arduino-bord en de video-acquisitie te regelen en stel vervolgens de uitvoerfilm in als dagonderstreping weefselgroeponderstreep weefselnaam onderstreping experiment dot ND2. Voer de macrocode uit met de gewenste X- en Y-coördinaten in het werkgebied en verkrijg een snelle time-lapse met 1700 frames bij 50 frames per seconde.

Vervang na de beeldvorming de media en breng de monsters terug naar de incubator. Laat ten minste 24 uur tussen beeldacquisitiesessies om weefselvermoeidheid te voorkomen. Download voor filmverwerking de bestanden uit de GitHub-map en gebruik de aangepaste MATLAB-code om de video's in batchanalyse te verwerken.

Open recursief OS-analysescript om alle verkregen video's in dezelfde map te hebben. Pas de pre-analyseparameters aan en voer het recursiveOSAnalysis-script uit om de films te analyseren via parallelle verwerking. Pas de parameters na de analyse aan, zoals basislijntijd, piekdrempel, min-min prominentie en min-min breedte indien nodig.

Genereer ten slotte video- en grafiekuitvoer door recursiveOSMovie uit te voeren om een videobestand te genereren voor elk weefsel met zijn respectieve contractiliteitstracering. Dit protocol werd getest met behulp van twee systemen met verschillende schalen, een microfluïdisch apparaat dat 1 millimeter lang skeletspierweefsels oplevert met ongeveer 20.000 myoblasten en het open-well bioreactorsysteem dat resulteert in 4 millimeter lange spierweefsels bestaande uit ongeveer 450 myoblasten. Een optische opstelling werd gebouwd om gecontroleerde stimulatie van motoneuronen met blauw licht mogelijk te maken en de NMJ-functie werd verhoogd met behulp van een aangepast microscoopmacroscript in combinatie met een aangepaste Arduino-code.

Deze code bevat instelbare parameters en bepaalt of een contractie wordt geactiveerd op basis van de tijd tussen een lichtpuls en het begin van de contractiliteitspiek. Het systeem registreerde verbetering van de NMJ-functie in weefsels met een toename van getriggerde reacties een week na weefselfabricage, gevolgd door een stabiele functie gedurende een extra week. Alfa-bungarotoxine stopte alle geactiveerde en spontane contracties, wat resulteerde in een volledige verstoring van de NMJ-functie, wat aantoont dat lichtstimulatie van de weefsels een functionele NMJ vereist.

Analyse van de weefsels behandeld met 20% myasthenia gravis serum gedurende 48 uur toonde een verminderde functie in vergelijking met controleweefsels behandeld met serum van gezonde donoren. 48 uur na het verwijderen en uitwassen van het serum vertoonden de gemanipuleerde NMJ's herstel van de functie. Zorg ervoor dat alle bioreactoren gedurende dezelfde tijd in de oven staan om stijfheidsvariabiliteit tussen batches te voorkomen.

Zorg er ook voor dat u het zaaien van motorneuronen verifieert met behulp van de microscoop. Na deze procedure kunnen metabalomics, proteomics en CRISPR-screening worden uitgevoerd om aanvullende informatie te verzamelen en de mechanistische veranderingen veroorzaakt door ziek serum beter te begrijpen.