Visualisatie van de morfologische kenmerken van neuromusculaire overgang in rat mediale gastrocnemiusspier

Dit protocol kan worden gebruikt om de integriteit en plasticiteit van een neuromusculaire overgang onder normale en pathologische omstandigheden te evalueren. Deze techniek is om tegelijkertijd de Schwann-cellen en pre- en postlaboratoria op afzonderlijke spiersecties te labelen. Nadat u de volwassen mannelijke rat hebt geëuthanaseerd, plaatst u de rat in de kap en opent u de thoracale holte om toegang te krijgen tot het hart met behulp van een schaar en een tang.

Breng een intraveneuze katheter in van de linker hartkamer naar de aorta en snijd het rechter orakel. Start vervolgens de perfusie met 100 milliliter van 0,9% normale zoutoplossing totdat het bloed dat uit het rechter orakel komt helder is. Blijf vervolgens perfuseren met 250 tot 300 milliliter 4% paraformaldehyde in 0,1 molaire fosfaatbuffer of PB pH 7,4 gedurende 10 minuten.

Verwijder na perfusie de huid van de bilaterale achterpoot met behulp van een chirurgisch mes en stel de bilaterale heupzenuw en mediale gastrocnemiusspier bloot. Ontleed de bilaterale mediale gastrocnemiusspier voorzichtig uit de achterste ledemaat met behulp van een mes en postfixeer de hele spier in 10 milliliter van 4% paraformaldehyde. Verwijder na twee uur de spier uit de oplossing en cryoprotectieer deze in 10 milliliter van 25% sucrose in 0,1 molaire PB gedurende één dag bij vier graden Celsius.

Zodra het spierweefsel is ondergedompeld in de sucrose-oplossing, fixeert u het op een vriesstadium van een glijdend microtoomsysteem met behulp van een bevroren sectiemedium. Snijd de spier horizontaal langs de lange as van de spier met een dikte van 80 micron. Plaats met een borstel zeven cryosecties per put op een ordelijke manier in een kweekplaat met zes putten met 10 milliliter van 0,1 kies PB. Voor fluorescerende kleuring incubeer je vier secties per put met 1,5 milliliter 0,1 molair PB met 75 microliter van 10% Triton X 100 en 45 microliter normaal ezelserum op een orbitale shaker bij 20 rpm.

Breng na 30 minuten de secties over in 1,5 milliliter van een gemengde oplossing van primaire antilichamen met konijnenanti-neurofilament 200, geiten-anti-vesiculaire acetylcholinetransporter in 0,1 molair PB, in 1% normaal ezelserum en 0,5% Triton X 100 en incubeer 's nachts bij vier graden Celsius. Was de volgende dag de secties drie keer gedurende vijf minuten elk in 0,1 kies PB op in orbitale shaker bij 20 tpm. Incubeer na de laatste wasbeurt de sectie in een gemengde oplossing van secundaire antilichamen die ezel anti-konijn AF 488 en ezel anti-geit AF 546 bevatten, evenals de biomarkers van alfa bungaro toxine AF 647 en falloidine 350 bevattende in 0,1 M PB met 1% normaal ezelsserum en 0,5 Triton x 100 gedurende een uur, Ze beschermen tegen licht.

Was na incubatie de secties in PB en monteer ze op een microscoopglaasje. Breng afdekglas aan op de sectie met 50% glycerine in gedestilleerd water. Observeer en beeld het monster af met behulp van een con focal imaging-systeem uitgerust met een 20 x subjectieve lens met een numeriek diafragma van 0,75 en een 40 x lens met een numeriek diafragma van 0,95.

Voor meervoudig fluorescerende beeldvorming stelt u de excitatie- en emissiegolflengten van elke biomarker in zoals beschreven in het tekstmanuscript. Stel de resolutie van het vastleggen van afbeeldingen in op 640 bij 640 pixels. Stel vervolgens het begin- en eindfocusvlak in.

Stel de stapgrootte in op één of twee micron. Kies vervolgens dieptepatroon, beeldopname en Z-serie. Voor de afbeeldingen met een lagere vergroting bij 20 X legt u 40 Z-stackafbeeldingen vast in stappen van twee micron met behulp van een gaatje van 105 micron.

Kies de projectie- of topografiemodus en intensiteitsprojectie over de Z-as om alle afbeeldingen in één scherpstel te integreren. Voor de hogere vergrotingsafbeeldingen bij 40 X legt u 80 Z stack-afbeeldingen vast in één micron stapgrootte met zoom ingesteld op twee en een gaatje van 105 micron. Integreer alle afbeeldingen in één scherpstel.

Reconstrueer de beelden in het driedimensionale patroon met het beeldverwerkingssysteem. De representatieve ruimtelijke correlatie van de mediale gastrocnemiusspier met neurofilament 200 positieve zenuwvezels, vesiculaire acetylcholine transporter positieve pre-synaptische terminal, alfa bungaro toxine positieve post-synaptische acetylcholine receptoren, S100 positieve perisynaptische Schwann cellen, falloidine positieve spiervezels en DAPI gelabelde cellulaire kernen worden hier gedemonstreerd. Het neurofilament 200 positieve zenuwvezels liep in bundel.

Deze zenuwvezels gaven takken aan de vesiculaire acetylcholine transporter positieve presynaptische terminals, die een spiegelrelatie vormden met de alfa bungaro toxine positieve post-synaptische acetylcholine receptoren. Bovendien werden de S100-positieve perisynaptische Schwann-cellen gedetecteerd rond het neurofilament 200 positieve zenuwvezels dicht bij de pre-synaptische terminals. De ruimtelijke correlatie werd verder tentoongesteld in een driedimensionaal patroon dat de gedetailleerde morfologische kenmerken van de neuromusculaire junctie vanuit verschillende perspectieven weergeeft.

Om meer beeldvorming in spiersecties te observeren, is het van cruciaal belang om de spier horizontaal langs de lange as te snijden met een dikte van 80 micron.