Detectie en kwantificering van tunnelende nanobuizen met behulp van 3D-volumeweergaveafbeeldingen

Het ontbreken van tunnelende nanobuisjes specifieke markers beperkt de vooruitgang in het veld en er is een toenemende vraag naar een methode om tunnelende nanobuizen te identificeren, karakteriseren en kwantificeren. Automatische detectiemethoden zijn moeilijk te implementeren zonder de expertise om een algoritme te ontwikkelen en/of het bestaande algoritme te wijzigen, maar onze handmatige methode is eenvoudig met meer precisie te implementeren. Intercellulaire overdracht over lange afstand via tunnelende nanobuisjes wordt op verschillende manieren geïmplementeerd in verschillende ziektemodellen, waaronder neurodegeneratieve pathologie, virale verspreiding en kanker.

Studies over het tunnelen van nanobuisjes om hun rol in pathogenese te begrijpen, zijn dus belangrijk. Het is mogelijk dat de tunnelende nanobuisjes breken tijdens het kleuringsproces. Vermijd het gebruik van afdekslips en montage op de dia's, gebruik in plaats daarvan beeldschalen met een glazen bodem.

Aangepast fixatieprotocol helpt om tunnelende nanobuisjes intact te houden. De procedure wordt gedemonstreerd door Deepak KV, een promovendus van het laboratorium van Sangeeta NAF. Om te beginnen, was de controle en oligomere A-bèta behandelde cellen tweemaal met PBS gedurende twee minuten vóór fixatie.

Bereid Karnovsky's fixatieve oplossing met behulp van 2% formaline fixatief en 2,5% glutaaraldehyde opgelost in 0,1 molaire fosfaatbuffer van pH 7,2. Bevestig vervolgens de cellen in de beeldvormingsschaal door de fixatieve oplossing van Karnovsky gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur toe te voegen. Bereid de incubatiebuffer voor door 0,1 gram saponine op te lossen in vijf milliliter FBS en verdund door toevoeging van 95 milliliter PBS.

Was vervolgens de vaste cellen twee keer met behulp van incubatiebuffer gedurende twee minuten. Voeg na fixatie het eerste antilichaam tegen fosfo-PAK1 toe, voeg een verdunning van één tot 250 toe aan de incubatiebuffer en incubeer een nacht bij vier graden Celsius in een donkere, vochtige kamer. Was de volgende dag na 24 uur incubatie de cellen twee keer met de incubatiebuffer gedurende twee minuten.

Voeg vervolgens secundair antilichaam geconjugeerd toe aan Alexa Fluor 488 en Phalloidin 555. Incubeer de cellen in de donkere, vochtige kamer gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur. Was de cellen na de incubatie twee keer met incubatiebuffer gedurende twee minuten.

Kleur de kern door DAPI toe te voegen in een verdunning van één tot 2000 en incubeer gedurende vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Bereid DABCO-montagemedium met 25 milligram DABCO in 90% glycerol en 10% PBS. Om goed op te lossen, stelt u de pH in op 8,6 met behulp van spectrofotometrisch verdund zoutzuur en houdt u de oplossing op een rocker om te mengen.

Voeg als antibleekmiddel het DABCO-montagemedium rechtstreeks toe aan de beeldvormende schotel met de afdekslip aan de onderkant. Wacht minstens één tot twee uur en ga direct verder met het uitvoeren van confocale beeldvorming. Om tunnelende nanobuisjes te identificeren, legt u Z-stack-afbeeldingen van immunogekleurde cellen vast met behulp van een confocale laserscanmicroscoop door eerst de kanalen te selecteren en de vereiste lasers sequentieel in de vensters te klikken, track één, track twee en track drie in de confocale software.

Klik op de optie TPMT onder het track één venster om de differentiële interferentiecontrastbeelden met fluorescentiekanalen te maken. Selecteer het tabblad Acquisitie van de software, klik op het tabblad Z-stack en wacht tot er een venster wordt geopend. Klik vervolgens op Live scan om de cellen onder aan het gerecht scherp te stellen.

Selecteer die gefocuste afbeelding als de eerste stapel en stel vervolgens scherp om het bovenste deel van de cel weer te geven en selecteer dat als de laatste stapel. Stop live scannen en klik op het getal naast het tabblad Optimaal om de stapgrootte van de stapels vast te stellen, die het aantal segmenten en de intervallen bepaalt op basis van de dikte van de cellen. Maak sequentiële beelden van drie kanalen van DAPI, FITC en TRITC met 405 nanometer, 488 nanometer en 561 nanometer lasers en leg vast met een pixel dwell tijd van 1,02 microseconde.

Leg beelden vast in het DIC-kanaal met fluorescentiekanalen om de celgrens te observeren. Open de confocale afbeeldingen die zijn opgeslagen in czi-gegevensformaat in Fiji-software voor analyse. Selecteer de Hyperstack optie om elke Z-stack en kanaal van de image te zien.

Blader door het kanaal en de Z-stack schuifbalken om de exacte stapel van een bepaald interessant kanaal te selecteren. Selecteer vervolgens eerst het F-actin-gekleurde kanaal door door de kanaalbalk te scrollen en handmatig door de Z-stacks te scrollen om elke stapel één voor één te zien. Identificeer de F-actine gekleurde structuren die cellen lijken te verbinden die zichtbaar zijn in de onderste delen van de Z-stacks en zich dicht bij het oppervlak van de beeldvormingsschaal bevinden met Z gelijk aan twee als neurieten.

Identificeer de tunnelende nanobuisjes, de F-actine positieve zwevende cel naar celkanalen door de Z-stapels naar boven te scrollen van Z is gelijk aan vier. Zoek naar neurieten in de buurt van de onderste delen van de Z-stapels naar het oppervlak en merk op dat ze beginnen te verdwijnen met het scrollen van Z-stapels naar boven bij Z gelijk aan zes. Identificeer fosfo-PAK1 positieve tunneling nanobuisjes op dezelfde manier als F-actine positieve tunneling nanobuisjes door de zwevende aard van de leidingen van de Z-stacks te analyseren.

Omdat fosfo-PAK1-kleuring zwakker is dan F-actinekleuring, zoekt u naar fosfo-PAK1-gekleurde tunneling nanobuisjes bij Z gelijk aan vier en bij Z gelijk aan zes. Observeer verder de DIC-afbeeldingen om te verifiëren dat de F-actine en fosfo-PAK1-gekleurde tunnelvormige nanobuisstructuren membraankanalen tussen cellen zijn. Voeg bovendien F-actine- en fosfo-PAK1-kanalen samen om te controleren of de geïdentificeerde tunnelende nanobuisjes F-actine en fosfo-PAK1 co-gekleurde structuren zijn.

Om de tunnelende nanobuisjes te kwantificeren, telt u de totale celaantallen en de geïdentificeerde tunnelnanobuisjes handmatig en geeft u de getallen weer als percentages. Om F-actine en bèta III tubuline positieve tunneling nanobuisjes zoals zwevende buizen van Z-stack afbeeldingen te onderscheiden, voegt u F-actine en beta III tubulinekanalen samen en analyseert u vervolgens de Z-stacks van de samengevoegde afbeeldingen. Zoek naar uitsluitend F-actine gekleurde tunnelvormige nanobuisjes die vaag zichtbaar zijn bij Z gelijk aan drie en prominent bij Z gelijk aan zes en Z gelijk aan negen.

Identificeer op dezelfde manier F-actine en bèta III-tubuline. dubbel-positieve tunnelende nanobuisjes zoals zwevende leidingen op Z gelijk aan zes en Z gelijk aan negen. Identificeer andere F-actine en beta III tubuline gekleurde niet-zwevende uitsteeksels van de onderste delen van de Z-stacks.

Meet de diameter van de tunnelende nanobuisjes met behulp van de Line-tool in Fiji. Controleer de meetschaal door op Analyseren te klikken en stel vervolgens schaal in zodat de afstand in pixels automatisch wordt ingesteld op basis van de czi-afbeeldingen. Meet de diameters van de tunnelende nanobuisjes op het XY-vlak.

Met behulp van de Volume Viewer-plug-in in Fiji, die 3D-re-slicing en drempelgestuurde 3D-visualisatie mogelijk maakt, splitst u de Z-stack-afbeeldingen in afzonderlijke kanalen. Snijd vervolgens de Z-stack-afbeeldingen met één kanaal bij om de 3D-reconstructieweergave te gebruiken om een of twee tunnelende nanobuisjes of neurieten tegelijk te markeren. Pin een enkele tunneling nanobuisjes of neuriet in het XY-vlak en markeer XZ- en YZ-toegangsdoorsneden.

Observeer de neurieten aan de onderkant van het XZ-vlak, in de XZ- en YZ-vlakken, en de tunnelende nanobuisjes in de bovenste Z-stacks. Selecteer de afzonderlijke tunneling nanobuisjes of neuriet om de 3D-volumeweergave in het XZ-vlak te reconstrueren. Observeer in de 3D-reconstructie de neurieten aan de onderkant van het Z-vlak en de tunnelende nanobuisjes die verschijnen als zwevende structuren die twee cellen verbinden zonder het onderste Z-vlak aan te raken.

Confocale Z-stack beelden van immunogekleurde cellen met F-actine en fosfo-PAK1 werden geanalyseerd om tunnelende nanobuisjes te identificeren. Verder werden DIC-beelden geanalyseerd om te verifiëren dat de F-actine en fosfo-PAK1 gekleurde tunnelvormige nanobuisjesstructuren membraankanalen tussen cellen waren. De cellen waren dubbel immunostained met F-actine en beta III tubuline en de tunneling nanobuisachtige F-actine en de tunneling nanobuisachtige F-actine en beta III tubuline dubbele positieve membraankanalen werden onderscheiden van alleen F-actine positieve tunneling nanobuisjes.

De tunnelende nanobuisjes die samen tot expressie komen met fosfo-PAK1 en F-actine werden onderscheiden van de celuitsteeksels van andere neurieten door 3D-volumeweergavebeelden te construeren op basis van hun kenmerk van zweven tussen twee cellen zonder het substraat aan te raken. Het gebruik van het juiste fixatiemiddel is belangrijk omdat onvolmaakte fixatie van het monster kan leiden tot snelle proteolytische afbraak van de doeleiwitten en een vermindering van de specifieke immunoreactiviteit.