Driedimensionale beeldvorming en analyse van Mitochondria binnen menselijke Intraepidermal zenuwvezels

Het algemene doel van deze beeldvormings- en analysetechniek is om specifieke informatie te isoleren uit een complex signaal. Specifiek beschrijft dit protocol hoe nerve-specifieke mitochondriën met andere mitochondriën binnen de epidermis kunnen worden gevisualiseerd en gekwantificeerd. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van de neurologie te beantwoorden, zoals hoe mitochondriën binnen intra-epidermale zenuwvezels van gezonde individuen vergelijken met nerve-specifieke mitochondriën van patiënten met neurologische complicaties.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we een complex signaal nemen en specifieke informatie eruit extraheren. Dit protocol helpt ons om een specifiek signaal zoals het signaal in deze rietjes te isoleren van de signalen eromheen. Bereid fluoresceine immunohistochemische kleuring van huidbiopsieën voor door eerst een 96-wellplaat te labelen volgens dit schema.

Pipet vervolgens 150 microliters van de stock signaalversterkeroplossing om niet-specifieke binding van secundaire antilichamen te verminderen in elke put van de bovenste rij. Bereid spoelputten voor door 150 microliters 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing toe te voegen in elke put in rij twee en drie van de 96-wellplaat. Voeg vervolgens 150 microliters 5% BSA-blokkeeroplossing toe aan de putten van rij vier.

Verdun de primaire antilichamen PGP9.5 en PDH in 1, 500 microliters 1% BSA-spoeloplossing en voeg 150 microliters toe aan elke put in rij vijf. Gebruik een inoculating lus om de secties over te brengen naar de signaalversterkeroplossing in rij een. Zodra de secties zich in de primaire antilichaamoplossing in rij vijf bevinden, wikkel de plaat stevig af met laboratoriumfolie om verdamping te voorkomen en schud de monsters vervolgens een uur op een platte rocker bij kamertemperatuur.

Incuber met schommelen gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Begin dag twee van de procedure door 150 microliters 1% BSA-spoeloplossing te pipetten naar de putten in rij zes, zeven en acht van de 96-wellplaat. Voeg de fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen toe aan 1, 500 microliters 1% BSA.

Pipet vervolgens 150 microliters van de secundaire antilichaamoplossing in elke put van rij negen. Spoel de secties door de putten zes, zeven en acht. Zodra de secties zich in de secundaire antilichaamoplossing in rij negen bevinden, wikkel de plaat in parafilm en bedek met aluminiumfolie om de fluorescentiesignalen te beschermen.

Incuber met schommelen zoals eerder. Op dag drie pipet 150 microliters steriele gefilterde 1x PBS in rijen 10, 11 en 12. Breng de monsters over naar rij 10 en bedek de plaat met aluminiumfolie.

Spoel gedurende een uur bij kamertemperatuur met schommelen. Bereid vervolgens een microscoopglas voor het monteren van de secties door 50 microliters gefilterde 1x PBS op de glasplaat te pipetten. Zodra de spoelingen voltooid zijn, breng een sectie van rij 12 over op de glasplaat en voeg er een tot twee druppels montagereagens met DAPI direct bovenop de sectie toe.

Leg voorzichtig een 50 millimeter bij 24 millimeter 1.5 microscoopglasdeksel op de sectie. Plaats de glasplaten in het donker gedurende de nacht bij kamertemperatuur om het montagemedium te laten uitharden voordat de glasplaten worden opgeslagen of geïmagineerd. Selecteer het 40X olie-immersie objectief op een omgekeerde laserscanning confocale microscoop.

Selecteer de juiste lasers en detectoren om de kernen, zenuwvezels en mitochondriën te beeldvormen. Voer de volgende scanparameters in in de microscoopsoftware, 12-bits intensiteitsresolutie, scanfrequentie van 500 Hertz met twee framegemiddelde en zoom van 2,2. Stel de microscoopsoftware in voor geoptimaliseerde laterale resolutie door een scanresolutie van 1024 bij 1024 te selecteren.

Optimaliseer de axiale resolutie en optisch secties door een confocale diafragma van één luchtseenheid te selecteren met een Z-stapgrootte van 210 nanometer. Scan elk signaal afzonderlijk en pas de detectorspanning en offset aan om eventuele over- en onderbetekenisde pixels te verwijderen. Activeer een live scan voor het zenuwsignaal en pas de Z-focuscontrole aan om de bovenste en onderste focale vlakken in de microscoopsoftware te vinden en in te stellen die het zenuwsignaal binnen de weefselsectie omvatten.

Scan de laatste Z-serie met sequentieel scannen om crosstalk van fluorescentiesignalen te elimineren. Isoleer de epidermis van het stratum corneum en de dermis door een regio rond de epidermis te tekenen met behulp van een selectietool op een duplicaat afbeelding van de originele afbeelding. Knip vervolgens de afbeelding bij tot de selectie.

Bereken puntspreidingsfuncties voor de groene en rode fluorescentie confocale signalen met behulp van de functie voor het berekenen van de spreidingsfunctie. Stel vervolgens de parameters in voor medium brekingsindex voor olie bij 1.515 en de numerieke apertuur voor 40X olie objectief bij 1.25. Stel de detector pinhole in op één luchtseenheid en kies een laser excitatiegolflengte.

Gebruik iteratieve restauratie ingesteld op 100% vertrouwen, iteratielimiet van 10 cycli en de groene en rode PSF's voor de deconvolutie van de groene en rode fluorescentiesignalen. Gebruik het oppervlaktegereedschap om een oppervlak rond de gedeconvolveerde zenuwsignalen te maken door het selectievakje gladde functie uit te schakelen, absolute intensiteit voor drempelwaarde, een onderste drempel van 3.000 en een bovenste drempel van 65.535. Houd de oppervlakken boven 10 voxels.

Verwijder de niet-zenuwoppervlakken door het bewerkingstabblad in zenuwoppervlak te gebruiken om enkele niet-zenuwoppervlakken te selecteren of houd de Control-toets ingedrukt om meerdere niet-zenuwoppervlakken te selecteren. Verwijder de geselecteerde niet-zenuwoppervlakken door op de Verwijder-knop te drukken. Gebruik het bewerkingstabblad in zenuwoppervlak en druk op de knop Alles maskeren in de maskereigenschappen.

Selecteer in het nieuwe