Driedimensionale beeldvorming en analyse van Mitochondria binnen menselijke Intraepidermal zenuwvezels

Het algemene doel van deze beeldvormings- en analysetechniek is om specifieke informatie uit een complex signaal te isoleren. Specifiek beschrijft dit protocol hoe zenuwspecifieke mitochondriën gevisualiseerd en gekwantificeerd kunnen worden ten opzichte van andere mitochondriën binnen de epidermis. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de neurologie, zoals hoe de mitochondriën binnen intra-epidermale zenuwvezels van gezonde individuen zich verhouden tot de zenuwspecifieke mitochondriën van patiënten met neurologische complicaties.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we een complex signaal nemen en daar specifieke informatie uit extraheren. Dit protocol helpt ons om een specifiek signaal, zoals het signaal in deze rietjes, te isoleren van de signalen eromheen. Bereid de fluorescentie-immunohistochemische kleuring van huidbiopten voor door eerst een 96-wells plaat te labelen volgens dit schema.

Pipetteer vervolgens 150 µL van de stockoplossing van de signaalversterker in elke well van de bovenste rij om aspecifieke binding van secundaire antilichamen te verminderen. Bereid de spoelwells voor door 150 µL 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing toe te voegen aan elke well in rij twee en drie van de 96-well plaat. Voeg daarna 150 µL 5%BSA-blokkeeroplossing toe aan de wells van rij vier.

Verdun de primaire antilichamen PGP9.5 en PDH in 1.500 µL spoeloplossing met 1%BSA en voeg 150 µL toe aan elke well in rij vijf. Gebruik een entlus om de coupes over te brengen naar de signaalversterkingsoplossing in rij één. Zodra de coupes zich in de primaire antilichaamoplossing in rij vijf bevinden, wordt de plaat strak omwikkeld met laboratoriumfolie om verdamping te voorkomen, waarna de monsters gedurende één uur bij kamertemperatuur worden geschud op een vlakke rocker.

Incubeer overnacht onder schudbeweging bij vier graden Celsius. Begin de tweede dag van de procedure door 150 µL spoeloplossing met 1% BSA in de wells van rij zes, zeven en acht van de 96-well plaat te pipetteren. Voeg de fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen toe aan 1.500 µL 1% BSA.

Pipetteer vervolgens 150 µL van de secundaire antilichaamoplossing in elke well van rij negen. Spoel de coupes door ze via wells zes, zeven en acht te leiden. Zodra de coupes zich in de secundaire antilichaamoplossing in rij negen bevinden, wikkel je de plaat in parafilm en dek je deze af met aluminiumfolie om de fluorescentiesignalen te beschermen.

Incubeer met schudden zoals voorheen. Pipetteer op dag drie 150 µL steriel gefiltreerde 1x PBS in de rijen 10, 11 en 12. Draag de monsters over naar rij 10 en dek de plaat vervolgens af met aluminiumfolie.

Spoel gedurende één uur bij kamertemperatuur met wiebelen. Bereid vervolgens een microscoopglas voor het monteren van de coupes door 50 µL gefilterde 1x PBS op het glas te pipetteren. Zodra het spoelen is voltooid, wordt een coupe uit rij 12 op het glas overgebracht, waarna één tot twee druppels monteermiddel met DAPI direct op de coupe worden aangebracht.

Plaats voorzichtig een 1.5 microscopisch glasdekglaasje van 50 millimeter bij 24 millimeter over de sectie. Bewaar de objectglaasjes overnacht in het donker bij kamertemperatuur om het montage-medium te laten uitharden voordat de glaasjes worden opgeslagen of gefotografeerd. Selecteer het 40X olie-immersieobjectief op een omgekeerde laser-scanning confocale microscoop.

Selecteer de geschikte lasers en detectoren om de kernen, zenuwvezels en mitochondriën te beelden. Voer de volgende scanparameters in de microscoopsoftware in: een 12-bit intensiteitsresolutie, een scansnelheid van 500 Hertz met gemiddelde over twee frames en een zoom van 2.2. Stel de microscoopsoftware in voor een geoptimaliseerde laterale resolutie door een scanresolutie van 1024 bij 1024 te selecteren.

Optimaliseer de axiale resolutie en optische sectie door een confocale apertuur van één air unit te selecteren met een Z-stapgrootte van 210 nanometers. Scan elk signaal afzonderlijk en pas de detectorspanning en offset aan om over- en onderverzadigde pixels te verwijderen. Activeer een live-scan voor het zenuwsignaal en pas de Z-focusregeling aan om in de microscoopsoftware de bovenste en onderste brandvlakken te vinden en in te stellen die het zenuwsignaal binnen de weefselcoupe omvatten.

Scan de uiteindelijke Z-serie met sequentiële scanning om crosstalk van het fluorescentiesignaal te elimineren. Isoleer de epidermis van het stratum corneum en de dermis door met een selectietool een gebied rond de epidermis te trekken op een kopie van het originele beeld. Snijd het beeld vervolgens bij tot de selectie.

Bereken de point spread functions voor de groene en rode fluorescentie-confocale signalen met de functie calculate spread function. Stel vervolgens de parameters voor de brekingsindex van het medium voor olie in op 1,515 en de numerieke apertuur voor het 40X olie-objectief op 1,25. Stel het detector-pinhole in op één air unit en kies een laser-excitatiegolflengte.

Gebruik iteratieve restauratie ingesteld op 100% confidence, een iteratielimiet van 10 cycli en de groene en rode PSF's voor de deconvolutie van de groene en rode fluorescentiesignalen. Gebruik de tool 'create surface' om een oppervlak rond de gedeconvolueerde zenuwsignalen te maken door 'smooth feature' uit te vinken, 'absolute intensity' te selecteren voor drempelwaardebepaling, een onderste drempelwaarde van 3, 000 en een bovenste drempelwaarde van 65, 535 in te stellen. Behoud de oppervlakken die groter zijn dan 10 voxels.

Verwijder de niet-zenuwenvlakken door het bewerkingstabblad in 'nerve surface' te gebruiken om individuele niet-zenuwenvlakken te selecteren, of houd de Ctrl-toets ingedrukt om meerdere niet-zenuwenvlakken te selecteren. Verwijder de geselecteerde niet-zenuwenvlakken door op de Delete-toets te drukken. Gebruik het bewerkingstabblad in 'nerve surface' en druk op de knop 'mask all' in de maskereigenschappen.

Selecteer in het nieuwe venster kanaal vijf mitochondriën gedeconvolueerd onder de kanaalselectie en vink vervolgens duplicaat kanaal aan voordat het masker wordt toegepast. Selecteer de optie constant binnen/buiten en stel de voxels buiten het oppervlak in op 0.0 door het vakje instellen voxels buiten oppervlak op 0.0 aan te vinken, en klik op de OK-knop. Maak tot slot mitochondriën-specifieke oppervlakken met de tool oppervlak maken om een oppervlak rond de gemaskeerde gedeconvolueerde mitochondriële signalen te creëren door gladstrijken kenmerk uit te vinken en achtergrondsubtractie te gebruiken voor de drempelwaarde.

Stel de diameter van de grootste bol in op 1,50 µm, de ondergrens op 2.000 en de bovengrens op maximaal 65.535. Zorg ervoor dat de oppervlakken boven de 1,0 voxels blijven. Deze representatieve 3D-confocale microscopie-afbeelding illustreert het zenuwspecifieke groene fluorescentiesignaal.

Er wordt een 3D-oppervlak in cyaan gemaakt voor het zenuwsignaal. Vervolgens wordt het zenuwspecifieke mitochondriële signaal geïsoleerd van de overige epidermale mitochondriële signalen door het zenuwoppervlak als maskeerinstrument te gebruiken. Het resulterende zenuwspecifieke mitochondriële rode fluorescentiesignaal wordt gebruikt om oppervlakken te creëren, weergegeven in magenta, rond de mitochondriën binnen het zenuwoppervlak dat in cyaan wordt getoond.

Dit maakt het mogelijk om de mitochondriën in de zenuwvezels in detail te zien. Hier worden mitochondriale oppervlaktegegevens gepresenteerd als een grootte-frequentiehistogram om het percentage mitochondriën te visualiseren dat aanwezig is in elk van de verschillende bochten op basis van hun volume. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om zorgvuldig met het weefsel om te gaan tijdens het kleuringsproces; zorg ervoor dat het weefsel volledig is ondergedompeld in de oplossingen om een gelijkmatige en consistente kleuring in alle coupes te garanderen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe mitochondria in menselijke intra-epidermale zenuwvezels kunnen worden gevisualiseerd en gekwantificeerd. Ons gedetailleerde protocol is ontworpen om andere onderzoekers te leren hoe ze menselijke huidbiopten kunnen kleuren, beelden kunnen maken, verwerken en analyseren, met als doel de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de pathogenese van mitochondriële neurologische aandoeningen, zoals neuropathie.