Praktische problemen aanpakken bij op atoomkrachtmicroscopie gebaseerde micro-inkeping op menselijke gewrichtskraakbeenexplantaten

Het doel van dit protocol was om een in vitro model te maken voor het bestuderen van de mechanische eigenschappen van gewrichtskraakbeen tijdens het ontstaan en de progressie van artrose. Het belangrijkste voordeel van de huidige techniek is dat de kraakbeenexplantaten gemakkelijk te genereren zijn en zeer representatief zijn voor het kraakbeen van de inheemse leeftijd. Dit model kan worden gebruikt om verschillende artrose-, diagnostische en therapeutische benaderingen op biomechanisch niveau te analyseren en te monitoren.

Snijd om te beginnen het kraakbeen weg van het bot met een scalpel. Genereer met behulp van een biopsiepons schijven met een diameter van vier millimeter. Plaats de schijf op een op maat gemaakt snijapparaat.

Fixeer en stabiliseer de kraakbeenschijf met een spatel. Snijd de kraakbeenschijf door met een scheermesje. Verzamel de schijf met een spatel en plaats deze in een buis van 1,5 milliliter.

Om in de kraakbeenmonsters te blijven, voegt u 130 microliter celdoorlatende fluorescentiekleurstof toe aan elk putje van de plaat met 96 putjes en verdeelt u de schijf over de plaat als één schijf per putje. Plaats de plaat met 96 putjes op de plaathouder van de fluorescentiemicroscoop. Selecteer het juiste fluorescentiefilter en het objectief.

Plaats het objectief onder het vooraf geselecteerde putje met individueel kraakbeen. Focus op de schijf om het cellulaire patroon te zien. Selecteer de navigatorfunctie om een overzicht van de hele put te krijgen.

Gebruik de linkermuisknop en sleep deze om naar een andere podiumpositie te navigeren. Selecteer een vierkant dat het interessegebied omvat dat moet worden gescand. Selecteer de focuskaartoptie van de software en selecteer vervolgens elke afzonderlijke tegel door met de linkermuisknop in het midden ervan te klikken.

Selecteer de optie focus map in het verschenen venster met alle eerder geselecteerde tegels. Dubbelklik op een tegel om deze weer te geven en in de juiste focus te brengen. Klik vervolgens op set Z om het focusplan op te slaan en door te gaan naar de volgende tegel.

Nadat u het focusplan voor elke afzonderlijke tegel hebt aangepast, begint u met het verzamelen van afbeeldingen door op start scannen te drukken. Bevestig elke vooraf geselecteerde kraakbeenschijf met een cellulair patroon in petrischaaltjes door voldoende biocompatibele lijm toe te voegen aan de boven-, onder-, linker- en rechterkant van de schijf. Bedek de schijven met 2,5 milliliter Leibovitz medium zonder L-glutamine.

Plaats de petrischaal in de monsterhouder van de AFM-apparaten. Om de AFM-cantilever te kalibreren, plaatst u deze op het oppervlak van de cantilever van het glasblok zodat deze op het gepolijste optische vlak in het midden van het glasblok rust. Laat de cantilever in stappen van 100 micrometer zakken met behulp van de stappenmotorfunctie totdat deze volledig is ondergedompeld in het medium.

Om de gewenste kraakbeenmeetplaats te identificeren, start u een scannerbenadering met de cantilever op een schoon monstervrij gebied van de petrischaal. Trek vervolgens de cantilever 1,5 millimeter weg van de onderkant van de plaat. Schakel over van helderveld- naar fluorescentieweergave en identificeer visueel de bovenkant van de schijf.

Verplaats de AFM-monsterhouder precies twee millimeter naar het midden van de schijf. Voer een scannerbenadering uit om het oppervlak van de kraakbeenschijf te bereiken en trek de cantilever 100 micrometer in. Om een krachtafstandscurve te genereren, concentreert u zich op de cellen die zich op de gewenste meetplaats bevinden.

Klik op de knop Uitvoeren om de metingen te starten en vijf krachtafstandscurven op elke meetplaats te verkrijgen. Sla de curves op zodra ze zijn geïnspecteerd. Om de moduli van Young te schatten, opent u met behulp van de optie een reeks spectroscopiecurven openen de gegenereerde krachtafstandscurven die moeten worden geanalyseerd.

Selecteer het Hertz-fit-model, gevolgd door de elasticiteits-fit-optie. Visualiseer en documenteer vervolgens de modulus van Young. Pas aan met behulp van de poisson-verhouding van 0,5 en de juiste vrijdragende tipradius.

Controleer vervolgens visueel de pasvorm van de krachtafstandscurve om de juistheid te garanderen. Voor het bepalen van de indrukdiepte opent u elk van de gegenereerde krachtafstandscurven in de gegevensanalysesoftware en selecteert u het Hertz-fit-model als het analyseproces. Pas de optie Basislijnverschuiving aftrekken toe om de verticale afbuigingsas op nul te zetten en selecteer de functie Verschuiving plus kantelen.

Gebruik de functie contactpunt zoeken om het contactpunt automatisch te identificeren. Trek met behulp van de verticale tippositiefunctie de afstand die uitsluitend rekening houdt met de vrijdragende doorbuiging af van de ruwe piëzohoogte tijdens de indrukking. Selecteer de optie elasticiteit-pasvorm om de verwerkte krachtafstandscurve weer te geven.

Selecteer vervolgens het gebied van de grafiek zodat het is uitgelijnd met de meest negatieve waarde op de verticale tippositie-as. Lees en documenteer de inspringing op het tabblad Parameter in het vak XMIN. De schijven met enkele snaren vertoonden hogere stijfheidswaarden met een mediaan van 2,6 kilo pascal, wat representatief is voor onaangetaste, gezonde kraakbeengebieden.

Met het begin en de progressie van artrose toonden de AFM-metingen een sterke stapsgewijze afname van de stijfheid van 42% in dubbele snaren, 77% in kleine clusters en uiteindelijk 88% in gevorderde stadia vertegenwoordigd door grote clusters. De schijven met een diffuus patroon vertoonden een verhoogde elasticiteit met een belangrijke variatie van de enkelvoudige moduluswaarden van Young. Voor alle kraakbeenschijven met een toegewezen overheersende cellulaire patroonorganisatie bleek de indrukdiepte geassocieerd met het gebruikte setpoint omgekeerd evenredig te zijn met de stijfheid.

De artefacten die in de gegenereerde krommen van de krachtafstand worden gezien, wijzen op ofwel een suboptimaal contact tussen de AFM-cantilever en het kraakbeenoppervlak of onjuiste monsterfixatie op de petrischaal. Onze kraakbeenexplantaten kunnen verder worden verwerkt en geanalyseerd met behulp van een verscheidenheid aan moleculair biologische technieken, zoals eiwitanalyse via eliza, immunolabeling, western moding of genanalyse via PCR. Deze methode kan worden gebruikt om de directe impact van nieuwe therapieën op gewrichtskraakbeen te bestuderen en kan onderzoekers helpen om belangrijke inzichten te verwerven in de potoma-mechanismen van artrose.