Een efficiënt clearingprotocol voor de studie van zaadontwikkeling in tomaat (Solanum lycopersicum L.)
7 september 2022
Het tomatenzaad is een belangrijk model voor het bestuderen van genetica en ontwikkelingsbiologie tijdens de voortplanting van planten. Dit protocol is nuttig voor het opruimen van tomatenzaden in verschillende ontwikkelingsstadia om de fijnere embryonale structuur te observeren.
Deze methode kan onderzoekers helpen om snel en moeiteloos abnormale perioden van tomatenembryo-ontwikkeling te vinden. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is een behandeling van tomatenzaden met natriumhypochloriet die een basis biedt voor de observatie van tomatenembryo's. Begin met de chemische bereiding en oogst van de Solanum lycopersicum vruchten drie tot 23 dagen na de bloei of DAF.
Zet de vruchten onmiddellijk op ijs en verdeel ze in vroege, middelste en late vruchten, gebaseerd op de dagen na de bloei. Breek het vroege fruit, leg het op een dia en verzamel verse zaden voorzichtig met een precisietang onder 1x tot 4x vergroting van de stereomicroscoop. Voor midden- en late vruchten, breek het fruit en verzamel direct verse zaden met behulp van een precisietang.
Breng bij de conventionele methode de vers verzamelde zaden onmiddellijk over in een centrifugebuis van twee milliliter met 1,5 milliliter FAA-fixatief en plaats de buis op de orbitale shaker bij 5 tpm gedurende vier uur bij kamertemperatuur. Droog vervolgens de zaden uit in 70% 95% en 100% ethanol gedurende elk een uur op een orbitale shaker bij 5 tpm. Als u klaar bent, plaatst u het zaad in de drie tot vijf druppels opruimoplossing die op de dia aanwezig zijn en dek het voorzichtig af met een afdekslip.
Gebruik een enkele concave dia voor middelste en late zaden. Afhankelijk van de ontwikkelingsstadia van de zaden, incubeer ze bij kamertemperatuur om te worden opgeruimd. Observeer na incubatie de monsters met een differentieel interferentiecontrast of een DIC-microscoop uitgerust met een digitale camera met een vergroting van 10x, 20x en 40x.
Pas de helderheid van het doorgelaten licht, de DIC-schuifregelaar en het condensatoropening in realtime aan en optimaliseer deze voor elk monster en leg beelden vast. Breng de verse zaden verzameld van de gebroken vruchten over in een centrifugebuis van twee milliliter met 1,5 milliliter desinfecterende oplossing. Incubeer de monsters op een orbitale shaker bij 30 rpm gedurende drie tot 50 minuten bij kamertemperatuur.
Zodra de omtrek van de binnenste zaadlaag duidelijk zichtbaar is, gooit u de desinfecterende oplossing weg. Voor middelste en late zaden, breng de zaden over op een glijbaan. Gebruik een tang en een ontleednaald om het zaadslijm te verwijderen onder 1x tot 4x vergroting van de stereomicroscoop.
Breng de zaden terug in de oorspronkelijke centrifugebuis met behulp van een tang. Was ze vijf keer in 1,5 milliliter gedeïoniseerd water gedurende 10 seconden elk en gooi het gedeïoniseerde water weg. Voeg vervolgens het dubbele volume van de opruimoplossing toe aan de zaden.
Afhankelijk van het zaadstadium, geef de intermitterende vacuümbehandeling gedurende nul tot 50 minuten, met intervallen van 10 minuten na elke vacuümbehandeling van 10 minuten. Vervang na de vacuümbehandeling de opruimoplossing. Om het opruimen van zaden te vergemakkelijken, plaatst u de centrifugebuis beschermd tegen licht gedurende 30 minuten tot zeven dagen bij kamertemperatuur.
In het geval van late embryo's, vervang de oplossing dagelijks door een verse opruimoplossing, gevolgd door de zaden gedurende 10 minuten aan een vacuümbehandeling te onderwerpen. Plaats de geruimde zaden op de glijbaan of enkele holle glijbaan. Gebruik de DIC-microscoop die is uitgerust met een digitale camera om de helderheid van het doorgelaten licht, de DIC-schuifregelaar en het condensatoropening in realtime voor elk monster aan te passen en te optimaliseren en het beeld vast te leggen.
In de conventionele methode om S.lycopersicumzaden te verwijderen, blokkeerden de dichte endospermcellen de visualisatie van vroege embryo's bij 3 en 6 DAF. De verminderde permeabiliteit tijdens de zaadgroei resulteerde in wazige beelden na 9 DAF. Het zaadslijm en de zaadlaag werden geleidelijk dichter, waardoor de penetratie van clearingmiddelen vanaf 13 DAF werd voorkomen.
De omtrek van het embryo in 14 tot 19 DAF-zaden was extreem wazig, ondanks de verlengde behandelingstijd van zeven dagen. De interne structuur in 22 DAF-zaden was volledig onzichtbaar. Het gestripte zaadlaagslijm geproduceerd door de zaadlaag epidermale cellen was prominent vanaf 13 DAF.
De natriumhypochlorietbehandeling maakte een duidelijke identificatie van de binnenste zaadlaag en loslating van het grootste deel van het aanhangende slijm mogelijk zonder zaadbeschadiging. In het geoptimaliseerde clearingprotocol vertoonden de zaden voldoende transparantie in alle geteste ontwikkelingsstadia. De verschillende cellagen van de zaadlaag bij 3 DAF, te onderscheiden endospermcellen bij 5 DAF, het stokvormige embryo bij zeven DAF, het bolvormige stadium bij 9 DAF en het hartstadium bij 11 DAF werden waargenomen.
In het geoptimaliseerde protocol werd de mate van de krul van zaadlobben en scheut apicale meristeem zeer gemakkelijk vastgelegd in verschillende stadia van embryonale ontwikkeling. Sterilisatie verwijdert zaadslijm en zaadlaagpigment, wat de zaadpenetratie en visualisatie verbetert. Vacuümbehandeling kan de penetratie van de clearingoplossing versnellen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Het tomatiezaad dient als een cruciaal model voor het onderzoek naar genetica en ontwikkelingsbiologie bij plantenreproductie. Dit protocol faciliteert het transparant maken van tomatiezaden in verschillende ontwikkelingsstadia om de complexe embryonale structuur te bestuderen.
Belangrijkste Onderzoeksonderdelen
Wetenschapsgebied
- Genetica
- Ontwikkelingsbiologie
- Plantvoortplanting
Achtergrond
- Tomatenzaden zijn essentieel voor het bestuderen van de embryonale ontwikkeling van planten.
- Inzicht in de stadia van de embryo-ontwikkeling bij tomaten kan genetische inzichten onthullen.
- Klareringstechnieken verbeteren de visualisatie van embryonale structuren.
- Behandeling met natriumhypochloriet is cruciaal voor de observatie van embryo's.
Doel van het onderzoek
- Om een protocol te bieden voor het transparant maken van tomatiezaden.
- Om de observatie van tomatoembryo's in verschillende ontwikkelingsstadia te vergemakkelijken.
- Om onderzoekers te helpen bij het identificeren van perioden met abnormale embryo-ontwikkeling.
Gebruikte methoden
- Oogsten van Solanum lycopersicum-vruchten 3 tot 23 dagen na de bloei.
- Verdelen van de vruchten in vroege, middelste en late categorieën op basis van het aantal dagen na de bloei.
- Verzamelen van verse zaden onder een stereomicroscoop met behulp van precisiepincetten.
- Behandelen van de zaden met natriumhypochloriet voor een verbeterde observatie.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol maakt een duidelijke visualisatie van tomatembryo's mogelijk.
- Onderzoekers kunnen ontwikkelingsafwijkingen efficiënt identificeren.
- Verschillende stadia van de embryoontwikkeling kunnen duidelijk worden waargenomen.
- De methode is eenvoudig en effectief voor embryonaal onderzoek.
Conclusies
- Dit protocol is een waardevolle tool voor onderzoek naar de ontwikkelingbiologie van planten.
- Het vergroot het begrip van de embryogenese van tomatiezaden.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze methode om genetische variaties te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Efficiënte visualisatie van de embryogenese van tomatiezaden pakt een cruciaal knelpunt aan in de plantontwikkelingsbiologie en de ontdekking van eigenschappen. Dit clearing-protocol maakt een hoge-resolutie, kwantitatieve beoordeling van de stadia van zaadontwikkeling mogelijk, wat hypothese-gestuurd onderzoek en genetische screening in pijplijnen voor gewasverbetering ondersteunt. Verbeterde continuïteit van beeldvorming over ontwikkelingsvensters versterkt het voorspellende vertrouwen voor translationele plant-R&D en validatie van eigenschappen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt een nauwkeurige morfologische beoordeling van embryonale stadia mogelijk voor de validatie van genetische targets.
- Faciliteert de identificatie van ontwikkelingsafwijkingen in mutante lijnen voor de analyse van signaalpaden.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door ontwikkelingscontrolepunten bij de zaadvorming te verduidelijken.
Screening & assayontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerd protocol voor het prepareren van geklaarde zaden die geschikt zijn voor kwantitatieve imaging-assays.
- Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid bij fenotypische screening van zaadkenmerken.
- Maakt een betrouwbare vergelijking van ontwikkelingsfenotypes tussen genotypen en behandelingen mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt ontwikkelingsbeeldvormingsresultaten uit met de selectie van translationele kenmerken in gewas-R&D.
- Ondersteunt de continuïteit van genetische ontdekking tot validatie in de prebreeding bij Solanaceae-soorten.
- Vermindert het risico op falen van kenmerken in een laat stadium door vroege detectie van ontwikkelingsdefecten mogelijk te maken.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot validatie voor R&D van planteneigenschappen, van vroege genetische hypothesetoetsing via fenotypische screening tot translationele verbetering van eigenschappen.
- Discovery-biologie: Ondersteunt hypothese-testen en de verduidelijking van pathways door directe visualisatie van embryonale structuren mogelijk te maken.
- Screening: Levert assay-klaar, reproduceerbaar geklaarde zaden voor kwantitatieve imaging en fenotypevergelijking.
- Analytica: Biedt morfologische read-outs met een hoge resolutie voor statistische analyse van de ontwikkelingsprogressie.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert kenmerkuitlijning en risico-gecorrigeerde vooruitgang in programma's voor gewasverbetering.
- Enterprise-hergebruik: Biedt een breed toepasbare clearing-workflow voor Solanaceae en aanverwante soorten in plant-R&D-portefeuilles.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellingsvertrouwen bij de selectie van eigenschappen en target-validatie door ontwikkelingsonduidelijkheden op te lossen.
- Operationele waarde: Stroomlijnt de monstervoorbereiding, verbetert de reproduceerbaarheid en vermindert de arbeidsintensiteit.
- Strategische waarde: Maakt beter geïnformeerde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënte voortgang van eigenschappen mogelijk.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van genetische lijnen en ontwikkelingstraits.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in plantontwikkelingsbiologie en microscopie.
- Toegang tot DIC-microscopie en vacuüminfrastructuur is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor de adoptie van het protocol en de vergelijkbaarheid van gegevens.
- Aanpasbaar voor andere Solanaceae-soorten door optimalisatie van het protocol.
- De efficiëntie van het kleuren kan variëren afhankelijk van de dikte van de zaadhuid en het ontwikkelingsstadium.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:30
Seed Collection
1:10
Chloral Hydrate-Based Clearing of Seeds Using a Conventional Protocol
2:21
Chloral Hydrate-Based Clearing of Seeds Using the Optimized Protocol
4:11
Results: Clearing Tomato (Solanum lycopersicum) Seeds at Different Developmental Stages to Observe the Finer Embryonic Structure
5:56
Conclusion
