Een efficiënt clearingprotocol voor de studie van zaadontwikkeling in tomaat (Solanum lycopersicum L.)

Deze methode kan onderzoekers helpen om snel en moeiteloos abnormale perioden van tomatenembryo-ontwikkeling te vinden. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is een behandeling van tomatenzaden met natriumhypochloriet die een basis biedt voor de observatie van tomatenembryo's. Begin met de chemische bereiding en oogst van de Solanum lycopersicum vruchten drie tot 23 dagen na de bloei of DAF.

Zet de vruchten onmiddellijk op ijs en verdeel ze in vroege, middelste en late vruchten, gebaseerd op de dagen na de bloei. Breek het vroege fruit, leg het op een dia en verzamel verse zaden voorzichtig met een precisietang onder 1x tot 4x vergroting van de stereomicroscoop. Voor midden- en late vruchten, breek het fruit en verzamel direct verse zaden met behulp van een precisietang.

Breng bij de conventionele methode de vers verzamelde zaden onmiddellijk over in een centrifugebuis van twee milliliter met 1,5 milliliter FAA-fixatief en plaats de buis op de orbitale shaker bij 5 tpm gedurende vier uur bij kamertemperatuur. Droog vervolgens de zaden uit in 70% 95% en 100% ethanol gedurende elk een uur op een orbitale shaker bij 5 tpm. Als u klaar bent, plaatst u het zaad in de drie tot vijf druppels opruimoplossing die op de dia aanwezig zijn en dek het voorzichtig af met een afdekslip.

Gebruik een enkele concave dia voor middelste en late zaden. Afhankelijk van de ontwikkelingsstadia van de zaden, incubeer ze bij kamertemperatuur om te worden opgeruimd. Observeer na incubatie de monsters met een differentieel interferentiecontrast of een DIC-microscoop uitgerust met een digitale camera met een vergroting van 10x, 20x en 40x.

Pas de helderheid van het doorgelaten licht, de DIC-schuifregelaar en het condensatoropening in realtime aan en optimaliseer deze voor elk monster en leg beelden vast. Breng de verse zaden verzameld van de gebroken vruchten over in een centrifugebuis van twee milliliter met 1,5 milliliter desinfecterende oplossing. Incubeer de monsters op een orbitale shaker bij 30 rpm gedurende drie tot 50 minuten bij kamertemperatuur.

Zodra de omtrek van de binnenste zaadlaag duidelijk zichtbaar is, gooit u de desinfecterende oplossing weg. Voor middelste en late zaden, breng de zaden over op een glijbaan. Gebruik een tang en een ontleednaald om het zaadslijm te verwijderen onder 1x tot 4x vergroting van de stereomicroscoop.

Breng de zaden terug in de oorspronkelijke centrifugebuis met behulp van een tang. Was ze vijf keer in 1,5 milliliter gedeïoniseerd water gedurende 10 seconden elk en gooi het gedeïoniseerde water weg. Voeg vervolgens het dubbele volume van de opruimoplossing toe aan de zaden.

Afhankelijk van het zaadstadium, geef de intermitterende vacuümbehandeling gedurende nul tot 50 minuten, met intervallen van 10 minuten na elke vacuümbehandeling van 10 minuten. Vervang na de vacuümbehandeling de opruimoplossing. Om het opruimen van zaden te vergemakkelijken, plaatst u de centrifugebuis beschermd tegen licht gedurende 30 minuten tot zeven dagen bij kamertemperatuur.

In het geval van late embryo's, vervang de oplossing dagelijks door een verse opruimoplossing, gevolgd door de zaden gedurende 10 minuten aan een vacuümbehandeling te onderwerpen. Plaats de geruimde zaden op de glijbaan of enkele holle glijbaan. Gebruik de DIC-microscoop die is uitgerust met een digitale camera om de helderheid van het doorgelaten licht, de DIC-schuifregelaar en het condensatoropening in realtime voor elk monster aan te passen en te optimaliseren en het beeld vast te leggen.

In de conventionele methode om S.lycopersicumzaden te verwijderen, blokkeerden de dichte endospermcellen de visualisatie van vroege embryo's bij 3 en 6 DAF. De verminderde permeabiliteit tijdens de zaadgroei resulteerde in wazige beelden na 9 DAF. Het zaadslijm en de zaadlaag werden geleidelijk dichter, waardoor de penetratie van clearingmiddelen vanaf 13 DAF werd voorkomen.

De omtrek van het embryo in 14 tot 19 DAF-zaden was extreem wazig, ondanks de verlengde behandelingstijd van zeven dagen. De interne structuur in 22 DAF-zaden was volledig onzichtbaar. Het gestripte zaadlaagslijm geproduceerd door de zaadlaag epidermale cellen was prominent vanaf 13 DAF.

De natriumhypochlorietbehandeling maakte een duidelijke identificatie van de binnenste zaadlaag en loslating van het grootste deel van het aanhangende slijm mogelijk zonder zaadbeschadiging. In het geoptimaliseerde clearingprotocol vertoonden de zaden voldoende transparantie in alle geteste ontwikkelingsstadia. De verschillende cellagen van de zaadlaag bij 3 DAF, te onderscheiden endospermcellen bij 5 DAF, het stokvormige embryo bij zeven DAF, het bolvormige stadium bij 9 DAF en het hartstadium bij 11 DAF werden waargenomen.

In het geoptimaliseerde protocol werd de mate van de krul van zaadlobben en scheut apicale meristeem zeer gemakkelijk vastgelegd in verschillende stadia van embryonale ontwikkeling. Sterilisatie verwijdert zaadslijm en zaadlaagpigment, wat de zaadpenetratie en visualisatie verbetert. Vacuümbehandeling kan de penetratie van de clearingoplossing versnellen.