Protocollen voor het verkrijgen Zygotic en somatische embryo's voor het bestuderen van de verordening van de vroege embryo ontwikkeling in de Model Legume Medicago truncatula

Het algemene doel van de volgende procedures is om aan te tonen hoeveel cargo tula-embryo's kunnen worden verkregen in verschillende ontwikkelingsstadia om de genetische regulatie van embryogenese bij planten te onderzoeken, dit kan worden bereikt door de morfologie van de peul te koppelen aan de verschillende ontwikkelingsstadia van het zygotische embryo, en door bladexplanaat te kweken om somatische embryo's in de verschillende stadia te verkrijgen. Uiteindelijk kunnen kwantitatieve PCR en beta-glucuronidase worden gebruikt om de expressie van genen tijdens de embryogenese in de specifieke ontwikkelingsstadia van belang te beoordelen. De voordelen van deze technieken zijn dat het markeren van individuele bloemen niet vereist is voor de in vivo-experimenten, en dat ze geoptimaliseerde in vitro-procedures zijn die complementaire experimentele benaderingen bieden.

Visuele demonstratie van de kweekprocedure is belangrijk omdat het de details van de manipulaties beter te kunnen volgen. Het demonstreren van de in vivo-procedure zal worden gedaan door Wang, terwijl Kim Nolan de in vitro-procedure zal demonstreren. Om de ontwikkeling van zygotische embryo's te vergemakkelijken, prik het oppervlak van de zaadmantels van zaden van een Monte cargo trinocular plant en laat de zaden een nacht lang gedrenkt in water.

De volgende dag, zaai drie zaden in elk van de 10 potten met een diameter van 15 centimeter in potmix en breng de potten over naar een kas. Laat de planten groeien onder een 14-uur durende fotoperiode met een dag-nacht temperatuur van 23 tot 19 graden Celsius, en bewaar de gezondste zaailingen na ontkieming zodat er één plant per pot is en omring de zaailingen met een trellis zodat de planten kunnen klimmen wanneer er peulen verschijnen. Verzamel in de geschikte stadia zoals beschreven in tabel een en figuur een om de gewenste vroege embryo-ontwikkelingsstadia te verkrijgen.

Gebruik vervolgens een pincet om de les van de peulen te isoleren. Als alternatief, voor meer verfijnde microscopie, kan de helderheid in Hoyer-oplossing volledig worden verduidelijkt, de embryostadia kunnen worden bevestigd door de embryo's onder een standaard compound-microscoop te beeldvormen. Verzamel vervolgens het aantal UL dat vereist is voor het experiment uit het centrale gebied van de peul en bewaar ze op de juiste temperatuur voor downstream-analyse voor somatische embryo-ontwikkeling.

Verzamel in vitro blaadjes van de nieuwste, bijna volledig uitgebreide tate-blad van een verlengde stam van een tran atula-cultivar die gemakkelijk embryo's in cultuur kan vormen. Houd de tate-bladeren op vochtige papieren handdoeken in een kweekpot om uitdroging te voorkomen. Plaats vervolgens de bladeren, werkend in een UV-gesteriliseerd bioveiligheidskabinet, in de mesh-bal van een autoclaaf-thee-infuus.

Een ondergedompelde infuus in 70% ethanol in een autoclaaf met een schroefdop van 250 milliliter. Polycarbonaat kweekpot na 30 seconden, laat het bladweefsel uitlekken en dompel vervolgens de infuus in een verdunde bleekoplossing van één op acht gedurende 10 minuten. Met af en toe voorzichtig schudden, schudden voorzichtig de pot en laten het overtollige water uitlekken.

Spoel vervolgens de infuus. Nog een keer in vers gedeïoniseerd water in een nieuwe pot. Gebruik nu steriele pincetten om de bladeren van de thee-infuus over te brengen naar een vers kweekpot van steriele gedeïoniseerde gedestilleerde waterschroef op de steriele dop.

Spoel vervolgens de bladeren door omkering en schudden. Laat vervolgens de blaadjes drijven op het steriele water om de implantaten te plateren. Knip de randen van de individuele gesteriliseerde blaadjes bij met behulp van steriele techniek.

Snijd vervolgens het resterende rechthoek in twee of drie, acht tot 10 bij drie tot vijf millimeter rechthoekige explanaat met de middennerf in het midden van elke X explanaatplaat. Zes x explantaten per agar-versterkte kweekmedium in negen centimeter diameter. Petrischalen met de ABA-zijkant naar beneden om de gebruikelijke oriëntatie van het blad te behouden.

Vervolgens verzegelen de Petrischalen met perfil en incuberen de platen in het donker bij 28 graden Celsius in een gecontroleerde temperatuurkamer. Gebruik na drie weken een steriele roestvrijstalen spatel en pincetten om de differentiërende gat explantaten op vers medium te subcultureren. De eerste embryo's moeten worden waargenomen in ongeveer vier weken als callusvorming optreedt en de callus de grootte van de grootste explan hier getoond overschrijdt.

Breng slechts 50% van de individuele callus over bij subculture naar vers medium. Gebruik ten slotte een stereomicroscoop om de verschillende embryostadia te verzamelen over een incubatieperiode van vier tot acht weken, waarbij de explantaten worden verwerkt volgens de experimentele doelstellingen. Na het oogsten van zygotische embryo's zoals zojuist aangetoond, kan downstream C twee hybridisatie of andere geschikte strategieën worden toegepast, van bijzonder belang zoals aangetoond in deze afbeeldingen, kan de onderscheidenheid van de SSIS en Spencer worden waargenomen door de geplateerde X plannen te volgen.

Gedurende weken vier tot acht kunnen somatische embryo's in discrete stadia worden gelokaliseerd en geplukt voor onmiddellijke analyse. Bijvoorbeeld, deze gegevens illustreren hoe embryo's in de vroege Olein-fase de expressie van één type medicago Tula eoin-gen tonen, maar niet een ander. Een bijzonder voordeel van het somatische embryo-systeem is dat transformatie van de callus kan worden uitgevoerd zonder een hele plant te regenereren.

Inderdaad, zoals hier aangetoond. Beta-glucuronidase kan worden gebruikt om genexpressie in de verschillende stadia van embryogenese te visualiseren. Na het bekijken van de video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een peul selecteert en dissecteren om Andres te verkrijgen.

U zou ook een goed begrip moeten hebben van hoe u steriele explan voor somatische embryogenese voorbereidt en plateert na hun ontwikkeling. Deze technieken hebben de onderzoeking van de transcriptieregulatie van de vroege stadia van embryogenese in relatie tot embryogroei, ontwikkeling en voedingsstoffenopslag mogelijk gemaakt.