Name: Protocollen voor het verkrijgen Zygotic en somatische embryos voor het bestuderen van de verordening van de vroege embryo ontwikkeling in de Model Legume Medicago truncatula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Leer protocollen voor het verkrijgen van zygote en somatische embryo's bij Medicago truncatula. Deze methoden koppelen peulmorfologie aan embryonale stadia en gebruiken weefselkweek voor genexpressie-analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door de Australian Research Council-subsidie CEO348212 en de Universiteit van Newcastle. De assistentie van Dr. Sam Zhang wordt op prijs gesteld.

1. Zygotic Embryo Development <ol><li> Plant Materiaal <ol><li> Grow de Medicago truncatula wild type Jemalong of haar buurt isogene, zeer re-generable genotype Jemalong 2HA 13 (bekend als 2HA) in een kas met een 14 uur fotoperiode en 23 ° C / 19 ° C dag / nacht temperatuur. <ol><li> Pierce het oppervlak van de zaadhuid (met een 23 G naald) vóór het zaaien zodat water mag het zaad voeren en weken in water gedurende de nacht. Voeg genoeg water om volledig te dekken het zaad. </li><li> Zaai 3 zaden in elke 15 cm pot diameter (in totaal 10 potten) in potgrond (grof zand, perliet, kokos-turf (1: 1: 1) plus 5 g van Osmocote Exact Standaard: slow release meststof) en transfer naar het kas. Bewaar de gezondste zaailing na het ontkiemen, dus er is 1 plant per pot en omgeven door een hekwerk voor de plant stengels te klimmen. </li></ol></li></ol></li><li> Oogsten Pods <ol><li> Verzamel peulen van de wild soort Jemalong of 2HA naar de juiste vroege embryo stadia te verkrijgen zoals eerst beschreven 9. Opmerking: De verschillende stadia pod worden getoond in figuur 1 en de bijbehorende embryo fasen zijn weergegeven in figuur 2. </li><li> Controleer de verschillende stadia bij de oogst pod volgens de criteria zoals in Tabel 1. Meet de verstreken tijd van stap 6 tot afzonderlijke fasen 6 en 7 (Tabel 2) te helpen. </li></ol></li><li> Ontleden eitjes van peulen en het controleren van het embryonale stadium <ol><li> Isoleer eitjes van peulen met behulp van fijne tang alleen of een stereo dissectiemicroscoop en een tang nodig. Indien nodig kan de embryonale stadium kan snel worden gecontroleerd met behulp van een standaard samengestelde microscoop (Figuur 3B). </li><li> Bereid gewijzigd Hoyer&#39;s oplossing met 7,5 g Arabische gom, 100 g chloralhydraat, 5 ml glycerol, 60 ml gedeïoniseerd gedestilleerd water. Ontbinden door roeren gedurende 3-5 uur of &#39;s nachts. </li><li> Voor meer verfijnend microscopie duidelijk de ontleed eitjes in gewijzigde Hoyer&#39;s oplossing 15,16. Pick voorzichtig de intacte zaadknoppen en in een klein volume Hoyer-oplossing (genoeg om de eicel te dekken) bij kamertemperatuur tot helder. </li><li> Bekijk de monsters met differentiële interferentie contrast (DIC) optiek. Vastleggen van de beelden iwth een digitale camera 9 (figuur 2). </li><li> Verkrijgen van de meest gelijkmatige zaadknoppen uit het centrale gebied van de pod en accumuleren van het gewenste aantal. Een voorbeeld is getoond in figuur 3A. Verzamel de zaadknoppen op ijs en bewaar bij vereiste temperatuur (-80 ° C nucleïnezuren) voor verdere analyse. LET OP: Voor meer informatie over de analyse van histologische secties, transmissie-elektronenmicroscopie en in situ hybridisatie zie papers 8,9. </li></ol></li></ol> 2. Somatische Embryo Development In Vitro <ol><li> Gebruik een M. truncatula cultivar thoed is in staat om gemakkelijk embryo&#39;s in de cultuur te vormen. Voor dit protocol voor bladexplantaten gebruiken 2HA planten 13,17 die 2-4 maanden oud zijn. </li><li> Neem folders uit de laatste bijna volledig uitgebreid trifoliate blad van een stam verlengen. </li><li> Houd de trifoliate bladeren op vochtig papier badstof in een cultuur pot om uitdroging te voorkomen. OPMERKING: Zodra de trifoliate bladeren worden geoogst die ze nodig hebben om te worden gebruikt met een minimale vertraging. </li><li> Bereiding van het cultuurmedium <ol><li> Met de P4 10: 4: 1: 5 medium agar (0,8% w: v) in 9 cm petrischalen. OPMERKING: De P4 10: 4: 1: 5 medium uit de P4 basismedium 18 plus 10 uM 1-naftaleenazijnzuur (NAA), 4 uM 6-benzylaminopurine (BAP), 1 uM abscisinezuur (ABA) en 5 uM gibberellinezuur acid (GA). Het gebruik van GA + ABA versnelt embryovorming en veroorzaakt substantiële toename embryo nummer 14. </li><li> Maak de de P4 basale medium in 1 L; bestaande uit grote zouten (maak Calcium up afzonderlijk), minder belangrijke zouten en vitamines (tabel 3), gecheleerd ijzer (make-up los), casaminozuren (caseïnehydrolysaat), 30 g sucrose, 8 g agar. </li><li> WINKEL voorraadoplossingen van belangrijke zouten, calcium, casaminozuren, kleine zouten en vitamines bij -20 ° C in geschikte hoeveelheden. Bewaar gechelateerd ijzer bij 4 ° C. </li><li> Maak de gechelateerde ijzer (200x) door het oplossen van 7,44 g Na 2 EDTA • 2 H 2 O in ongeveer 900 ml gedeïoniseerd gedestilleerd water al roerend, breng dan de oplossing voor 98-99 ° C, terwijl het toevoegen van 1,853 g FeSO 4 • 7H 2 O. Eindelijk tot 1 L wanneer de ingrediënten worden opgelost. Bewaren in amberkleurige flesjes bij 4 ° C. </li><li> Vul de P4 basismedium de voorraadoplossingen zoals in tabel 4. De hormonen in het medium zijn 10 uM NAA, 4 BAP uM, 1 uM ABA, 5 uM GA (zie Tabel 4 en Tabel Specific Materials). Voeg de NAAen BAP voorafgaand aan autoclaveren toevoegen ABA en GA na autoclaveren en afkoelen tot ongeveer 55 ° C, met behulp filtersterilisatie met een 0,22 urn filter bevestigd aan een injectiespuit. Meng goed door voorzichtig zwenken. </li><li> Stel de media op pH 5,8 met 1 M KOH voorafgaand aan autoclaveren. Autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 min. </li><li> Na autoclaveren voeg de filter gesteriliseerd ABA en GA, en giet ongeveer 25 ml van de media in steriele 9 cm petrischalen in een laminaire stroming kap of biohazard kast. Cool en laat de agar ingesteld met de deksel. Dan zet op het deksel en zorg ervoor dat er geen condens op het deksel. Label wens in en bewaar bij 4 ° C (in een kartonnen doos met deksel condensaat). </li></ol></li><li> Sterilisatie van Leaf Tissue <ol><li> Werk in een UV-gesteriliseerde laminaire stroming kap of biohazard kast. </li><li> Plaats verlaat in de maas bal van een eerder geautoclaveerd voorjaar thee-ei. </li><li> Dompel thee-ei met de bladeren in de 70% (v: v) ethanol in een culture pot gedurende 30 sec. NB: Voor alle stappen in deze procedure 250 ml schroefdop polycarbonaat cultuur potten die worden geautoclaveerd. </li><li> Uitlekken en vervolgens over te dragen en dompel het blad weefsel in 1: 8 (v: v) verdund bleekwater (0,5% chloor) gedurende 10 min. Roer voorzichtig van tijd tot tijd. </li><li> Giet het bleekmiddel en breng de thee-ei in een cultuur pot met steriel gedemineraliseerd gedestilleerd water. Zwenk en afvoer overtollig water. Herhaal dit nog een keer met een verse cultuur pot van steriel gedemineraliseerd gedestilleerd water. </li><li> Verwijder de bladeren van de thee-ei met een steriel pincet om een ​​nieuwe cultuur pot van steriel gedemineraliseerd gedestilleerd water. Schroef de steriele dop en spoel door het omkeren en wervelende. Laat bladeren drijvend op het steriel water totdat klaar om explantaten bereiden. </li></ol></li><li> Voorbereiden en Plating Explantaten <ol><li> Met behulp van steriele technieken, trim individuele gesteriliseerde folders van de rand met een scalpel, en snijd de resterende rechthoek in twee of THRee rechthoekige explantaten (8-10 x 3-5 mm) bij het ​​midden van de ader in het midden van elk explantaat (figuur 5A). LET OP: De grootte van de explant is heel belangrijk in de inleiding van de eerste callusing. Voer de snijden op steriele deksels van take-away voedsel containers. </li><li> Plaat 6 explantaten on-agar gestold kweekmedium in 9 cm diameter petrischalen (Figuur 5B). Plate de explantaten abaxiale beneden de gebruikelijke blad oriëntatie te behouden. </li><li> Sluit de Petri gerechten met Parafilm (figuur 5C) gespannen rond het gerecht. Het weefsel is nu klaar voor incubatie. </li></ol></li><li> Tissue Incubation <ol><li> Incubeer de platen in het donker bij 28 ° C in een gecontroleerde temperatuur ruimte of groeikast gedurende de kweekperiode. OPMERKING: De explantaten zal dedifferentiation initiëren, ondergaan celdeling, proliferatie (eeltvorming) en embryogenese (differentiatie). </li><li> Subcultuur de differentiërende TOELICHTInts na 3 weken op vers medium. Op dit subcultuur breng de gehele explantaat met een steriele roestvrijstalen spatel en pincet, in een laminaire stroming kap of biologisch kast. Als callusing optreedt en het callus de grootte van de grootste in figuur 5C overschrijdt overdracht 50% van de afzonderlijke callus bij doorkweken op vers medium. </li><li> Let op de eerste embryo&#39;s in ongeveer 4 weken. Hoewel er een zekere mate van synchroon, het verzamelen van verschillende embryo stadia over een 4-8 week incubatieperiode (Figuur 6A, B). Verzamel onder een dissectie microscoop Werkwijze volgens experimentele doeleinden. </li><li> Subcultuur elke 3 weken en verwijder embryo periodiek zodat de explantaten blijven embryo&#39;s gedurende 3 maanden. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gepts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legumes+as+a+model+plant+family.+Genomics+for+food+and+feed+report+of+the+cross-legume+advances+through+genomics+conference%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference.</a> Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).</li>
<li>Graham, P. H., Vance, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legumes%3A+importance+and+constraints+to+greater+use%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Legumes: importance and constraints to greater use.</a> Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).</li>
<li>Young, N. D., Udvardi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+Medicago+truncatula+genomics+to+crop+legumes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).</li>
<li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medicago+genome+provides+insights+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).</li>
<li>Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+Medicago+truncatula+seed+development+establishes+the+time+frame+of+diverse+metabolic+processes+related+to+reserve+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation.</a> Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).</li>
<li>Verdier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+M.+truncatula+transcription+factors+identifies+putative+regulators+of+grain+legume+seed+filling%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling.</a> Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).</li>
<li>Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-genomic+studies+of+developmental+processes+in+legume+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).</li>
<li>Wang, X. -D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+embryo+sac+to+oil+and+protein+bodies%3A+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).</li>
<li>Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+early+embryo+development+in+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula.</a> Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).</li>
<li>Mansfield, S. G., Briarty, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryogenesis+in+Arabidopsis+thaliana.+2.+The+developing+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Botany%22%5BJournal%5D)">Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo.</a> Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).</li>
<li>Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+regulation+of+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs.</a> Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).</li>
<li>Birnbaum, K. D., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slicing+across+kingdoms%3A+regeneration+in+plants+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals.</a> Cell. 132 (4), 697-710 (2008).</li>
<li>Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+highly+regenerable+seed+line+Jemalong+2HA+for+transformation+of+Medicagotruncatula+-+implications+for+regenerability+via+somatic+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis.</a> J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).</li>
<li>Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unusual+ABA+and+GA+synergism+increases+somatic+embryogenesis%2C+facilitates+its+genetic+analysis+and+improves+transformation+in+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula.</a> PloS ONE. 9 (6), e99908(2014).</li>
<li>Liu, C. M., Meinke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+titan+mutants+of+Arabidopsis+are+disrupted+in+mitosis+and+cell+cycle+control+during+seed+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development.</a> Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).</li>
<li>Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+SOMATIC+EMBRYOGENESIS+RECEPTOR-LIKE+KINASE+1+%28SERK1%29+gene+is+associated+with+developmental+change+in+the+life+cycle+of+the+model+legume+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula.</a> J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).</li>
<li>Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., et al. Somatic embryogenesis from leaf explants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIantcheva%2C+A+%22The+Medicago+truncatula+handbook%22">The Medicago truncatula handbook</a>. Mathesius, U. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://www.noble.org/MedicagoHandbook">http://www.noble.org/MedicagoHandbook</a> (2006).</li>
<li>Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+interspecific+somatic+hybrids+of+Medicago+by+using+Agrobacterium+transformed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues.</a> Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).</li>
<li>Ochatt, S. J. Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOchatt%2C+SJ+%22Plant+Embryo+Culture%3A+Methodsand+Protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology%22">Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology</a>. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Springer protocols, Humana press. 39-52 (2011).</li>
<li>Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+MtSERF1+of+the+ERF+subfamily+identified+by+transcriptional+profiling+is+required+for+somatic+embryogenesis+induced+by+auxin+plus+cytokinin+in+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen hebben.

De beschreven protocollen zijn relatief ongecompliceerd en laat onderzoek van peulvruchten embryogenese met alle hedendaagse cel en moleculaire technieken. We erkennen dat er voordelen en nadelen van zowel in vivo en in vitro methoden. Beide kunnen meer nadruk op de vroege embryogenese in vergelijking met de cultuur van onrijpe zaden 19. Voor in vivo studies wat beschreven is hoofdzakelijk het isoleren van de eicel van de huls die geschikt is voor veel e...

Peulvruchten zijn de derde grootste familie van hogere planten met ongeveer 20.000 soorten en de vlinderbloemigen (of Fabaceae) familie zijn tweede granen in geoogste oppervlakte en de totale productie 1. Soja is de derde grootste gecultiveerde gewas. Peulvruchten geven ongeveer een derde van eiwitten en een derde van plantaardige spijsolie 2. Peulvruchten met hun N 2 vaststellen capaciteit ook bijdragen aan duurzame landbouwsystemen. Medicago truncatula, zoals soja, winkels eiwit en olie in de zaadlobben van de zaden en het is een genetische en genomische peulvruchten model met een aanzienlijke genetische en genomische hulpbronnen 3,4. Terwijl M. truncatula heeft vooruitgang mogelijk in het begrijpen van de peulvruchten-Rhizobium symbiose 4 het is in toenemende mate gebruikt om zaad van vlinderbloemigen biologie 5-7 en embryogenese 8,9 bestuderen. Arabidopsis embryogenese is uitgebreid bestudeerd 10,11 maar iksa niet-vlinderbloemige en de details van de embryogenese niet identiek zijn aan Medicago 8,10. Zygotische embryogenese in M. truncatula heeft interessante functies, met een onderscheidend meercellige hypofyse, een endoployploid suspensor en basale overdracht cel 8. Somatische embryogenese (SE) wordt vaak gebruikt voor het regenereren van planten 12. In de peulvruchten model M. truncatula, het zaad lijn Jemalong 2HA (2HA) is ontwikkeld vanuit de ouder Jemalong om hoge tarieven van somatische embryogenese 13 hebben. Het aantal embryo&#39;s is onlangs inhoudelijk verhoogd waarbij zowel gibberellinezuur (GA) en abscisinezuur (ABA) op de lang bestaande medium 14. In dit geval GA en ABA daad synergetisch, wat ongebruikelijk is gezien het feit dat Georgië en ABA meestal antagonistisch 14 treden. De hoeveelheid uit callus embryo ontwikkeld op het oppervlak waarmee het stadium van embryogenese gemakkelijk te bepalen Visually en snel geoogst. Met buurt isogene lijnen die embryogene (2HA) en niet-embryogene (Jemalong) zijn vergemakkelijkt het onderzoek naar somatische embryogenese en met zowel in vivo als in vitro systemen biedt verschillende experimentele mogelijkheden. Het begrijpen van de cellulaire en moleculaire mechanismen van embryonale ontwikkeling is essentieel voor het begrijpen zaden en ontwikkeling van de plant. In peulvruchten, zoals in andere dicotylen is de zaadlobben van het embryo dat de producten die worden gebruikt voor menselijke voeding slaan. Vroege embryogenese impliceert snelle celdeling, en de juiste embryo patroonvorming. Ongeveer 8 dagen na de bevruchting, de m truncatula embryo bereikt zaadlob vroeg stadium. De morfologische karakterisering is niet precies aangegeven dagen na de bevruchting in de kas omstandigheden. Aldus wordt een efficiënte standaardbenadering het stadium van ontwikkeling van embryo geven waardevol in het bestuderen van de genetische Regulatie van de vroege zygotische embryogenese. In dit artikel geven we twee gestandaardiseerde protocollen voor de ontwikkeling van embryo&#39;s voor biologische studies van embryogenese te verzamelen in de peulvruchten model M. truncatula. De eerste is om zygotische embryo&#39;s te verzamelen door het te associëren embryogenese en pod morfologie, terwijl de tweede is somatische embryogenese via kweken bladexplantaten te gemakkelijk bereikbaar grote aantallen embryo te bieden.

<table><tbody><tr><td>P4 medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Gebruik Sigma-Aldrich Chemicals of andere leverancier van analytische kwaliteit</td></tr><tr><td>Major salts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minor salts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitamins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bacto Laboratories</td><td>214010</td><td>Bacto agar</td></tr><tr><td>Plant hormones</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Naphthaleneacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0640</td><td>Los op in een kleine hoeveelheid 1 M NaOH</td></tr><tr><td>Abscisic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1049</td><td>Los op in een kleine hoeveelheid 1 M NaOH</td></tr><tr><td>6-Benzylaminopurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3274</td><td>Los op in MQ-water met verwarming en enkele druppels 1N HCl</td></tr><tr><td>Gibberellic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7645</td><td>Los op in een kleine hoeveelheid ethanol</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>MZFLIII</td><td>Of vergelijkbaar</td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Zeiss</td><td>Axiophot</td><td>Of vergelijkbaar, met geschikte optica</td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam HRc</td><td>Of vergelijkbaar</td></tr><tr><td>Sterilising leaves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid</td><td>SARSTEDT</td><td>75.9922.519</td><td>Autoklaveerbaar</td></tr></tbody></table>

protocollen voor het verkrijgen zygotic en somatische embryo&#39;s voor het bestuderen van de verordening van de vroege embryo ontwikkeling in de model legume<em&gt; medicago truncatula</em

Protocols for Obtaining Zygotic and Somatic Embryos for Studying the Regulation of Early Embryo Development in the Model Legume Medicago truncatula

Vroege embryogenese uitgaande van een enkele cel zygote doorloopt snelle celdeling en morfogenese, en wordt morfologisch gekenmerkt door pre-bolvormige, bolvormig, hart, torpedo en cotyledon fasen. Deze geleidelijke ontwikkeling is onder de strakke regulering van een complexe moleculaire netwerk. Oogsten voldoende vroege embryo&#39;s in een soortgelijk stadium van de ontwikkeling is van essentieel belang voor het onderzoek naar de cellulaire en moleculaire regulatie van de vroege embryogenese. Dit is niet eenvoudig omdat de vroege embryogenese ondergaat snelle morfogenese in korte tijd bijvoorbeeld 8 dagen voor Medicago truncatula aan het begin van de zaadlob stadium te bereiken. Hier pakken we het probleem op door twee benaderingen. De eerste wordt een koppeling tussen embryonale ontwikkeling en pod morfologie helpen geven de fase van de zygotische embryo. Dit is met name gebaseerd op het aantal pod spiralen en de ontwikkeling van de stekels. Een alternatieve manier om een aanvulling op de in vivo studies is via kweken bladexplantaten somatische embryo&#39;s. Het medium omvat een ongewone combinatie hormoon - Een auxine (1-naftaleenazijnzuur), een cytokinine (6-benzylaminopurine), abscisinezuur en gibberellinezuur. De verschillende stadia te onderscheiden groeien uit de eelt zonder dissectie.

Voor zygotische embryogenese verschillende pod structuren die overeenkomen met de verschillende embryonale stadia worden getoond in Figuur 1A - F terwijl de verschillende embryonale stadia worden getoond in Figuur 2A - F. Door het selecteren pods in hetzelfde stadium monsters eicellen die vrij uniform kan worden verkregen (figuur 3A). Door het gebruik van RT-qPCR embryo specifieke genen gemakkelijk kan worden gedetecteerd en tijdsverloo...

Het doel is om te illustreren dat het model-legume Medicago truncatula gemakkelijk kan worden gebruikt om de regulatie van vroege plantenembryogenese te onderzoeken als aanvulling op het niet-legume Arabidopsis-model. De morfologie van peulen is gekoppeld aan stadia van zygotische embryogenese en er wordt ook een protocol gegeven om embryo's te verzamelen met behulp van weefselkweek.

Protocollen voor het verkrijgen Zygotic en somatische embryo&#39;s voor het bestuderen van de verordening van de vroege embryo ontwikkeling in de Model Legume<em&gt; Medicago truncatula</em

Early embryogenesis starting from a single cell zygote goes through rapid cell division and morphogenesis, and is morphologically characterized by ...

Het algemene doel van de volgende procedures is om aan te tonen hoeveel embryo's van cargo tula verkregen kunnen worden in verschillende ontwikkelingsstadia om de genetische regulatie van embryogenese bij planten te onderzoeken; dit kan worden bereikt door de morfologie van de peul te koppelen aan de verschillende ontwikkelingsstadia van het zygote embryo, en door bladexplanten te kweken om somatische embryo's in de verschillende stadia te verkrijgen. Uiteindelijk kunnen kwantitatieve PCR en bèta-glucuronidase worden gebruikt om de expressie van genen tijdens de embryogenese in de specifieke ontwikkelingsstadia van belang te beoordelen. De voordelen van deze technieken zijn dat markering van individuele bloemen niet vereist is voor de in vivo experimenten, en dat de geoptimaliseerde in vitro procedures complementaire experimentele benaderingen bieden.Een visuele demonstratie van de kweekprocedure is belangrijk omdat hierdoor de details van de manipulaties nauwkeuriger kunnen worden gevolgd. De in vivo procedure zal worden gedemonstreerd door Wang, terwijl Kim Nolan de in vitro procedure zal demonstreren. Om de ontwikkeling van zygote embryo's te vergemakkelijken, doorboort u het oppervlak van de zaadhuizen van zaden van een Monte cargo trinoculaire plant en weekt u de zaden gedurende de nacht, volledig ondergedompeld in water.Zaai de volgende dag drie zaden in elk van 10 potten met een diameter van 15 centimeter gevuld met potgrond en plaats de potten in een glazen kas. Kweek de planten onder een fotoperiode van 14 uur met een dag-nachttemperatuur van 23 tot 19 graden Celsius. Behoud na kieming de gezondste zaailingen, zodat er één plant per pot overblijft, en plaats trellis rond de zaailingen zodat de plantstengels kunnen klimmen wanneer de peulen verschijnen. Oogst in de juiste stadia zoals beschreven in tabel 1 en figuur 1 om het gewenste vroege stadium van embryo-ontwikkeling te verkrijgen.Gebruik vervolgens een pincet om de zaden uit de peulen te isoleren. Voor meer verfijnde microscopie kunnen de embryonale stadia worden bevestigd door de embryo's, na volledige inklearing in Hoyer-oplossing, af te beelden onder een standaard lichtmicroscoop. Verzamel daarna het benodigde aantal UL voor het experiment uit het centrale deel van de peul en bewaar deze bij de juiste temperatuur voor verdere analyse van de somatische embryo-ontwikkeling.Oogst in vitro deelblaadjes van het nieuwste, bijna volledig ontplooide tate-blad van een uitgroeiende stengel van een tran atula-cultivar die in staat is om gemakkelijk embryo's te vormen in culture. Bewaar de tate-bladeren op vochtig keukenpapier in een culturepot om uitdroging te voorkomen. Plaats de bladeren vervolgens, terwijl u werkt in een UV-gesteriliseerde veiligheidskast, in de gaasbal van een autoclaafbestendige thee-infuser.Een ondergedompelde infuseerder in 70% Ethanol in een autoclaaf van 250 milliliter met schroefdop. Polycarbonaat kweekpot na 30 seconden, giet het bladweefsel af en dompel de infuseerder vervolgens gedurende 10 minuten onder in een in één op acht verdunde bleekoplossing. Draai de pot voorzichtig af met af en toe zachtjes rondwalsen en giet het overtollige water af.Spoel vervolgens de theeëzeer. Doe dit nogmaals met vers gedeïoniseerd water in een nieuwe pot. Gebruik nu steriele pincetten om de bladeren vanuit de theeëzeer over te brengen naar een nieuwe cultuurpot met steriel gedeïoniseerd gedestilleerd water en draai de steriele dop erop.Spoel vervolgens de bladeren door middel van omkeren en draaien. Laat de deelblaadjes daarna drijven op het steriele water om de implantaten uit te platen. Trim de randen van de afzonderlijke gesteriliseerde deelblaadjes met behulp van een steriele techniek.Snijd vervolgens de overgebleven rechthoek in twee of drie rechthoekige explantaten van 8 tot 10 bij 3 tot 5 millimeter, waarbij de middennerf in het centrum van elk explantaat ligt. Plaats zes explantaten per agar-gestold culturemedium in Petrischalen van negen centimeter diameter, met de ABA-zijde naar beneden om de gebruikelijke bladoriëntatie te behouden.Verzegel vervolgens de Petrischalen met Parafilm en incubeer de platen in het donker bij 28 degrees Celsius in een kamer met een gecontroleerde temperatuur. Gebruik na drie weken een steriele spatel van roestvrij staal en een pincet om de differentiërende gat-explantaten over te zaaien op vers medium. De eerste embryo's zouden na ongeveer vier weken waargenomen moeten worden wanneer callusvorming optreedt en de callus groter wordt dan het grootste explantaat dat hier wordt getoond.Transfer slechts 50% van de individuele callus bij subcultuur naar vers medium. Gebruik tenslotte een stereomicroscoop om de verschillende embryostadia gedurende een incubatieperiode van vier tot acht weken te verzamelen, waarbij de explantaten worden verwerkt volgens de experimentele doelstellingen. Na het oogsten van zygotische embryo's, zoals zojuist gedemonstreerd, kunnen stroomafwaarts C2-hybridisatie of andere passende strategieën worden aangewend; van bijzonder belang is, zoals in deze afbeeldingen te zien is, dat het onderscheid tussen SSIS en Spencer kan worden waargenomen door de geplaatste explantaten te volgen.Gedurende week vier tot en met acht kunnen somatische embryo's in verschillende stadia worden gelokaliseerd en geselecteerd voor directe analyse. Deze gegevens illustreren bijvoorbeeld hoe embryo's in het vroege Olein-stadium de expressie vertonen van één type medicago Tula eoin-gen, maar niet van een ander. Een specifiek voordeel van het somatische embryosysteem is dat transformatie van de callus kan worden uitgevoerd zonder dat er een volledige plant geregenereerd hoeft te worden.Dat is inderdaad het geval, zoals hier aangetoond. Beta-glucuronidase kan worden gebruikt om genexpressie te visualiseren tijdens de verschillende stadia van de embryogenese. Na het bekijken van de video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de pod selecteert en ontleedt om Andres te verkrijgen.U dient daarnaast een goede kennis te hebben van het voorbereiden en uitplaten van steriele explanten voor somatische embryogenese na hun ontwikkeling. Deze technieken hebben het mogelijk gemaakt om de transcriptieregulatie van de vroege stadia van embryogenese te onderzoeken in relatie tot de groei, ontwikkeling en voedingsopslag van het embryo.

protocols-for-obtaining-zygotic-somatic-embryos-for-studying

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Wij rapporteren een efficiënte en eenvoudige methode om embryo's te isoleren in een vroeg stadium van de ontwikkeling...

Efficiënte en snelle isolatie van een vroeg stadium embryo&#39;s van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Zaden

De zebravink (Taeniopygiaguttata) is een waardevol modelorganisme; de vroege stadia van de ontwikkeling van de zebravink zijn echter niet uitgebreid bestudeerd. Het protocol beschrijft hoe vroege embryo's te disseceren voor ontwikkelings- en moleculaire toepassingen.

Dissectie en Downstream Analyse van Zebravinken embryo&#39;s in een vroeg stadium van ontwikkeling

Methoden die morphant embryo's zijn essentieel voor ontwikkelingsstoornissen mechanismen en gen-regulatorische netwerken te bestuderen. De zee ster Patiria miniata is een opkomende modelsysteem voor deze studies. Hier presenteren we een protocol voor het verkrijgen van gameten, producerende culturen van embryo's, en snelle micro-injectie van zygoten van deze soort.

Een methode voor micro-injectie van Patiria Minata Zygotes

Het in beeld brengen van het dynamisch gedrag van organellen en andere subcellulaire structuren in vivo kan licht werpen op hun functie in fysiologische en ziektecondities. Hier presenteren we methoden voor het genetisch markeren van twee organellen, centrosomen en mitochondriën, en het in beeld brengen van hun dynamiek in levende zebravis-embryo's met behulp van breedveld- en confocale microscopie.

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

Dit protocol beschrijft een methode voor de waarneming van de embryogenese Arabidopsis via zaadknop goedkeuring, gevolgd door de inspectie van embryo patroonformatie onder een microscoop.

Een methode voor het karakteriseren van de embryogenese Arabidopsis

Dit manuscript beschrijft een in vitro zaadknop cultivatiemethode die het mogelijk live-cel beeldvorming van Arabidopsis zygoten en embryo's maakt. Deze methode wordt gebruikt om te visualiseren de intracellulaire dynamiek tijdens de zygote polarisatie en de cel lot specificatie bij de ontwikkeling van de embryo's.

In Vitro Zaadknop teelt voor Live-cel Imaging van Zygote polarisatie en Embryo patronen in Arabidopsis thaliana

Plant morfogene genen kunnen worden gebruikt om de genetische transformatie van recalcitrante genotypes te verbeteren. Hier beschreven is een Agrobacterium-gemedieerde genetische transformatie (QuickCorn) protocol voor drie belangrijke openbare maïs inteelt lijnen.

Agrobacterium-Gemedeerde onrijpe embryotransformatie van recalcitrante maïsinteeltlijnen met behulp van morfogene genen

Dit artikel stelt een pijplijn op voor hoogwaardige eencellige en kernsuspensies van gastrulerende muizenembryo's voor sequencing van individuele cellen en kernen.

Single-cell RNA-sequencing van gemuteerde hele muizenembryo's: van de epiblast tot het einde van de gastrulatie

We beschrijven methoden om beginnende transcriptie te visualiseren tijdens de activatie van het zygotische genoom in individuele cellen tijdens de vroege embryogenese.

Visualisering van activatie van het zygotische genoom in individuele cellen van vroege embryo's

We beschrijven een fysieke constrictiemethode om mini-embryo's te maken van Xenopus laevis 1-cel embryo's.

Fysieke manipulatie om Xenopus mini-embryo's te genereren

Leer protocollen voor het verkrijgen van zygote en somatische embryo's bij Medicago truncatula. Deze methoden koppelen peulmorfologie aan embryonale stadia en gebruiken weefselkweek voor genexpressie-analyse.

Protocollen voor het verkrijgen Zygotic en somatische embryos voor het bestuderen van de verordening van de vroege embryo ontwikkeling in de Model Legume Medicago truncatula (Video) | JoVE Journal

Protocollen voor het verkrijgen Zygotic en somatische embryo's voor het bestuderen van de verordening van de vroege embryo ontwikkeling in de Model Legume

Meer video's verkennen