Weefselverwerking en isolatie van primaire fibroblasten uit de menselijke vagina

Onderzoek naar aandoeningen die vooral mensen van het vrouwelijk geslacht treffen, is onderbelicht en ondergefinancierd. Verzakking van het bekkenorgaan is de aandoening die sterk wordt geassocieerd met het vrouwelijk geslacht. Het treedt op wanneer spieren en ligamenten verzwakken en ervoor zorgen dat bekkenorganen lager in het bekken vallen, waardoor een uitstulping in de vagina ontstaat.

Er is weinig bekend over cellulaire interacties in de context van deze pathofysiologie, noch over hoe factoren op weefselniveau het succes van chirurgische ingrepen beïnvloeden. Isolatie van primaire fibroblasten uit de menselijke vagina kan nuttig zijn voor het bestuderen van biologische mechanismen die ten grondslag liggen aan verzakking van bekkenorganen. Verzakking van het bekkenorgaan treft vaak oudere of postmenopauzale personen.

Isolatie en proliferatie van primaire fibroblasten, onderzoek naar deze aandoening is een uitdaging vanwege verminderde celpopulaties en het klonogene vermogen van oudere donoren. De meeste artikelen met menselijke vaginale monsters gebruiken weefsel van premenopauzale personen met een verzakking van het bekkenorgaan. Hoewel een paar artikelen het gebruik van monsters van zowel premenopauzale als postmenopauzale personen rapporteerden, beschreven ze niet in voldoende detail het protocol dat werd gebruikt om fibroblasten met succes te isoleren van oudere of postmenopauzale donoren.

Isolatie en ziektemodellering met behulp van fibroblasten uit postmenopauzaal weefsel kunnen essentieel zijn voor het begrijpen van de cellulaire pathofysiologie van bekkenorgaanverzakking, aangezien deze aandoening de hoogste prevalentie heeft bij individuen in het decennium na de menopauze, We beschrijven een methode voor isolatie en kweek van een met fibroblasten verrijkte eencellige suspensie uit menselijk vaginaal weefsel met behulp van een combinatie van mechanische en enzymatische dissociatie. Dit artikel beschrijft een betrouwbaar protocol voor het verkrijgen van postmenopauzale of verouderende menselijke vaginale fibroblasten. Geoogste weefsels werden histologisch geanalyseerd om het protocol te valideren.

Meet en snijd het weefsel tot een grootte van ongeveer een centimeter in het kwadraat. Zorg voor een nauwkeurige meting van de biopsiegrootte. Bereid twee tot drie extra vaginale biopsieën voor, meet elk een centimeter in het kwadraat van een enkele donor en leg de biopsieën opzij.

Nadat u de vaginale biopsie in een petrischaal van een celkweek hebt geplaatst, snijdt u het vaginale weefsel in kleine fragmenten met behulp van twee steriele scalpels. Zorg ervoor dat de punten van de messen loodrecht op het oppervlak van het weefsel staan. Oefen gelijkmatige en gelijkmatige druk uit op het weefseloppervlak met behulp van twee scalpels.

Voer een afwisselende trekkende actie uit om de weefsels in zeer kleine stukjes te snijden. Herhaal deze haktechniek met behulp van twee scalpels totdat het monster een uniforme consistentie heeft met stukjes van één tot twee millimeter. Voeg twee tot drie milliliter serumvrije celkweekmedia toe aan de plaat en suspendeer het gehakte weefsel.

Pipeteer de oplossing met weefselfragmenten op en neer om eventuele klonten te breken. Breng de oplossing met weefselfragmenten over in een conische buis van 15 milliliter. Voeg extra serumvrije celkweekmedia toe tot het totale volume 10 milliliter is.

Bewaar Liberase in aliquots van 230 microliter voor gebruik. Voeg 230 microliter Liberace toe aan de buis. Incubeer de buisjes gedurende drie uur bij 37 graden Celsius met constante krachtige beweging, met behulp van een monstermixer.

Zorg voor constante agitatie. Draai de buizen met tussenpozen van 30 minuten tijdens de incubatie. Centrifugeer de monsters gedurende vijf minuten bij 3000 G. Verwijder het supernatant en gooi het weg.

Resuspendeer de pellet in één tot twee milliliter celkweekmedia met 10%foetaal runderserum om de Libase te verdunnen. Pipetteer krachtig totdat de pellet volledig is geresuspendeerd. Zeef de weefselenzymsuspensie door de oplossing voorzichtig over de celzeef te pipetteren.

Trek celsuspensies uit meerdere weefselbiopten van dezelfde donor samen. Druk met de zuiger van een steriele spuit van vijf milliliter door de weefselenzymsuspensie over de zeef. Herhaal deze stap totdat de resterende weefselfragmenten volledig lijken te zijn doorgedrukt.

Plaat getrokken celsuspensie van meerdere vaginale biopsieën van dezelfde donor op een enkele petrischaal. Na een nacht incubatie bij 37 graden Celsius, observeer je de cellen met een fasecontrastmicroscoop. Zorg ervoor dat de microscoop op de bodem van de plaat is gericht.

Een klein aantal fibroblasten zal aan de bodem worden bevestigd. Hier is een schematische weergave van het protocol, met de belangrijkste stappen. Figuur twee toont een fasecontrastbeeld van zwevende cellen op dag nul.

Figuur drie is een fasecontrastbeeld van vaginale primaire fibroblasten op dag 14 van de kweek bij een vergroting van 100x van een getrokken suspensie van drie weefselbiopten van een centimeter in het vierkant. Tabel één toont de resultaten van het gebruik van andere protocollen om vaginale fibroblasten te isoleren in deze huidige studie. Fibroblasten werden geïdentificeerd door positieve kleuring van het menton.

Immunofluorescentieanalyse werd uitgevoerd op premenopauzale en postmenopauzale vaginale weefsels die hier worden getoond. De foto's zijn gemaakt met een vergroting van 200x. Geïsoleerde fibroblasten werden ook gekleurd met alfa-gladde spieractine en F-actine in premenopauzale en postmenopauzale weefselmonsters.

We ontwikkelden een geoptimaliseerd en betrouwbaar protocol voor de isolatie van primaire fibroblasten uit het vaginale slijmvlies bij oudere donoren. Het gebruik van eerder gepubliceerde protocollen voor dierlijk en menselijk weefsel voor dissociatie van primaire cellen slaagde er in deze studie niet in om fibroblasten uit menselijke vaginale monsters te extraheren. We veronderstellen twee waarschijnlijke redenen voor uitdagingen van celdissociatie van menselijk vaginaal weefsel.

De huiddikte van het slijmvlies is groter bij oudere donoren en in vergelijking met die van niet-mucosale weefsel, en de dichtheid van fibroblasten kan aanzienlijk verminderd zijn bij oudere personen. Een paar kritieke stappen mogen niet worden gewijzigd. De implementatie van een zeer rigoureuze mechanische spijsvertering, met behulp van de techniek met twee scalpels, en het samenbrengen van de celsuspensies van drie tot vier biopsieën van volledige dikte van een enkele donor.

Ons protocol heeft een duidelijk voordeel. De mechanische en enzymatische vertering leiden tot betere opbrengsten voor postmenopauzaal weefsel, maar hebben geen negatieve invloed op premenopauzale monsters. We erkennen verschillende beperkingen van ons protocol.

Toegang tot menselijk vaginaal weefsel kan een uitdaging zijn in situaties waarin vaginale verzakkingschirurgie niet wordt uitgevoerd, en de noodzaak van het trekken van celsuspensies van meerdere weefselbiopsiemonsters kan ook een beperking zijn. Dit protocol voor het vereisen van menselijke vaginale fibroblasten zal een nuttig hulpmiddel zijn voor toekomstig onderzoek naar bekkenbodemaandoeningen, vooral bij postmenopauzale personen, evenals een belangrijke aanvulling op het onderzoek naar de gezondheid van vrouwen.