Geoptimaliseerde methode voor teelt en microbiële bioaugmentatie van Typha latifolia (lisdodde )

Ons werk richt zich op het ontbreken van protocollen voor het kweken van lisdstaart uit zaad. We ontwikkelden reproduceerbare methoden voor zaadkieming, vroege groei en microbiële bio-augmentatie ter ondersteuning van toekomstig onderzoek naar plantenmicroben. Weinig studies laten lisdodden uit zaad groeien of volgen ze tot de volwassenheid, maar lisdodden worden vaak gebruikt in onderzoek naar het saneren van moerasgebieden.

Het meeste lisdoddenonderzoek omvat het kopen van wortelstokken voor de vermeerdering van lisdodden in laboratoriumstudies. Weinig studies laten lisdodden uit zaad groeien, waardoor er geen gestandaardiseerde methoden overblijven. Het bereiken van consistente kieming en aanhoudende kolonisatie van geïntroduceerde microben is een grote uitdaging geweest.

We hebben reproduceerbare methoden ontwikkeld voor zaadkieming en microbiële bio-augmentatie, waarmee we aantonen hoe vroege inoculatie helpt bij langdurige kolonisatie. Om te beginnen gebruik je een tuinschaar om de stengel van een Typha latifolia-plant ongeveer twee centimeter van de basis van de bloeiwijze af te knippen. Haal de zaden van de bloeiwijze en doe ze over in een laboratoriumblender totdat de blender ongeveer 1/4 vol is, wat overeenkomt met ongeveer 250 milliliter onverdichte zaden.

Vul nu de blender met 500 milliliter kraanwater, zodat er een kopruimte van 10 centimeter behouden blijft. Meng het mengsel op middelmatig laag tempo gedurende 20 seconden en doe de stroperige inhoud direct over in een beker van één liter. Doe ongeveer 100 milliliter van het zaadwatermengsel terug in de blender.

Voeg daarna 400 tot 600 milliliter vers kraanwater toe en blend op middelhoge snelheid gedurende 20 seconden. Giet de inhoud in een verse beker van één liter. Vul nu de beker met kraanwater tot 800 milliliter.

Na 60 seconden te hebben laten staan, schep je het drijvende slib van bovenaf zonder de zaden die onderin zijn neergezet te verstoren. Giet langzaam het resterende water eruit en doe de zaden in een beker van 100 milliliter. Herhaal het blendproces voor het resterende zaadwaterslib. Leg vervolgens het bekerglas met de gescheiden zaden op een roerplaat.

Schep na het roeren eventueel drijvend plantmateriaal van het oppervlak van de beker. Giet de zaden in een Buchner-trechter met filterpapier aan een stofzuiger en laat ze een nacht drogen. Bewaar de gedroogde zaden bij 20 graden Celsius in 50 milliliter conische polypropyleenbuisjes.

Bereid halfsterke Murashige- en Skoog-mediaplaten voor met 1% fyto-agar. Doe ongeveer één milligram van de gedroogde zaden over in een 15 milliliter conische polypropyleenbuis. Voeg vervolgens 10 milliliter steriel dubbel gedestilleerd water toe aan de buis.

Plaats de buis op een orbitale shaker op middelhoge snelheid gedurende 10 minuten. Verwijder nu het water uit de buis en voeg vijf milliliter 0,1% polysorbaat 20-oplossing toe, bereid in steriel dubbel gedestilleerd water. Schud de buis op middelhoge snelheid gedurende 10 minuten.

Verwijder de polysorbaat 20-oplossing. Voer alle volgende stappen uit voor een vlam- of laminaire stroomkap. Vervang de oplossing door vijf milliliter 30% commerciële bleekmiddel en 0,025% polysorbaat 20-oplossing, bereid in steriel dubbel gedestilleerd water.

Vervang het supernatant door steriel dubbel gedestilleerd water. Schud daarna vijf minuten lang de buis op middelhoge snelheid. Na de derde spoeling draai je de buis 24 uur op lage snelheid om kieming te induceren.

De volgende dag verwijder je het overtollige water en zorg je dat er drie milliliter vloeistof in de buis zit. Knip nu aseptisch de punt van een 1000 microliter plastic pipettip af. Gebruik de uiteinde van de afgeknipte pipet om krachtig te pipeten en de zaden in de punt te laten hangen.

Leg de zaden en vloeistof op een halfsterke Murashige- en Skoog-agarbord. Draai het bord voorzichtig om de zaden gelijkmatig te verdelen. Wikkel de platen in een laboratoriumfolie en plaats ze vervolgens in een groeikamer met een 16 uur licht- en 8 uur donkercyclus bij 23 graden Celsius en 70% luchtvochtigheid.

Om lisdoddenzaden te inoculeren, steriliseer je zaden met polysorbaat 20 bleekmiddel en dubbel gedestilleerd water zoals gedemonstreerd. Meet de optische dichtheid van een nachtkweek van Luteimonas-isolat op 600 nanometer. Normaliseer de cultuur tot een absorptiewaarde van 1,0 door te verdunnen in kweekmedium.

Centrifugeer nu één milliliter van de cultuur op 9.300 G gedurende twee minuten. Verwijder het supernatant en suspendeer de pellet opnieuw in één milliliter PBS. Na het centrifugeren en opnieuw verwijderen van het supernatant, suspendeer je de bacteriële pellet opnieuw in één milliliter steriel dubbel gedestilleerd water.

Gebruik gesteriliseerde zaden en verdun het inoculum vervolgens met één tot tien verdunning met 0,025% organosilicone surfactieve stof in dezelfde buis. Schud de suspensie 24 uur op lage snelheid voordat het zaad kiemt. Begin met het vullen van een steriele plantengroeikamer met een grond naar keuze, voorbevochtigd met kraanwater.

Bedek de Luer lock tip met aluminiumfolie en autoclave het apparaat op een vloeistofcyclus gedurende 20 minuten. Vervolgens bevestigt men onder steriele omstandigheden een 0,2 micrometer filterunit aan de Luer-lockconnector op de groeikamer. Open de kamer en voeg 500 microliter filter, gesteriliseerd met 1%20 bij 20 bij 20 bij 20 meststof, toe aan de grond.

Meng de grond met een steriele spatel terwijl je tegelijkertijd steriel dubbel gedestilleerd water toevoegt om hydratatie te behouden zonder de bodem te verzadigen. Gebruik nu een steriel scheermesje om Murashige en Skoog agar van platen met een zwakke oude zaailing in vieren te snijden. Met een steriele spatel brengt u een agarsectie met zaailing over op de voorbereide grond in de groeikamer.

Breng de groeikamerunit over in een plantengroeiincubator, ingesteld op een 16 uur licht- en 8 uur donkercyclus bij 23 graden Celsius en 70% luchtvochtigheid. Volledige littekenvorming van Typha-zaden resulteerde in zichtbaar gescheiden zaadcomponenten, terwijl onvolledige littekenvorming de snavel bleef hechten en niet-geskarifiseerde zaden intact bleven. Het steriele hydrocultuursysteem is aangetoond de groei van lisdodden en Juncus-soorten, hier afgebeeld als Juncus, te ondersteunen, die tot een jaar in het steriele systeem werden gehandhaafd.

De hoogste zaadkiemingssnelheid van 20,8% werd waargenomen met de 30%-bleekmiddel en polysorbaat 20-methode, wat significant hoger was dan alle andere sterilisatiebehandelingen behalve de 1-uur chloorgasmethode die geen volledige zaadsterilisatie kon bereiken. Zeven dagen na littekenvorming ontwikkelden kiemende Typha-zaailingen zichtbare radicalen en scheutweefsel in de niet-steriele Petriplaatomgeving. Na de verplanting naar de grond vestigde een subset van Typha's zaailingen zich succesvol en produceerde binnen één tot twee weken nieuw scheutweefsel.

Na inoculatie met Luteimonas-soorten die een DsRed-plasmide droegen, werd rood fluorescerende bacteriële kolonisatie waargenomen in de wortels van de Typha-zaailing 16 dagen na de inenting.