High-throughput, robuuste en zeer tijdflexibele methode voor oppervlaktesterilisatie van Arabidopsis-zaden

Dit protocol verbetert de sterilisatie van het zaadoppervlak, een fundamentele stap in de functionele genomica van de modelsoort Arabidopsisthaliana. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn gemak en hoge doorvoer, waardoor de verwerking van honderden monsters per dag mogelijk is. Met enkele eenvoudige aanpassingen kan deze methode worden toegepast op vele andere model- en niet-modelplantensoorten.

Let voor nieuwe gebruikers op de temperatuur van het medium en de centrifugeersnelheid, omdat ze beide van cruciaal belang zijn voor het overleven van zaden. Bereid om te beginnen 70% ethanol door 95% technische ethanol toe te voegen aan gedestilleerd water en grondig te mengen. Bereid vervolgens 5% bleekoplossing door vijf milliliter huishoudelijk bleekmiddel toe te voegen aan 95 milliliter steriel gedestilleerd water.

Voeg vervolgens een paar druppels nonionisch wasmiddel toe aan de bleekoplossing en meng grondig. Bereid vervolgens murashige en skoog medium met halve sterkte door 2,2 gram MS medium poeder inclusief vitamines en 10 gram sucrose toe te voegen aan 800 milliliter gedestilleerd water. Stel de pH van het medium in op 5,7 met behulp van één molair kaliumhydroxide en breng het volume vervolgens op maximaal één liter met gedestilleerd water.

Aliquot 500 milliliter van het medium in een fles van één liter en voeg vier gram agar toe om een vast medium te bereiden. Laat het medium na het autoclaveren afkoelen tot 50 tot 53 graden Celsius in een waterbad. Giet het vervolgens in petrischalen onder de laminaire stroomkap.

Om selectief medium te bereiden, voegt u kanamycine toe aan het medium en giet het in petrischalen zoals eerder aangetoond. Om de aspirator in te stellen, sluit u de inlaat van de vacuümpomp aan op het ene uiteinde van een polyethyleenbuis van een geschikte grootte. Verbind vervolgens het andere uiteinde van de buis met de uitlaat van het tweerichtingsdeksel van de decantatiefles.

Wikkel de aansluiting van de buis goed af met een afdichtingsfolie om een luchtdichte verbinding te garanderen. Sluit vervolgens een tweede polyethyleenbuis aan op de inlaat van de schroefdop op de decantatiefles. Sluit vervolgens de andere kant van de buis aan op de uitlaat van een aquariumklep die is uitgerust met een dunne polyethyleen buis.

Wikkel indien nodig de verbinding met de afdichtingsfolie om luchtlekkage te elimineren. Na het labelen van twee batches van 48 microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter met progressieve nummers, voegt u 100 tot 200 Arabidopsis-zaden toe aan elk van de 96 steriele microcentrifugebuizen, ongeveer één tot twee millimeter boven de bodem van het conische uiteinde van de buis. Voeg vervolgens met behulp van een steriele serologische pipet van 10 milliliter ongeveer één milliliter 70% ethanol toe aan elke buis en sluit voorzichtig de deksels.

Schud de buizen met een oscillatiefrequentie van acht hertz gedurende drie minuten in een shaker. Verwijder vervolgens de adapters uit de shaker en breng ze over in de mand van een benchtop microcentrifuge voor het draaien van de zaden met behulp van de pulsfunctie. Nadat u de buizen naar een rek hebt overgebracht, opent u alle buizen onder de laminaire stroomkap.

Raak het deel van de deksels dat in de buizen past niet aan om besmetting te voorkomen. Plaats vervolgens onder de laminaire stroomkap een steriele gele punt van 200 microliter op de aquariumklepinlaat van de zelfgemaakte aspirator en schakel de pomp in. Plaats de punt net boven het niveau van de zaden om te voorkomen dat de zaden worden aangeraakt bij het zuigen van de vloeistof.

Gebruik vervolgens een steriele serologische pipet van 10 milliliter en steek een milliliter 5% bleekoplossing in elke buis. Sluit de deksels voordat u de buizen terug in de schudadapters plaatst en schud vervolgens de buizen zoals eerder is aangetoond. Na het draaien van de zaden met behulp van de pulsfunctie van een benchtop-centrifuge, plaatst u een nieuwe steriele gele punt van 200 microliter op de aquariumklep en schakelt u de pomp in.

Plaats de punt boven het niveau van de zaden om te voorkomen dat de zaden worden aangeraakt bij het zuigen van de bleekoplossing. Vervolgens, met behulp van een 10-milliliter steriele serologische pipet, aliquot een milliliter gesteriliseerd water in elke buis. Nadat u een nieuwe steriele gele punt van 200 microliter op de aquariumklep hebt aangebracht, schakelt u de pomp in.

Plaats de punt net boven het niveau van de zaden om te voorkomen dat de zaden worden aangeraakt bij het zuigen van het water. Ten slotte, aliquot 500 microliter gesteriliseerd water in elke buis, en sluit alle deksels in de laminaire stroomkap. De zaden zijn nu klaar om gezaaid te worden.

Houd de buizen indien nodig tot een paar uur op kamertemperatuur of 's nachts bij vier graden Celsius. Breng met een pipet van één milliliter de zaden met 300 tot 400 microliter steriel water over in een petrischaaltje. Giet na het overbrengen van 10 buizen 1,5 tot twee milliliter gesmolten Halve sterkte Murashige en Skoog-medium zonder antibiotica in elke plaat.

Draai de plaat snel om de zaden te verdelen en plak de platen aan weerszijden vast. Wikkel de platen in plastic of aluminiumfolie en plaats ze drie dagen in het donker in een koelkast om een uniforme kieming te verkrijgen. Kiemanalyses uitgevoerd op dag twee, drie, vier en zeven gaven geen significante verschillen aan tussen 10 tot 40 minuten sterilisatietijd met 70% ethanol.

Wanneer de sterilisatietijd echter langer was dan 40 minuten, daalden de kiemsnelheden. Dienovereenkomstig daalden ook de opkomstpercentages van groene zaadlobben. Op basis van de studie werden drie minuten voor 70% ethanol en drie minuten voor 5% bleekmiddel geselecteerd als de minimale tijd om de zaden te steriliseren.

Om aan te tonen dat de gebruikte zaden oorspronkelijk besmet waren met micro-organismen, werden niet-steriele zaden direct op de platen gezaaid. In vergelijking met steriele zaden vertoonden niet-steriele zaden na twee dagen een schimmeluiterlijk uiterlijk, dat zich na een ontkieming van zeven dagen over de platen verspreidde. Een kruisbesmettingstest uitgevoerd met behulp van een enkele steriele pipetpunt om verschillende zaadmonsters te verwerken, toonde aan dat er geen groene zaadlobben werden waargenomen in de Columbia-0 genotype zaden gezaaid in platen met kanamycine.

Tegelijkertijd, in Columbia-0 zaden gezaaid in platen zonder kanamycine, leken alle zaadlobben groen na ontkieming. Deze resultaten wijzen op geen overdracht van verontreiniging tussen monsters, ondanks het gebruik van een enkele pipetpunt om de steriele oplossing te verwijderen. Deze procedure is de basis voor vele andere functionele genomicamethoden zoals genoverexpressie, genoombewerking, subcellulaire lokalisatie, promotoractiviteit en eiwit-eiwit- en eiwit-DNA-interacties.