Geautomatiseerde microbiële teelt en adaptieve evolutie met behulp van microbieel microdruppelcultuursysteem (MMC)

Deze methode kan helpen bij het oplossen van de problemen met de conventionele microbiële teeltmethoden. Het biedt een goedkoop, bedrijfsvriendelijk en resultaatbetrouwbaar experimenteel platform voor geautomatiseerde microbiële teelt en adaptieve evolutie. Deze technologie automatiseert bewerkingen en vermindert het arbeidsverbruik aanzienlijk.

En tegelijkertijd heeft het goede cultuurprestaties met betrouwbare resultaten en eenvoudige bewerkingen. De technologie wordt voornamelijk gebruikt in de microbiologische onderzoeksvelden, zoals het meten van de groeicurve, adaptieve laboratoriumevolutie en een single factor multi-level analyse. Start de voorbereidingen van het experiment door de naald van de spuit met een binnendiameter van 0,41 millimeter en een buitendiameter van 0,71 millimeter aan te sluiten op een snelkoppeling A en reagensfles.

Autoclaaf vervolgens alle apparatuur op 121 graden Celsius gedurende 15 minuten. Om de microfluïdische chip te installeren, opent u de deur van de operatiekamer en tilt u de optische vezelsonde op. Nadat u de elektrische veldgaten met de naalden hebt uitgelijnd, plaatst u de chip voorzichtig op het spaanakkel, plaatst u vervolgens de twee positioneringskolommen in de positioneringsgaten en plaatst u de optische vezelsonde.

Sluit vervolgens de snelkoppeling A op de chip aan op de overeenkomstige poort van het microbiële microdruppelcultuursysteem of MMC volgens het positienummer zoals beschreven in het manuscript. Als u klaar bent, sluit u de deur van de operatiekamer. Verdun de gekweekte Escherichia coli MG1655 suspensie met het medium tot een OD600 van 0,05 tot 0,1 om 10 milliliter initiële bacterieoplossing te verkrijgen.

Om de MMC te initialiseren, klikt u op het tabblad Initialisatie. Wanneer de initialisatie-interface verschijnt, stelt u de teelttemperatuur in op 37 graden Celsius en de foto-elektrische signaalwaarde op 0,6. De initialisatie duurt ongeveer 20 minuten.

Plaats later een gesteriliseerde reagensfles op de schone bank en draai de dop vast. Gebruik een steriele spuit van 10 milliliter om drie tot vijf milliliter MMC-olie van de naald van de spuit naar de zijbuis in de reagensfles te injecteren. Kantel en draai vervolgens de reagensfles langzaam om de olie volledig in de binnenwand te laten infiltreren.

Na het injecteren van vijf milliliter van een initiële bacterie-oplossing in de fles, vult u de reagensfles door vijf tot zeven milliliter van de MMC-olie te injecteren. Trek de onafhankelijke snelkoppeling A van de reagensfles eruit en steek de snelkoppeling A in de snelkoppeling B van de fles om de monsterinjectie te voltooien. Als u klaar bent, opent u de deur van de operatiekamer om de reagensfles in het metalen bad te plaatsen.

Trek de C2-connector van de chip en de snelkoppeling A van de reagensfles eruit. Sluit de zijbuisconnector van de reagensfles aan op de C2-connector en de bovenbuisconnector op de O2-connector. Sluit vervolgens de deur van de operatiekamer.

Om de functie van het meten van de groeicurve te kiezen, klikt u op Groeicurve in de interface voor parameterinstellingen en voert u het getal in als 15. Schakel vervolgens de OD-detectieschakelaar in en stel de golflengte in op 600 nanometer. Klik op het tabblad Start om het genereren van druppels te starten.

Het proces duurt 15 minuten om te voltooien. Wanneer er een pop-upvenster op de hoofdinterface verschijnt met een bericht, opent u de deur van de operatiekamer om de reagensfles eruit te halen en de C2- en O2-connectoren aan te sluiten. Nadat u de deur hebt gesloten, klikt u op de knop OK in het pop-upvenster om de druppels automatisch te cultiveren en de OD-waarden te detecteren.

Wanneer de groeicurve de stationaire fase bereikt, klikt u op de knop Gegevensexport om de OD-gegevens te exporteren. Selecteer het gegevensopslagpad en exporteer de OD-waarde die tijdens de teeltperiode is geregistreerd in de CVS-indeling Om de groeicurve te plotten, gebruikt u kaartsoftware zoals Excel en Origin 9.0. Injecteer de vereiste volumes van de initiële bacterieoplossing, het verse medium en MMC-olie in de afzonderlijke gesteriliseerde reagensflessen voor de initiële bacterieoplossing in het verse medium, zoals eerder uitgelegd.

Om de functie van adaptieve evolutie te kiezen, klikt u op ALE in de software. Schakel in de interface voor parameterinstellingen de OD-detectieschakelaar in, stel vervolgens alle parameters in die in het manuscript worden beschreven en klik op het tabblad Start om het genereren van druppels te starten. Het proces duurt ongeveer 25 minuten.

Observeer tijdens elke subkweekperiode of de maximale OD-waarden van de druppels aanzienlijk zijn toegenomen. Als de toename optreedt en voldoet aan de experimentvereisten, klikt u op de knop Gegevensexport om de OD-gegevens te exporteren. Om de doeldruppels uit de MMC te extraheren, klikt u op het screeningstabblad om de functie van druppelextractie te selecteren.

Kies vervolgens de optie Verzamelen en klik op het aantal doeldruppels. Als u klaar bent, klikt u op OK. Wacht op het pop-upvenster waarin een bericht wordt gevraagd. Plaats vervolgens de CF-snelkoppeling in de microcentrifugebuis voor verzameling en klik op OK. Na één tot twee minuten wanneer de software-interface een nieuw venster opent met een bericht, plaatst u de CF-snelkoppeling terug en klikt u op OK om MMC te laten doorgaan met werken.

Wanneer de volgende doeldruppel de druppelherkenningsplaats bereikt, verzamelt u deze zoals eerder opgegeven. Gebruik een pipet van 2,5 microliter om de druppel eruit te halen en op een massieve plaat van 90 millimeter te plaatsen, gevolgd door de druppel gelijkmatig te verdelen met een glazen driehoekige gecoate staaf met een zijlengte van drie centimeter, en cultiveer de druppel vervolgens gedurende 72 uur in een incubator met constante temperatuur van 37 graden Celsius. Kies later drie tot vijf onafhankelijke kolonies bacteriën om elke kolonie afzonderlijk te kweken in een schudkolf van 50 milliliter met 10 milliliter vers medium in een schudincubator met 200 rotaties per minuut en 37 graden Celsius gedurende 48 tot 72 uur.

Volg na de incubatie de bijbehorende standaardvoorschriften om de gekweekte bacterie-oplossing in de glycerolbuis op te slaan. De representatieve analyse toont de groeicurves van 50 druppels in het hele adaptieve evolutieproces. Er werd waargenomen dat de methanol essentiële Escherichia coli stam of MeSV2.2 initiële langzame groei vertoonde, gevolgd door snelle groei.

De groeicurve van druppel zes in het hele adaptieve evolutieproces werd afzonderlijk uitgezet. De maximale OD600-waarde in de eerste generatie was 0,37, wat steeg tot 0,58 in de laatste subkweekperiode, wat aangeeft dat de stam in de druppel zes een duidelijke adaptieve evolutie heeft gerealiseerd. Verder werden de groeicurves van de druppel zes stam en de initiële stam vergeleken.

De druppel zes stam vertoonde een hogere maximale specifieke groeisnelheid en celconcentratie in de stationaire fase dan de initiële stam. Het belangrijkste is om ervoor te zorgen dat de verbinding van de instrumentchip en de reagensfles correct is, dat zijn de druppels voor bewerkingen om normaal te verlopen. Deze methode biedt onderzoekers een nieuw idee voor het kweken van micro-organismen en biedt ook een efficiënt en goedkoop platform voor de adaptieve evolutie van stammen.