Multimodaal optisch beeldvormingsplatform voor het bestuderen van cellulair metabolisme

Ons onderzoek omvat het gebruik van onze multimodale microscoop om moleculaire en metabole verschillen in verschillende pathologieën te meten en hun ruimtelijke heterogeniteit te visualiseren. De multimodale benadering van optische beeldvorming stelt ons in staat om pathofysiologische veranderingen vanuit verschillende perspectieven te identificeren. De multimodale benadering van optische microscopie breidt zijn toepassingen voortdurend uit, met name in de klinische setting, waar de ontwikkeling van micro-endoscopen een weg heeft geopend voor klinische beeldvorming.

De huidige experimentele uitdagingen liggen in de complexiteit van het met elkaar integreren van alle hardware, wat een van de redenen is waarom we een op maat gemaakt microscoopsysteem gebruiken. Door het gebruik van ons multimodale optische beeldvormingsplatform hebben we aanzienlijke vooruitgang geboekt in labelvrij bioorthogonaal ziekteonderzoek, waaronder de classificatie van verschillende subtypes van borstkanker en de analyse van het lipidenmetabolisme in het brein van drosophila en muizen. Met behulp van onze labelvrije multimodale optische beeldvorming zijn we in staat om het metabolisme, de morfologie en de moleculaire samenstelling tegelijkertijd te visualiseren, wat een krachtig hulpmiddel is voor het onderzoeken van ziekten en het verouderingsproces.

Warm om te beginnen de laser op en wacht ongeveer 15 tot 20 minuten. Schakel de schakelkast in, gevolgd door de controller voor het aanraakscherm, de AC-adapter voor de hoofdlaserafstandsbediening en de AC-adapter voor de sublaserafstandsbediening, en schakel vervolgens de siliciumfotodiodedetector en lock-in in amplifier. Stel het lasersysteem in met een pompstraal die afstembaar is van 780 nanometer tot 990 nanometer, met een pulsbreedte van vijf tot zes picoseconden en een herhalingsfrequentie van 80 megahertz.

De stokes-laserstraal moet een vaste golflengte hebben van 1031 nanometer, met een puls van zes picoseconden en een herhalingsfrequentie van 80 megahertz. Zorg ervoor dat zowel de pomp als de stookstralen een laag vermogen hebben, ten minste 20 milliwatt om zichtbaar te zijn op de uitlijnplaat. Breng olie aan op de oliecondensor met hoge numerieke apertuur.

Monteer het microscoopglaasje op de oliecondensor en plaats een grote waterdruppel op het microscoopglaasje voor het 25X waterobjectief. Pas de Z-fase aan om de scherpstelling af te stemmen totdat het heldere helderveldbeeld van het biologische monster zichtbaar is onder het 25X waterobjectief. Begin het beeldvormingsproces in de juiste volgorde om fotobleken te voorkomen.

Om snel tussen MPF en SHG te schakelen, schakelt u over van de pompbalk naar de vaste stokes-balk. Selecteer de beeldresolutie als 512 bij 512 pixels. Stel de verblijftijd in op acht microseconden per pixel voor MPF en SHG, met een gemiddeld frame van meer dan drie.

Gebruik 40 microseconden per pixel met een gemiddeld frame van twee voor de SRS-modaliteit. Om autofluorescentie met MPF te verkrijgen, schakelt u de stokes-laserstraal uit. Stem de pomplaser af op 800 nanometer om NADH en flavine te exciteren.

Verkrijg het collageenvezelsignaal met behulp van SHG. Schakel de laserstraal van de pomp uit en gebruik de stokes-laserstraal alleen met een vermogen van 500 milliwatt. Verkrijg de ruimtelijke verdeling van eiwitten en lipiden met behulp van SRS.

Houd beide laserstralen aan en pas de frequentie van de laserstraal aan de specifieke trillingsmodus voor elk molecuul aan. Om de SRS hyperspectrale beelddatasets te verkrijgen, selecteert u de suite-modus en stelt u het golflengtebereik in van 781,3 nanometer tot 806,5 nanometer. Kies een stapelnummer van ten minste 60 en leg de hyperspectrale beeldstapel vast.

Sla alle afbeeldingen van dezelfde interessegebieden op in dezelfde map en zorg ervoor dat het afbeeldingsformaat een Olympus OIR-bestand is. Autofluorescentie en SRS-beeldvorming hebben met succes metabole en structurele informatie van menselijk longweefsel vastgelegd. Ratiometrische analyse van de optische redoxverhouding en de lipide-onverzadigingsverhouding leverde ruimtelijke verdelingen op van metabole activiteit en moleculaire samenstelling in menselijk longweefsel.

Kwantitatieve vergelijking van oxidatieve stress en lipide-onverzadiging tussen gezond en tumorweefsel onthult verschillen in metabole toestanden.