Onthullende elektromechanische controle van weefselhomeostase met behulp van een tweelaags microfluïdisch apparaat

We passen gecontroleerde elektrische velden toe om te bestuderen hoe weefsels reageren op elektrische signalen, met de nadruk op hoe stromen of velden celadhesie, proliferatie en extrusie reguleren, wat van invloed is op de weefselhomeostase. We ontdekten dat de richting van fysiologisch relevante stromen de weefseltoestanden dicteert. Apicaal tot basaal veld induceerde een proliferatief fenotype, terwijl basaal tot apicaal veld celextrusie bevordert, waardoor modulatie van de totale celdichtheid mogelijk is.

Hoewel kwantitatieve bio-elektrische studies zich lange tijd hebben gericht op migratie via gravitaxis, blijft weefselhomeostase ontoegankelijk. Ons systeem maakt nu direct onderzoek mogelijk naar hoe fysiologische dozen de weefselorganisatie en het onderhoud reguleren. Ons protocol integreert microfluïdica, elektrische stimulatie van weefsels, structuur- en krachtmicroscopie en live beeldvorming om elektromechanische controle van weefselhomeostase te bestuderen.

Ons werk bracht de belangrijkste elektromechanische koppelingsregels aan het licht. Met nieuwe tools kunnen we nu onderzoeken hoe inheemse bio-elektrische patronen ontstaan en weefsels reguleren en of we complex weefselgedrag kunnen beheersen door deze elektromechanische signalen af te stemmen. Plaats om te beginnen een schone laag van een polydimethylsiloxaan- of PDMS-mal, met de voorkant naar boven op een schone plastic afdrop en voeg langzaam 500 microliter vloeibare ultraviolette uithardende lijm toe op de vorm.

Maak met een spatel alle uitstekende structuren voorzichtig nat en verwijder eventuele luchtbellen die tijdens het bevochtigingsproces zijn gevormd. Druk voorzichtig een dekglaasje op de PDMS-mal en gebruik een laboratoriumwisser om overtollige ultraviolet uithardende lijm te verwijderen, zodat de bovenkant van het dekglaasje schoon en vlak blijft. Hard de structuur gedeeltelijk uit onder gelijkmatig verlicht ultraviolet licht met een golflengte tussen 363 en 370 nanometer.

Veeg eventuele vlekken weg met 75%ethanol. Houd vervolgens de structuur stevig op een vlakke ondergrond en pel de PDMS-vorm langzaam van de uitgeharde laag één. Plaats vervolgens een schone laag twee PDMS-mallen met de voorkant naar beneden op een platte PDMS-plaat die dikker is dan 2.5 millimeter.

Tik voorzichtig van bovenaf met een pincet op de malfuncties. Let op de interface onder de functies voor verduistering of optisch contrast, wat het juiste contact bevestigt. Vul nu de ruimte tussen de PDMS-mal en de plaat met vloeibare ultraviolette uithardende lijm door capillaire werking.

Hard de structuur gedeeltelijk uit onder ultraviolet licht gedurende 10 seconden, zoals eerder gedemonstreerd. Gebruik een zacht gewatteerd pincet om de composiet ultraviolet uithardende lijmlaag en PDMS-mal voorzichtig van de PDMS-plaat te pellen. Knip indien nodig de overtollige randen van de uitgeharde lijmlaag af met een scherpe schaar.

Plaats vervolgens laag één bevestigd aan een rechthoekige glazen afdekplaat op een vlakke ondergrond. Lijn laag twee, nog steeds bevestigd aan de PDMS-mal, uit met laag één en druk beide lagen stevig tegen elkaar totdat er schaduwen onder de kenmerken verschijnen. Hard de uitgelijnde structuur gedurende 10 seconden uit onder ultraviolet licht om lagen één en twee te hechten aan een tweelaagse microfluïdische chip en pel vervolgens voorzichtig de PDMS-mal van de gebonden chip.

Piket onmiddellijk 10 microliter polyacrylamidegel-precursoroplossing op het midden van het weefselgebied direct boven de spleet in laag twee. Druk voorzichtig een rond glazen afdekstrookje met een diameter van 10 millimeter op de druppel om een platte gel te vormen. Observeer de geloplossing die door de spleet in laag één stroomt en stop bij de rij barrièrepilaren.

Hard de geassembleerde microfluïdische chip onmiddellijk uit onder ultraviolet licht gedurende vijf minuten. Laat de chip vervolgens ongeveer een uur ongestoord staan om de polyacrylamidegel volledig te laten stollen. Incubeer vervolgens de microfluïdische chip in 0,1 molaire HEPES-buffer bij pH 7,4 gedurende ten minste een uur om de gel te hydrateren en de hechting tussen de gel en het dekglaasje te verminderen.

Gebruik vervolgens voorzichtig een scherp pincet om het afdekglaasje van het geloppervlak te verwijderen. Plaats een cartridge van polycarbonaat van medische kwaliteit op een vlakke ondergrond met de onderkant naar boven en lijn een gedroogde chip met de voorkant naar beneden uit met de cartridge. Pipetteer UV-uithardende lijm in de spleten tussen de chip en de cartridge, vul ze via capillaire werking en hard uit onder UV-licht.

Steriliseer de gefabriceerde microfluïdische apparaten door ze onder ultraviolet licht op 200 tot 280 nanometer in een bioveiligheidskast te plaatsen. Bereid het vereiste volume van 50 microgram per milliliter collageen voor één werkoplossing in 1X DPBS op ijs. Bereid op ijs de Sulfo-SANPAH-werkoplossing door twee microliter Sulfo-SANPAH-stockoplossing te verdunnen, eerder opgelost in watervrij dimethylsulfoxide in 80 microliter koude 0,1 molaire HEPES-buffer bij pH 7,4 bewaard bij vier graden Celsius.

Dep de randen van de polyacrylamidegel met laboratoriumdoekjes om deze in het apparaat te drogen. Pipetteer 80 microliter Sulfo-SANPAH-werkoplossing op het geloppervlak, zorg voor volledige onderdompeling, en plaats de chip gedurende vijf minuten onder ultraviolet licht om de Sulfo-SANPAH te activeren. Spoel de gel driemaal af met koude 0,1 molaire HEPES-buffer bij pH 7,4.

Herhaal de Sulfo-SANPAH-behandeling door 80 microliter SS-werkoplossing over de gel te pipetteren en deze gedurende vijf minuten onder ultraviolet licht te bestralen. Spoel de gel deze keer drie keer uit met koude 1X DPBS. Piket ten slotte 100 microliter collageenoplossing op de polyacrylamidegel, zorg voor een volledige dekking, en laat het een uur intrekken.

Spoel los collageen drie keer af met 1X DPBS en houd de gel vervolgens ondergedompeld in 1X DPBS tot verder gebruik. Bevestig apparaten met schroeven aan de inzetstukken. Bevestig vervolgens maximaal vier inzetstukken van het apparaat aan de houder die is ontworpen voor montage op een microscooptafel.

Voeg twee milliliter kweekmedium toe aan elke hoofdput van de apparaten en door de afvalverwijderingskanalen om de 1X DPBS weg te spoelen en te vervangen. Steek vervolgens de platina-elektroden in de buis met 45 milliliter medium en zorg ervoor dat ze volledig in het medium zijn ondergedompeld. Trek kweekmedium met een spuit door de Tygon-slang en klem deze stevig vast.

Sluit het ene uiteinde van de met medium gevulde slang aan op de elektrodekamer en het andere uiteinde op het apparaat. Bereid nu een celsuspensie voor door de aanbevelingen voor de bereiding van trypsinisatie of celsuspensie op te volgen en 0,1 miljoen cellen in de hoofdput te zaaien. Monteer de opstelling op de microscoop met de elektrodekamers aan de zijkanten en sluit de bronmeter aan op de elektrodekamer.

Gebruik drie apparaten met identieke kanaalweerstand. Wijs er een toe als controlegroep. Pas apicale op basale stroom toe op het tweede apparaat en basale op apicale stroom op het derde apparaat.

Zoek een elektrisch signaal in de stroomtangmodus en lever een totale stroom van 20 microampère. Kies een 20x objectieflens voor beeldvorming van het hele weefsel met een epifluorescentiemicroscoop. Kies ten slotte kanaal 561 voor rode fluorescentie en helderveldkanalen.

Selecteer een tijdsinterval van een uur tijdens langdurige beeldvorming. Elektrische stimulatie werd loodrecht op de cellen toegepast om het transepitheelpotentieel te verstoren om de rol ervan in weefselgedrag onder verschillende stroomrichtingen te bestuderen. Onder fasecontrastbeeldvorming zorgden apicale tot basale of ATB-stromen ervoor dat celjuncties binnen 10 minuten na het aanbrengen helderder werden, terwijl controle- en basaal-naar-apicale, BTA-condities een laag contrast en vlakke apicale oppervlakken vertoonden.

ATB-stromen produceerden een uitwaartse convexiteit aan het apicale celoppervlak. Gelvervorming was sterk afhankelijk van de richting van de stroom. ATB-stromen trokken de gel omhoog, terwijl BTA-stromen de gel naar beneden drukten.

De intensiteit van junctionele E-cadherine nam toe onder BTA-stromen, maar nam significant af onder ATB-stromen in vergelijking met controle. De intensiteit van junctionele actine nam af onder ATB-stromen, maar nam niet significant toe onder BTA-stromen ten opzichte van de controle. ATB-stromen veroorzaakten meercellige levende celextrusies over de monolaag, terwijl BTA-stromen de monolaagstructuur behielden, vergelijkbaar met de controle.

Ruimtelijke heterogeniteit in celdistributie was significant hoger onder ATB-stromen, maar bleef laag en uniform onder BTA- en controleomstandigheden. De celproliferatiesnelheid nam toe onder ATB-stimulatie, met hogere delingssnelheden in de loop van de tijd. Daarentegen veroorzaakten BTA-stromen meer celdoodgebeurtenissen.