Hodowla eksplantów tkanki nerwowej

Hodowle eksplantów służą jako technika do badania rozwoju specyficznych populacji komórek oraz struktur neuronalnych. W eksperymentach z zakresu neuronauki rozwojowej eksplanty są tkankami neuronalnymi wyciętymi z embrionu w celu kontynuacji rozwoju in vitro. Hodowle te dają badaczom możliwość manipulowania rozwijającymi się tkankami i ich wizualizacji w sposób, który nie jest możliwy in vivo. W niniejszym filmie zostaną przedstawione istotne zasady pracy z tkankami eksplantowanymi, procedury krok po kroku dla dwóch podejść do hodowli eksplantów, a także zastosowania tej techniki.

Przed przejściem do metod, omówmy kilka podstawowych zasad. Eksplanty mogą być pozyskiwane z wielu organizmów modelowych i różnych typów tkanek. Zazwyczaj hodowle tworzy się poprzez ostrożne usunięcie tkanki nerwowej z zarodka, wypreparowanie interesującego regionu i umieszczenie go w sztucznym środowisku.

Tkanki można również pociąć na cienkie plastry i hodować w formie tzw. „hodowli plastrów” (slice culture). Ponieważ środowisko hodowlane jest zaprojektowane tak, aby naśladować warunki in vivo całego narządu, strategia ta jest często nazywana „organotypową”.

Przed rozpoczęciem pracy należy wysterylizować narzędzia 70% etanolem. Następnie należy uśmiercić ciężarną mysz, stosując preferowaną w laboratorium metodę. Potem chirurgicznie wycina się macicę i umieszcza ją w lodowatym buforze. Płytkę przenosi się pod mikroskop stereoskopowy i wyjmuje poszczególne zarodki z pęcherzyków żółtkowych. Następnie izoluje się mózg, ostrożnie wycina interesujący region i przenosi go do naczynia hodowlanego zawierającego pożywkę. Eksplanty można utrzymywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 przez kilka tygodni, wymieniając 50% pożywki co 2 - 3 dni.

Hodowla plastrów tkanki mózgowej wymaga kilku dodatkowych kroków. Przed sekcjonowaniem tkankę zatapia się w agarozie, która zapewnia wsparcie tkance, dzięki czemu pozostaje ona nienaruszona podczas krojenia. W tym celu roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia 1,5% podgrzewa się do momentu rozpuszczenia agarozy. Następnie agarozę przenosi się do form do zatapiania i pozwala się jej lekko ostygnąć, aby uniknąć uszkodzenia tkanki.

Następnie można ostrożnie zanurzyć tkankę i pozostawić agarozę do stwardnienia. Powstałe bloki przycina się, a następnie przykleja do stolika z próbką i sekcjonuje za pomocą wibratomu, czyli instrumentu wykorzystującego wibrujące ostrze do wycinania cienkich plastrów żywej tkanki. W miarę powstawania plastrów są one ostrożnie przenoszone na pokrytą płytkę zawierającą pożywkę i hodowane w sposób opisany wcześniej.

Stosowanie kultur eksplantów niesie ze sobą szereg zalet w porównaniu z metodami in vivo oraz innymi metodami in vitro. Po pierwsze, komórki w tkance eksplantowanej są łatwiej dostępne dla narzędzi eksperymentalnych. Po drugie, fakt, że eksplanty zachowują złożoną architekturę komórkową rozwijającej się tkanki nerwowej, pozwala na badanie oddziaływań międzykomórkowych. Po trzecie, dzięki możliwości kontrolowania składu chemicznego pożywki, naukowcy mogą wykorzystywać eksplanty do testowania wpływu konkretnych związków na rozwój tkanki.

Niemniej jednak, ponieważ tkanka jest usuwana z naturalnego środowiska, należy zachować szczególną staranność, aby utrzymać ją w dobrej kondycji i zdrowiu in vitro. Na przykład obecność macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) ma istotny wpływ na zachowanie komórek, dlatego do powlekania naczyń hodowlanych często stosuje się oczyszczone białka ECM. Inną ważną kwestią jest roztwór, w którym kąpane są eksplanty. Choć często stosuje się tradycyjne pożywki do hodowli komórkowych, niektóre eksperymenty wymagają roztworów ściśle przypominających płyn krążący w ośrodkowym układzie nerwowym: płyn mózgowo-rdzeniowy, który jest krytycznym odczynnikiem w doświadczeniach, takich jak te, które zaraz zobaczycie.

Po omówieniu metod hodowli eksplantów, sprawdźmy, w jaki sposób techniki te są wykorzystywane w praktyce.

Testy migracji komórek wykorzystują eksplanty tkanek do badania sygnałów odpychających i przyciągających, które biorą udział w przemieszczaniu się komórek nerwowych. W tym eksperymencie do eksplantów rąbka mózgu wprowadzono koraliki uprzednio nasączone czynnikami wzrostu, aby zbadać migrację komórek nerwowych. Po 3 - 4 dniach ekspozycji neurony obrazowano za pomocą mikroskopu konfokalnego. Wyniki pokazują, że motoneurony migrują w kierunku koralików nasączonych czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyniowego, ale nie w stronę koralików kontrolnych nasączonych buforem.

Testy kokultury są często stosowane do badania interakcji międzykomórkowych podczas rozwoju. W tym przykładzie fragmenty rdzenia kręgowego hodowano na warstwie komórek mięśniowych, aby zbadać sposób tworzenia połączeń między motoneuronami rdzeniowymi a mięśniami szkieletowymi. Już 2 dni po inkubacji obserwuje się wypustki neuronów, znane również jako neuryty, wyłaniające się z eksplantu. W ciągu 5 dni stwierdza się funkcjonalną unerwienie, co objawia się skurczem warstwy komórek mięśniowych.

Podczas rozwoju układu nerwowego neurony muszą wydłużać swoje aksony, aby ustanowić połączenie między tkanką docelową a ośrodkowym układem nerwowym. Jednym ze sposobów badania tego złożonego procesu są testy prowadzenia aksonów. Badacze wykorzystują eksplanty tkanek do analizy czynników wewnątrz neuronów oraz w otaczającym środowisku, które pomagają w prowadzeniu aksonu do właściwego miejsca.

Właśnie obejrzeli Państwo przewodnik JoVE po hodowli eksplantów tkanki nerwowej. W tym filmie przedstawiono przegląd zalet hodowli eksplantów, strategie hodowli, szczegółowe protokoły dwóch powszechnie stosowanych procedur eksplantacji oraz sposoby wykorzystania tych technik w dzisiejszej pracy laboratoryjnej.

Dziękujemy za uwagę!