PAR-CliP - metoda identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących RNA w całym transkryptomie

Summary

Transkrypty RNA podlegają rozległej regulacji potranskrypcyjnej, w której pośredniczy wiele trans-działających białek wiążących RNA (RBP). W tym miejscu przedstawiamy uogólnioną metodę precyzyjnej identyfikacji w skali całego transkryptomu miejsc wiązania RNA RBP.

Abstract

Transkrypty RNA są poddawane potranskrypcyjnej regulacji genów poprzez interakcję z setkami białek wiążących RNA (RBP) i kompleksów rybonukleoprotein zawierających mikroRNA (miRNP), które często ulegają ekspresji w zależności od typu komórki. Aby zrozumieć, w jaki sposób wzajemne oddziaływanie tych czynników wiążących RNA wpływa na regulację poszczególnych transkryptów, niezbędne są mapy interakcji białko-RNA in vivo ^o wysokiej rozdzielczości 1.

Kombinacja podejść genetycznych, biochemicznych i obliczeniowych jest zazwyczaj stosowana do identyfikacji interakcji RNA-RBP lub RNA-RNP. Profilowanie mikromacierzy RNA związanych z immunooczyszczanymi RBP (RIP-Chip)² definiuje cele na poziomie transkryptomu, ale jego zastosowanie ogranicza się do charakterystyki oddziaływań stabilnych kinetycznie i tylko w rzadkich przypadkach^3,4 pozwala zidentyfikować element rozpoznający RBP (RRE) w obrębie długiego docelowego RNA. Bardziej bezpośrednie informacje o miejscu docelowym RBP uzyskuje się przez połączenie sieciowania in vivo UV^5,6 z immunoprecypitacją^7-9, a następnie izolacją usieciowanych segmentów RNA i sekwencjonowaniem cDNA (CLIP)¹⁰. CLIP wykorzystano do identyfikacji celów szeregu RBP^11-17. Jednak CLIP jest ograniczony przez niską skuteczność sieciowania białka RNA UV 254 nm, a lokalizacja usieciowania nie jest łatwa do zidentyfikowania w sekwencjonowanych usieciowanych fragmentach, co utrudnia oddzielenie docelowych segmentów RNA usieciowanych promieniami UV od nieusieciowanych fragmentów RNA tła obecnych również w próbce.

Opracowaliśmy potężne podejście do sieciowania opartego na komórkach, aby określić w wysokiej rozdzielczości i dla całego transkryptomu miejsca wiązania komórkowych RBP i miRNP, które nazywamy PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (zobacz Rys. 1A dla zarysu metody). Metoda opiera się na włączaniu fotoreaktywnych analogów rybonukleozydów, takich jak 4-tiourydyna (4-SU) i 6-tioguanozyna (6-SG) do powstających transkryptów RNA przez żywe komórki. Naświetlanie komórek światłem UV o długości fali 365 nm indukuje skuteczne sieciowanie komórkowych RNA znakowanych fotoreaktywnymi nukleozydami do oddziałujących RBP. Po immunoprecypitacji interesującego RBP następuje izolacja usieciowanego i koimmunoprecypitowanego RNA. Wyizolowane RNA jest przekształcane w bibliotekę cDNA i głęboko sekwencjonowane przy użyciu technologii Solexa. Jedną z charakterystycznych cech bibliotek cDNA przygotowanych przez PAR-CliP jest to, że dokładne położenie sieciowania można zidentyfikować na podstawie mutacji znajdujących się w sekwencjonowanym cDNA. W przypadku stosowania 4-SU usieciowane sekwencjonuje przejście tymidyny do cytydyny, podczas gdy użycie 6-SG powoduje mutacje guanozyny do adenozyny. Obecność mutacji w sekwencjach usieciowanych umożliwia ich oddzielenie od tła sekwencji pochodzących z licznego komórkowego RNA.

Zastosowanie tej metody do wielu różnych białek wiążących RNA zostało opisane w Hafner et al.^{Rozdział 18}

Protocol

Poniższy protokół opisuje procedurę PAR-CliP dla komórek HEK293 wykazujących ekspresję IGF2BP1 oznaczonych FLAG/HA po indukcji doksycykliną. Do immunoprecypitacji użyjemy przeciwciała anty-FLAG.

PAR-CliP będzie działać z dowolną linią komórkową wyrażającą wykrywalne poziomy endogennego, nieoznakowanego białka wiążącego RNA (RBP) interesującego użytkownika, jeśli dostępne jest skuteczne przeciwciało do immunoprecypitacji.

Rozwijanie komórek

1. Rozwiń komórki FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 w pożywce wzrostowej. Jako punkt wyjścia zalecamy użycie^{6 komórek o} wymiarach 100-400 x 10 (ok. 10-40 15 cm płytek do hodowli komórkowych). Wyhoduj je do około 80% zbieżności.
2. 14 godzin przed sieciowaniem dodać a) 4-tiourydynę do końcowego stężenia 100 μM (1:1000 v/v 1 M roztworu podstawowego 4-tiourydyny) bezpośrednio do pożywki do hodowli komórkowej i b) wywołać ekspresję FLAG/HA znakowanej IGF2BP1 przez dodanie 1 μg/ml doksycykliny (1:10 000 v/v 10 mg/ml roztworu podstawowego doksycykliny). UWAGA: zamiast 4-tiourydyny można również użyć 100 μM 6-tioguanozyny.

Sieciowanie UV

1. Umyj komórki raz 10 ml lodowatego PBS na płytkę i całkowicie usuń PBS.
2. Umieść płytki na tacy z lodem i naświetl odsłonięte światłem UV o długości fali 0,15 J/^cm2 365 nm w urządzeniu Stratalinker 2400 (Stratagene) lub podobnym.
3. Zeskrobać komórki gumowym policjantem w 1 ml PBS na płytkę, przenieść do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i zebrać przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C i wyrzucić supernatant. 100 x 10⁶ komórek HEK293 (10 płytek 15 cm) da ok. 1 ml mokrego osadu komórkowego.
4. (opcjonalnie) Jeśli nie chcesz kontynuować bezpośrednio lizy komórek, zamroź szokowo granulki komórkowe w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80°C. Granulki komórkowe można przechowywać przez co najmniej 12 miesięcy.

Liza komórek i trawienie RNaseT1

1. Zebrać osad komórkowy usieciowanych komórek w 3 objętościach 1x buforu do lizy NP40 i inkubować na lodzie przez 10 minut.
2. Lizat klarownych komórek przez odwirowanie w stężeniu 13 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4°C.
3. Dalej oczyścić lizat, filtrując go przez membranowy filtr strzykawkowy 0,2 μm (Pall Acrodisc lub odpowiednik).
4. Dodać RNazę T1 (fermenty, 10 000 U/μl) do końcowego stężenia 1 U/μl i inkubować w łaźni wodnej przez 15 minut w temperaturze 22°C. Następnie schłodzić reakcję przez 5 minut na lodzie przed kontynuacją.

Immunoprecypitacja i odzyskiwanie usieciowanych fragmentów docelowego RNA

Korzystanie z separatora magnetycznego

Postępuj zgodnie z tymi wskazówkami podczas przygotowywania próbki, aby zapobiec wysychaniu kulek magnetycznych.

1. Umieść rurkę zawierającą koraliki na stojaku magnetycznym na 1 2 minuty.
2. Dodaj bufor do probówki, gdy probówka znajduje się na separatorze magnetycznym.
3. Zakryj rurkę, wyjmij ją z separatora magnetycznego i ponownie zawieś kulki. Możesz ponownie zawiesić koraliki, przesuwając rurkę palcem lub używając wirownika ustawionego na 5 6.
4. Odwirować na krótko, aby zebrać wszelkie kulki, które mogą pozostać w nasadce probówki.
5. W razie potrzeby powtórz kroki od 1 do 4.

Przygotowanie koralików magnetycznych

1. Przenieś 10 μl cząstek magnetycznych Dynabeads Protein G (Invitrogen) na ml lizatu komórkowego (dla typowego eksperymentu powinno to być ok. 40 50 μl kulek) do probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml. Przemyć koraliki dwukrotnie 1 ml buforu cytrynianowo-fosforanowego.
2. Zawiesić ponownie w podwójnej objętości buforu cytrynianowo-fosforanowego w stosunku do pierwotnej objętości zawiesiny kulek.
3. Dodać 0,25 μg przeciwciała monoklonalnego anty-FLAG M2 (Sigma) na ml zawiesiny i inkubować na obracającym się kole przez 40 minut w temperaturze pokojowej.
4. Przemyć kulki dwukrotnie w 1 ml buforu cytrynianowo-fosforanowego w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała.
5. Ponownie zawiesić kulki w podwójnej objętości buforu cytrynianowo-fosforanowego w stosunku do pierwotnej objętości zawiesiny kulek.

Immunoprecypitacja (IP), trawienie drugiej RNazy T1 i defosforylacja

1. Dodać 20 μl świeżo przygotowanych kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami na ml częściowego lizatu komórkowego poddanego działaniu RNazy T1 i inkubować w 15 ml probówkach wirówkowych na obracającym się kole przez 1 godzinę w temperaturze 4°C.
2. Zebrać kulki magnetyczne na magnetycznym kolektorze cząstek do probówek wirówkowych o pojemności 15 i 50 ml (Invitrogen) i przenieść do probówek do mikrofug o pojemności 1,5 ml.
3. Umyj koraliki 3 razy w 1 ml buforu do płukania IP.
4. Dodać RNazęT1 (fermenty, 10 000 U/μl) do końcowego stężenia 100 U/μl i inkubować zawiesinę kulek w łaźni wodnej przez 15 minut w temperaturze 22 °C. Następnie schłodzić na lodzie przez 5 minut.
5. Umyj koraliki 3 razy w 1 ml buforu do płukania o wysokiej zawartości soli.
6. Ponownie zawiesić kulki w 1 objętości buforu defosforylacyjnego
7. Dodać fosfatazę alkaliczną jelit cieląt (, NEB) do końcowego stężenia 0,5 U/μl i inkubować zawiesinę przez 10 minut w temperaturze 37°C.
8. Przemyć kulki dwukrotnie w 1 ml buforu do przemywania fosfatazy
9. Przemyj koraliki dwukrotnie w buforze kinazy polinukleotydowej (PNK) bez DTT (stężenie DTT niezbędne do reakcji enzymatycznej jest wystarczająco wysokie, aby uszkodzić kulki magnetyczne).
10. Zawieś ponownie koraliki w jednym oryginalnym woluminie ściegu bufora PNK

Radioznakowanie segmentów RNA usieciowanych z białkami immunoprecypitowanymi

1. Do opisanej powyżej zawiesiny perełki dodać ^Υ-32P-ATP do końcowego stężenia 0,5 μCi/μl i T4 PNK (NEB) do 1 U/μl w jednej pierwotnej objętości kulki. Inkubować zawiesinę przez 30 minut w temperaturze 37°C.
2. Dodać nieradioaktywny ATP do uzyskania końcowego stężenia 100 μM i inkubować przez kolejne 5 minut w temperaturze 37°C.
3. Umyj kulki magnetyczne 5 razy 800 μl buforu PNK bez naziemnej telewizji cyfrowej.
4. Zawieś koraliki w 70 μl bufora ładującego SDS-PAGE.

SDS-PAGE i elektroelucja usieciowanych kompleksów RNA-białko z plastrów żelu

1. Inkubować znakowaną radioizotopem zawiesinę przez 5 minut w bloku grzewczym w temperaturze 95°C w celu denaturacji i uwolnienia immunoprecypitowanego RBP z usieciowanym RNA i wirem.
2. Usuń kulki magnetyczne z separatora i przenieś supernatant do czystej probówki do mikronaftu o pojemności 1,5 ml.
3. Załadować 40 μl supernatantu do studzienki prefabrykowanego żelu poliakryloamidowego Novex Bis-Tris 4-12% (Invitrogen) i uruchomić żel przez 55 minut przy napięciu 200 V.
4. Zdemontuj komorę żelu i zdemontuj żel, pozostawiając go zamontowanego na jednej płycie. Aby ułatwić wyrównanie żelu z wydrukiem na papierze luminoskopowym, zalecamy asymetryczne wszczepienie trzech maleńkich kawałków żelu radioaktywnego w trzech z czterech rogów żelu. Radioaktywne kawałki żelu można pobrać z żeli, które wcześniej były używane do oczyszczania znakowanych radioaktywnie syntetycznych oligonukleotydów. Owiń żel w folię z tworzywa sztucznego (np. folię Saran), aby uniknąć zanieczyszczenia.
5. Wystaw żel na wygaszony ekran phosphorimager na 1 godzinę i wizualizuj na phosphorimagerze.
6. Wyrównaj żel na wydruku z luminoobrazurów, używając wszczepionych kawałków żelu w celu orientacji. Wytnij pasma, które odpowiadają oczekiwanej wielkości RBP (IGF2BP1, ok. 75 kDa) i przenieś do rurki D-Tube Dialyzer Midi Tube i dodaj 800 μl 1x bufor do pracy SDS.
7. Usieciowany kompleks RNA-RBP należy poddać elektroelucji w buforze roboczym 1x SDS pod napięciem 100 V przez 2 godziny. wycięty z żelu i elektroeluowany w D-Tube Dialyzer Midi (Novagen) w buforze do pracy SDS o pojemności 800 μl zgodnie z instrukcją producenta.

Trawienie K proteinazy K

1. Dodać równą objętość 2x buforu proteinazy K w stosunku do elektroeluatu, a następnie dodać proteinazę K (Roche) do końcowego stężenia 1,2 mg/ml. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 55°C.
2. Odzyskać RNA przez ekstrakcję kwasowym fenolem/chloroformem/IAA (25:24:1, pH 4,0), a następnie ekstrakcję chloroformem. Dodać 1 μl glikogenu (10 mg/ml zapasu), wytrącić RNA, dodając 3 objętości etanolu. Rozpuść granulkę w 10,5 μl wody.

przygotowanie biblioteki cDNA i głębokie sekwencjonowanie

Przeprowadź odzyskane RNA przez standardowy protokół przygotowania biblioteki cDNA, pierwotnie opisany do klonowania małych regulatorowych RNA ¹⁹. Pierwszy etap, ligacja adaptera 3', przeprowadzono zgodnie z opisem w skali 20 μl przy użyciu 10,5 μl odzyskanego RNA. Użyj opisanych zestawów adapterów do sekwencjonowania Solexa. W zależności od ilości odzyskanego RNA, produkty 5'-adapter-3'-adapter bez insertów mogą być wykrywane po amplifikacji cDNA jako dodatkowe prążki PCR. W takich przypadkach należy wyciąć dłuższy produkt PCR o oczekiwanej wielkości z 3% żelu agarozowego NuSieve o niskiej temperaturze topnienia, wymyć produkt PCR z kawałków żelu za pomocą zestawu GelElute (Qiagen) i sekwencjonować przy użyciu technologii Solexa. Jedna seria sekwencjonowania Solexa zwykle zapewnia od 6 do 10 milionów odczytów sekwencji, które wystarczają do pokrycia transkryptomu miejsc wiązania białek wiążących RNA.

Analiza bioinformatyczna

Dokładna analiza bioinformatyczna odczytów sekwencji musi być przeprowadzona, aby uzyskać znaczący wgląd w miejsca wiązania RNA dla badanego RBP, takie jak element rozpoznający RNA, preferowane regiony wiązania RBP (egzoniczne vs. intronicowe, sekwencja kodująca vs. sekwencja nietranslowana). Odczyty sekwencji muszą być dostosowane do baz danych genomu i EST. Zwykle używamy mapowania odczytów w unikalny sposób do genomu z maksymalnie jednym niedopasowaniem, insercją lub usunięciem, aby zbudować klastry odczytów sekwencji, które można następnie dalej analizować. Częstość charakterystycznych mutacji w odczytach sekwencjonowanych klastrów, przejścia T do C przy użyciu 4-SU i przejścia G do A przy użyciu 6-SG, wskazują na pomyślnie usieciowane sekwencje. Z naszego doświadczenia wynika, że nieusieciowane RNA znakowane 4-SU wykazują wskaźnik mutacji tła wynoszący około 20%. Wskaźnik ten wzrasta do ok. 50-80% po usieciowaniu.

Szczegółowy opis analizy bioinformatycznej można znaleźć w materiałach uzupełniających do publikacji Hafnera i wsp.^{Rozdział 18}

Opcjonalne kroki

Określenie poziomów włączenia 4-tiourydyny do całkowitego RNA

Wyizoluj całkowite RNA z linii komórkowej stabilnie wyrażającej RBP po wyhodowaniu na pożywce uzupełnionej 100 μM 4SU 16 godzin przed zbiorem. Jako kontrolę, zbieraj komórki wyhodowane bez dodatku 4SU. Wyizolować całkowite RNA przez dodanie 3 objętości odczynnika Trizol (Sigma) do przemytych granulek komórek zgodnie z instrukcjami producenta. było Dalsze oczyszczanie całkowitego RNA za pomocą Qiagen RNeasy zgodnie z protokołem producenta. Aby zapobiec utlenianiu 4SU podczas izolacji i analizy RNA, dodaj 0,1 mM ditiotreitolu (DTT) do płuczących i kolejnych etapów enzymatycznych. Trawienie i defosforylacja całkowitego RNA do pojedynczych nukleozydów do analizy HPLC, jak opisano wcześniej ^{w pkt 20}. Krótko, w objętości 30 μl, inkubuj 40 μg oczyszczonego całkowitego RNA przez 16 godzin w temperaturze 37 ° C z 0,4 U bakteryjną fosfatazą alkaliczną (Worthington Biochemical) i 0,09 U fosfodiesterazy jadu węża (Worthington Biochemical). Jako wzorzec odniesienia należy użyć syntetycznego RNA znakowanego 4SU (standardowo używamy CGUACGCGGAAUACUUCGA(4SU)U), a także poddać go całkowitemu trawieniu enzymatycznemu. Oddzielić powstałe mieszaniny rybonukleozydów za pomocą HPLC na kolumnie Supelco Discovery C18 (cząstka krzemionki 5 μM w fazie wiązanej, 250 x 4,6 mm) z odwróconymi fazami (Bellefonte PA, USA). HPLC to 0,1 M TEAA w 3% acetonitrylu (A) i 90% acetonitrylu w wodzie (B). Stosować gradient izokratyczny: 0% B przez 15 min, od 0 do 10% B przez 20 min, od 10 do 100% B przez 30 min. Zastosować 5-minutowe płukanie 100 % B stosowane między seriami w celu oczyszczenia kolumny HPLC.

Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1 (prawy panel) pokazuje reprezentatywny wynik PAR-CliP przeprowadzonego na liniach komórkowych wyrażających IGF2BP1 oznaczone FLAG/HA z 4-SU i 6-SG. Zauważ, że skuteczność sieciowania 6-SG dla IGF2BP1 jest niższa niż skuteczność sieciowania dla 4-SU. Niższa skuteczność sieciowania spowoduje wyższe tło sekwencji pochodzących z fragmentów obfitych komórkowych RNA, dlatego należy rozważyć zwiększenie skali eksperymentu przy użyciu mniej wydajnych nukleozydów fotoreaktywnych.

Lewy panel rysunku 1 pokazuje porównanie użycia różnych fotoreaktywnych analogów urydyny, które potencjalnie mogłyby być użyte do PAR-CliP w porównaniu z tradycyjnym sieciowaniem UV 254 nm.

Intensywność radioaktywnego pasma o odpowiedniej długości daje Ci dobre pojęcie, czy eksperyment PAR-CliP zadziałał i wyizolowałeś wystarczającą ilość RNA do przeprowadzenia przez protokół sekwencjonowania małego RNA (opis krok po kroku przygotowania biblioteki cDNA do sekwencjonowania małych RNA można znaleźć w ¹⁹). Częstość występowania charakterystycznych mutacji w sekwencjonowanych odczytach, przejścia T do C w przypadku stosowania 4-SU i przejścia G do A w przypadku stosowania 6-SG, wskazują na pomyślnie usieciowane sekwencje. Z naszego doświadczenia wynika, że nieusieciowane RNA znakowane 4-SU wykazują wskaźnik mutacji tła wynoszący około 20%. Wskaźnik ten wzrasta do ok. 50-80% po usieciowaniu.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
i odczynniki
Pożywka wzrostowa HEK293 cells
DMEM 10% FBS 2 mM L-glutamina 100 U/ml penicyliny 100 U/ml streptomycyny 100 μ g/ml higromycyny 15 &g; g/ml blasticydyny
4-tiourydyna roztwór podstawowy (1 M)
260.27 mg 4-tiourydyna 1 ml DMSO
Zapas doksycykliny (10 mg/ml)
10 mg doksycykliny 1 ml DMSO
1x bufor do lizy NP40
Przygotuj zapas 5x buforu bez inhibitorów DTT i proteazy. Dodaj DTT i inhibitor proteazy bezpośrednio przed eksperymentem.
50 mM HEPES, pH 7,5 150 mM KCl 2 mM EDTA 1 mM NaF 0,5% (v/v) NP40 0,5 mM DTT kompletny koktajl inhibitorów proteaz wolnych od EDTA (Roche)
Bufor cytrynianowo-fosforanowy
4,7 g/l kwas cytrynowy 9,2 g/l Na2HPO4 pH 5,0
bufor do mycia IP
50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 300 mM KCl 0,05% (v/v) NP40 0,5 mM DTT (dodać bezpośrednio przed eksperymentem) kompletny koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA (Roche) (dodać bezpośrednio przed eksperymentem)
Bufor do płukania o wysokiej zawartości soli
50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 500 mM KCl 0,05% (v/v) NP40 0,5 mM DTT (dodać bezpośrednio przed eksperymentem) kompletny koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA (Roche) (dodać bezpośrednio przed eksperymentem)
Bufor defosforylacyjny
50 mM Tris-HCl, pH 7,9 100 mM NaCl 10 mM MgCl2 1 mM DTT
Bufor do płukania fosfatazy
50 mM Tris-HCl, pH 7,5 20 mM EGTA 0,5% (v/v) NP40
Bufor kinazy polinukleotydowej (PNK) bez DTT
50 mM Tris-HCl, pH 7,5 50 mM NaCl 10 mM MgCl2
50 mM Tris-HCl, pH 7,5 50 mM NaCl 10 mM MgCl2 5 mM DTT
bufor ładowania strony SDS
10% glicerolu (v/v) 50 mM Tris-HCl, pH 6,8 2 mM EDTA 2% SDS (w/v) 100 mM DTT 0,1% błękit bromofenolowy
2x bufor proteinazy K
100 mM Tris-HCl, pH 7,5 150 mM NaCl 12,5 mM EDTA 2% (w/v) SDS