Wytwarzanie mikrotkanek przy użyciu modułów komórek zawierających żel kolagenowy

Summary

Tworzenie mikrotkanek za pomocą cylindrycznych żeli kolagenowych, zwanych modułami, które zawierają osadzone komórki i których powierzchnia jest pokryta komórkami śródbłonka.

Abstract

Protokół ten opisuje wytwarzanie rodzaju mikrotkanek zwanych modułami. Podejście modułowe generuje jednolite, skalowalne i unaczynione tkanki. Moduły mogą być wykonane z kolagenu, a także innych materiałów żelowalnych lub sieciowalnych. Po wyprodukowaniu mają około 2 mm długości i 0,7 mm średnicy, ale kurczą się wraz z osadzonymi komórkami lub gdy moduły są pokryte komórkami śródbłonka. Moduły pojedynczo są na tyle małe, że osadzone komórki znajdują się w limicie dyfuzji tlenu i innych składników odżywczych, ale moduły można upakować razem, tworząc większe tkanki, które są przepuszczalne. Tkanki te mają budowę modułową, ponieważ różne typy komórek mogą być osadzone w modułach lub pokryte nimi, zanim zostaną one upakowane razem, tworząc złożone tkanki. Istnieją trzy główne etapy tworzenia modułów: (1) neutralizacja kolagenu i osadzanie w nim komórek, (2) żelowanie kolagenu w tubie i cięcie modułów oraz (3) powlekanie modułów komórkami śródbłonka.

Protocol

1) Przygotowanie rurki

1. Wytnij rurki polietylenowe o długości od 2 do 3 m (średnica wewnętrzna 0,76 mm x średnica zewnętrzna 1,22 mm).
2. Nawlecz igłę 20 G1 na jeden koniec rurki.
3. Zwiń rurkę i umieść w samouszczelniającej się torbie konwertera (7 1/2" x 13"). Dwa końce rurki należy umieścić na nieszczelnym końcu worka i przykleić taśmą taśmą do sterylizacji gazowej.
4. Worek uszczelniający i sterylizacja gazowa.

2) Neutralizacja kolagenu

Uwaga: 1 ml kolagenu wypełnia około 2 m rurki polietylenowej.

1. Umieść niezbędną ilość kolagenu potrzebną do uzyskania pożądanej długości rurki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i trzymaj na lodzie.
2. Dodać 128 μl 10x α-MEM na ml kolagenu do probówki i wymieszać, wielokrotnie pipetując roztwór. Uwaga: (1) Roztwór powinien zmienić kolor na żółty, gdy α-MEM zostanie zmieszany z zakwaszonym kolagenem i (2) staraj się zminimalizować pęcherzyki podczas mieszania.
3. Zneutralizuj kolagen, dodając 0,8 M wodorowęglanu sodu, aż kolagen osiągnie pH 7,4. Aby ogólnie oszacować pH, dodawaj wodorowęglan sodu, aż żółty roztwór kolagenu zmieni kolor na jasnoróżowy. Uwaga: Zwykle potrzeba od 30 do 60 μl na każdy ml kolagenu.
4. Trzymaj zneutralizowany kolagen na lodzie, aż będzie gotowy do użycia, ponieważ zneutralizowany kolagen będzie żelował, jeśli nie będzie przechowywany w temperaturze 4°C.

3) Osadzanie komórek (opcjonalnie)

Uwaga: W zależności od typu komórki, komórki mogą być osadzone w stężeniu od 1 miliona komórek na ml do 20 milionów komórek na ml. Użyj nośnika wymaganego dla komórek, które chcesz osadzić.

1. Usunąć pożywkę z komórek i przemyć 5 ml PBS.
2. Usuń PBS i dodaj 3 ml trypsyny-EDTA.
3. Inkubować komórki w trypsyno-EDTA przez 5 minut w temperaturze 37°C.
4. Zawieś komórki w pożywce o pojemności 7 ml.
5. Policz komórki.
6. Przenieś wymaganą liczbę komórek do osadzenia do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
7. Granulować komórki w rozmiarze 300 x g przez 5 minut.
8. Odessać pożywkę z osadu komórkowego.
9. Ponownie zawiesić komórki w zneutralizowanym kolagenie i trzymać na lodzie.

4) Żelowanie kolagenu

1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego odetnij szczelny koniec worka zawierającego rurkę polietylenową.
2. Podłącz strzykawkę o pojemności 3 ml do igły 20G na jednym końcu rurki za pomocą wysterylizowanej pęsety. Trzymaj rurkę w torbie.
3. Włóż drugi koniec rurki do zneutralizowanego kolagenu, aż końcówka znajdzie się na dnie stożkowej rurki za pomocą wysterylizowanej pęsety. Trzymaj stożkową rurkę na lodzie.
4. Wciągnąć kolagen do rurki polietylenowej, powoli cofając tłok strzykawki.
   Uwaga: Jeśli kolagen zostanie szybko wciągnięty do rurki, w kolagenie utworzą się bąbelki.
5. Po przeciągnięciu kolagenu przez rurkę wyciągnij igłę 20G z rurki i włóż oba końce z powrotem do torby. Zaklej torbę taśmą.
6. Inkubować worek w temperaturze 37°C przez 60 minut. Jeśli kolagen zawiera komórki, przewracaj worek co 15 minut, aby komórki nie osiadały na jednej stronie modułu.

5) Cięcie rurki zawierającej żelowany kolagen

1. Autoklaw kolektory i ostrze do urządzenia tnącego i tacy do przytrzymywania przewodów.
2. Zamontuj urządzenie tnące.
3. Umieść rurkę w sterylnej tacy przed urządzeniem tnącym i załaduj rurkę do urządzenie do cięcia.
4. Ustawić stożkową probówkę o pojemności 50 ml zawierającą 25 ml pożywki na wylocie cięcia urządzenie do zbierania wyciętych modułów.
   Uwaga: Używaj nośników zawierających FBS nawet w przypadku modułów zawierających tylko kolagen, ponieważ moduły nie oddzielają się od rurki bez FBS w mediach. Jeśli moduły zawierają komórki, należy użyć nośnika wymaganego dla osadzonych komórek. Jeśli w modułach nie ma osadzonych komórek, użyj pożywki dla komórek śródbłonka.
5. Ustaw urządzenie tnące tak, aby przecięło rurki o długości 2 mm i przetnij rurkę.
6. Inkubować pocięte moduły w temperaturze 37°C przez 60 minut w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.

6) Usuwanie modułów kolagenowych z rurki

1. Stożkowa probówka Vortex 50 ml zawierająca moduły w wężyku przez 10 sek.
   Uwaga: Zachowaj ostrożność podczas oddzielania modułów osadzonych o dużej gęstości komórek, aby uniknąć pęknięcia.
2. Pozwól modułom osiądnąć na dnie rury. Czas trwania ok. 5 min.
3. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml z szeroką ustą przenieść osadzone moduły do pipety o pojemności 15 ml rurka stożkowa.
4. Powtórz kroki od 6.1 do 6.3 dwukrotnie.
5. Przejdź do kroku 7, aby pokryć moduły komórkami śródbłonka lub przenieść moduły do tkanki innej niż tkanka talerz poddany obróbce kulturowej.

7) Powlekanie modułów komórkami śródbłonka

1. Umieść moduły na dnie stożkowej probówki o pojemności 15 ml z 5 ml pożywki dla osadzonego Komórek.
2. Usunąć pożywkę z komórek śródbłonka i przemyć 5 ml PBS.
3. Usuń PBS i dodaj 3 ml trypsyny-EDTA.
4. Inkubować komórki w trypsyno-EDTA przez 5 minut w temperaturze 37°C.
5. Zawieś komórki w pożywce o pojemności 7 ml.
6. Policz komórki. Potrzebujesz 5x10⁶ komórek śródbłonka na ml upakowanych modułów na dnie rurka stożkowa.
7. Osadzać komórki w masie 300 x g przez 5 minut i ponownie zamieszać w 5 ml pożywki z komórek śródbłonka.
8. Dodać 5 ml pożywki zawierającej komórki śródbłonka do modułów.
   Uwaga: Daje to stosunek 50:50 dwóch typów pożywek, które, jak odkryliśmy, działają na rzecz przetrwania i funkcji obu typów komórek. Przetestuj użycie pożywki do kohodowli opracowanej w celu zapewnienia prawidłowego utrzymania fenotypów dwóch typów komórek przed jego użyciem.
9. Inkubuj moduły z komórkami śródbłonka zarówno statycznie, jak i dynamicznie.
10. Do inkubacji statycznej wymieszać moduły z komórkami śródbłonka metodą inwersji i ustawić probówkę pionowo w temperaturze 37°C na 15 minut. Powtórzyć.
11. Dynamicznie zasiewaj komórki śródbłonka, delikatnie kołysząc rurką w temperaturze 37°C przez 60 minut.
12. Powtórzyć inkubację statyczną dwukrotnie.
13. Umieścić moduły na płytce poddanej hodowli nietkankowej i inkubować przez noc w temperaturze 37°C.
14. Następnego dnia umieść moduły na nowej płytce poddanej działaniu hodowli nietkankowej ze świeżą pożywką (mieszanka 50:50 w przypadku stosowania systemu kohodowli) w celu usunięcia nieprzyłączonych komórek śródbłonka.
15. Inkubuj moduły, które są pokryte komórkami śródbłonka, aż pokryją 100% powierzchni modułów. Zwykle trwa to około 7 dni.

8) Reprezentatywne wyniki:

Moduły będą wyglądały na cylindryczne, gdy zostaną po raz pierwszy wyjęte z tuby. Jeśli moduły zawierają osadzone komórki i/lub są pokryte komórkami śródbłonka, mogą skurczyć się do 50% objętości i rozwinąć owalny kształt (ryc. 1). Moduły staną się również gęstsze i bardziej nieprzezroczyste, gdy będą oglądane pod mikroskopem świetlnym (ryc. 1). Również wtedy, gdy komórki śródbłonka zlewają się na powierzchni modułów, dochodzi do tworzenia ścisłych połączeń, które można zaobserwować za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego VE-kadheryny (ryc. 2). Analiza transferu masy wykazała, że moduły są zdolne do utrzymywania dużych gęstości komórek (8x10⁷ komórek/cm³) bez rozwoju martwiczego rdzenia z powodu niewystarczającego transportu tlenu, co jest często problematyczne w większych tkankach (np. moduły o dużej średnicy, D = 1,4 mm) (ryc. 3).

Rysunek 1: Produkcja i kurczenie modułów. Skurcz modułu nastąpił w ciągu trzech dni po wysiewie HUVEC-C (linia komórek śródbłonka), co skutkuje znacznie mniejszą średnicą i długością modułu (p < 0,001) (A). Osadzone komórki HepG2 były równomiernie rozmieszczone w modułach w czasie produkcji i zachowały wysoką żywotność (B). [Żywe komórki zielone; martwe komórki czerwone] [na podstawie Corstorphine 2010]

Rysunek 2: Barwienie immunofluorescencyjne VE-Kadheryny ścisłych połączeń komórkowych EC 10 dni po RAEC zostało pokryte na powierzchni modułu. Podziałka = 50 μm.

Rysunek 3: Barwienie trichromowe typowych modułów (średnica początkowa 0,76 mm) i dużych modułów (średnica początkowa 1,4 mm) pokazuje wpływ ograniczeń dyfuzji tlenu. Siedem dni po wyprodukowaniu, duża liczba martwych komórek utworzyła się w rdzeniu dużych modułów (prawy dolny panel), pozostawiając tylko cienką obwódkę (o grubości ~200 μm) żywych komórek. I odwrotnie, małe moduły zachowały równomierny i wysoki rozkład żywych komórek. [Moduły osadzone w komórkach HepG2 i pokryte komórkami śródbłonka.] [Zaczerpnięte z Corstorphine 2010]

Rysunek 4: (A) HMEC-1 wysiewany na modułach poloksamina - kolagen. Po 1 dniu wysiewu moduły poloksamina-kolagen zachowują swój cylindryczny kształt i mają ograniczone właściwości przyłączania komórek w porównaniu z modułami zawierającymi tylko kolagen. Podziałka = 200 μm. (B) Obraz z mikroskopu świetlnego modułu kolagenowego zawierającego biodegradowalne mikrosfery na bazie PLGA. Podziałka = 500 μm.

Rysunek 5: Przykłady testów in vitro. (A) Test angiogenezy: formacje przypominające naczynia włosowate na module wysianym komórkami śródbłonka można łatwo wykryć i określić ilościowo po 5 dniach inkubacji z komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej. (B) Obrazy z mikroskopii konfokalnej testu żywego/martwego na modułach, w których barwienie żywych komórek jest zielone, a martwe komórki czerwone.

Rysunek 6: Moduły kolagenowe zawierające osadzone mezenchymalne komórki macierzyste oraz warstwę powierzchniową komórek śródbłonka. Moduły poddano naprężeniom ścinającym (~0,64 dyn/^cm2) przez 7 dni w komorze mikroprzepływowej i zaczęły wykazywać stopienie w punktach styku. Komórki śródbłonka są zabarwione vWF (brązowe), a jądra mezenchymalnych komórek macierzystych są niebieskie (H&E). Podziałka = 100μm.

Rysunek 7: Setki modułów kolagenowych zawierających komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) i pokrytych ludzkimi komórkami śródbłonka mikronaczyniowego (HMEC) są wszczepiane pod skórę myszy w celu zbadania interakcji ASC/HMEC in vivo w zastosowaniach związanych z regeneracją tłuszczu.

Discussion

Wytworzyliśmy kilka różnych mikrotkanek przy użyciu modułów osadzonych w różnych typach komórek^1-11. Z powodzeniem osadziliśmy pierwotne kardiomiocyty, wyspy trzustkowe, tłuszczowe komórki macierzyste i mezenchymalne komórki zrębowe, a także kilka linii komórkowych, w tym HepG2, NIH 3T3 i klon 9 komórek wątroby. Pokryliśmy moduły kilkoma typami komórek śródbłonka, w tym komórkami śródbłonka aorty szczura, ludzkimi komórkami śródbłonka żyły pępowinowej i ludzkimi komórkami śródbłonka mikronaczyniowego. Wypro...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rurki Intramedic PE60	BD Biosciences	427416	Do zmiany średnicy modułów można użyć różnych średnic przewodów
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	GIBCO, firmy Life Technologies	20012-027
Trypsin-EDTA	GIBCO, firmy Life Technologies	25200-072
Zakwaszony kolagen Purcol, 3 mg/ml	Cedarlane Labs	5005-B
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	S5761
Igła 20G	BD Biosciences	305175	Średnica igły musi być zbliżona do średnicy rurki
Strzykawka 3 ml	BD Biosciences	309585
Probówka 15 ml	BD Biosciences	352096
Probówka 50 ml	BD Biosciences	352070
Konwertery Torebka samouszczelniająca 7 1/2” x 13”	Cardinal Health	92713
Pipeta serologiczna z szeroką końcówką 10 ml	BD Biosciences	357504
Pipeta serologiczna 10 ml	BD Biosciences	357551
Pipeta serologiczna 5 ml	BD Biosciences	357543