Tworzenie mikrotkanek przy użyciu cylindrycznych żeli kolagenowych, nazywanych modułami, które zawierają zatopione komórki, a ich powierzchnia jest pokryta komórkami śródbłonka.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wytwarzanie mikrotkanek z wykorzystaniem modułów żelu kolagenowego zawierającego komórki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niniejszy protokół opisuje wytwarzanie rodzaju mikrotkanek nazywanych modułami. Podejście modułowe pozwala na uzyskanie jednorodnych, skalowalnych i unaczynionych tkanek. Moduły mogą być wykonane z kolagenu, jak również z innych materiałów żelujących lub sieciujących. Bezpośrednio po wytworzeniu mają one długość około 2 mm i średnicę 0,7 mm, jednak ich rozmiar zmniejsza się w przypadku obecności zatopionych komórek lub gdy moduły zostaną pokryte komórkami śródbłonka. Pojedyncze moduły są na tyle małe, że zatopione w nich komórki znajdują się w granicach limitu dyfuzji tlenu i innych składników odżywczych, natomiast moduły mogą być łączone w celu utworzenia większych, perfuzyjnych tkanek. Tkanki te mają konstrukcję modułową, ponieważ przed ich połączeniem w złożone struktury tkankowe w modułach można zatopić lub na ich powierzchni osadzić różne typy komórek. Proces tworzenia modułów składa się z trzech głównych etapów: (1) neutralizacji kolagenu i zatopienia w nim komórek, (2) żelowania kolagenu w probówce i wycięcia modułów oraz (3) pokrycia modułów komórkami śródbłonka.
Protokół
1) Przygotowanie drenów
- Odciąć odcinki rurki polietylenowej o długości od 2 do 3 m (średnica wewnętrzna 0,76 mm x średnica zewnętrzna 1,2 mm).
- Wsunąć igłę 20 G1 w jeden z końców rurki.
- Zwinąć rurkę w coil i umieścić w samouszczelniającej torebce do autoklawowania (7 1/2" x 13"). Oba końce rurki należy umieścić przy nieszczelnym końcu torebki i przymocować za pomocą taśmy do sterylizacji gazowej.
- Zamknąć torebkę i poddać sterylizacji gazowej.
2) Neutralizacja kolagenu
Uwaga: 1 ml kolagenu wypełnia około 2 m rurki polietylenowej.
- Umieść w stożkowatej probówce o pojemności 15 ml odpowiednią ilość kolagenu niezbędną do uzyskania pożądanej długości rurki i przechowuj na lodzie.
- Do probówki dodaj 128 uL 10x α-MEM na każdy mL kolagenu i wymieszaj, wielokrotnie pipetując roztwór. Uwaga: (1) roztwór powinien zmienić kolor na żółty w miarę mieszania α-MEM z zakwaszonym kolagenem oraz (2) podczas mieszania należy starać się ograniczyć powstawanie pęcherzyków powietrza.
- Zneutralizuj kolagen, dodając 0,8 M wodorowęglan sodu, aż kolagen osiągnie pH 7,4. Aby wstępnie oszacować pH, dodawaj wodorowęglan sodu, dopóki żółty roztwór kolagenu nie zmieni koloru na jasnoróżowy. Uwaga: zazwyczaj potrzeba od 30 do 60 μL na każdy mL kolagenu.
- Przechowuj zneutralizowany kolagen na lodzie do momentu użycia, ponieważ w temperaturze powyżej 4°C zneutralizowany kolagen ulegnie żelowaniu.
3) Osadzanie komórek (opcjonalnie)
Uwaga: W zależności od typu komórek, można je zamykać w matrycy w stężeniu od 1 miliona komórek na mL do 20 milionów komórek na mL. Należy użyć pożywki wymaganej dla komórek, które mają zostać zamknięte w matrycy.
- Usunąć medium z komórek i przemyć je 5 mL PBS.
- Usunąć PBS i dodać 3 mL trypsyny-EDTA.
- Inkubować komórki w trypsynie-EDTA przez 5 min w temperaturze 37°C.
- Resuspendować komórki w 7 mL medium.
- Policzyć komórki.
- Przenieść wymaganą liczbę komórek do zatopienia do probówki stożkowej o pojemności 15 mL.
- Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 min.
- Odssać medium znad osadu komórkowego.
- Resuspendować komórki w zneutralizowanym kolagenie i przechowywać na lodzie.
4) Żelowanie kolagenu
- W komorze z laminarnym przepływem powietrza odciąć zamknięty koniec worka zawierającego rurkę polietylenową.
- Za pomocą sterylnej pęsety przymocować strzykawkę 3 ml do igły 20G znajdującej się na jednym końcu rurki. Rurkę należy pozostawić w worku.
- Za pomocą sterylnej pęsety wprowadzić drugi koniec rurki do zneutralizowanego kolagenu, aż jej końcówka dotrze do dna probówki stożkowej. Probówkę stożkową należy przechowywać na lodzie.
- Wciągnąć kolagen do rurki polietylenowej, powoli cofając tłok strzykawki.
Uwaga: Zbyt szybkie wciąganie kolagenu do rurki spowoduje powstanie pęcherzyków powietrza w kolagenie. - Po przeciągnięciu kolagenu przez rurkę, wyjąć igłę 20G z rurki i włożyć oba jej końce z powrotem do worka. Zamknąć worek taśmą.
- Inkubować worek w temperaturze 37°C przez 60 min. Jeśli kolagen zawiera komórki, należy odwracać worek co 15 min, aby zapobiec osiadaniu komórek na jednej stronie modułu.
5) Odcinanie rurek zawierających żelową kolagenową strukturę
- Autoklawować głowice i ostrze urządzenia tnącego oraz tackę do rurek.
- Złożyć urządzenie tnące.
- Umieścić rurki w sterylnej tacce przed urządzeniem tnącym, a następnie załadować rurki do urządzenia.
- Przygotować probówkę stożkową 50 mL zawierającą 25 mL pożywki na wylocie urządzenia tnącego, aby zebrać odcięte moduły.
Uwaga: Należy stosować pożywkę zawierającą FBS nawet w przypadku modułów składających się wyłącznie z kolagenu, ponieważ bez FBS w pożywce moduły nie oddzielają się od rurek. Jeśli moduły zawierają komórki, należy użyć pożywki wymaganej dla wbudowanych komórek. W przypadku braku wbudowanych komórek w modułach należy użyć pożywki dla komórek śródbłonka. - Ustawić urządzenie tnące tak, aby odcinało odcinki rurek o długości 2 mm, i przeciąć rurki.
- Inkubować odcięte moduły w temperaturze 37°C przez 60 min w probówce stożkowej 50 mL.
6) Usuwanie modułów kolagenowych z rurki
- Przez 10 s wytrząśnij na vortexerze probówkę stożkową 50 mL zawierającą moduły w probówce.
Uwaga: Należy zachować ostrożność podczas rozdzielania modułów o wysokiej gęstości komórek, aby uniknąć ich uszkodzenia. - Pozostaw moduły do czasu, aż opadną na dno probówki. Zajmuje to około 5 min.
- Za pomocą szerokootworowej pipety serologicznej 10 mL przenieś osadzone moduły do probówki stożkowej 15 mL.
- Powtórz kroki od 6.1 do 6.3 dwukrotnie.
- Przejdź do kroku 7, aby pokryć moduły komórkami śródbłonka, lub przenieś moduły na płytkę, która nie była poddana obróbce do hodowli tkanek.
7) Pokrywanie modułów komórkami śródbłonka
- Umieść moduły na dnie probówki stożkowej o pojemności 15 mL z 5 mL pożywki dla zatopionych komórek.
- Usuń pożywkę z komórek śródbłonka i przemyj je 5 mL PBS.
- Usuń PBS i dodaj 3 mL trypsyny-EDTA.
- Inkubuj komórki w trypsynie-EDTA przez 5 min w temperaturze 37°C.
- Resuspenduj komórki w 7 mL pożywki.
- Policz komórki. Wymagane jest 5x106 komórek śródbłonka na 1 mL upakowanych modułów na dnie probówki stożkowej.
- Odwiruj komórki przy 30 x g przez 5 min i resuspenduj w 5 mL pożywki dla komórek śródbłonka.
- Dodaj 5 mL pożywki zawierającej komórki śródbłonka do modułów.
Uwaga: Zapewnia to stosunek 50:50 dwóch rodzajów pożywek, co według naszych obserwacji sprzyja przeżywalności i funkcji obu typów komórek. Przed zastosowaniem pożywki do kokultury sformułowanej w celu zapewnienia właściwego utrzymania fenotypów obu typów komórek, należy przetestować jej działanie. - Inkubuj moduły z komórkami śródbłonka zarówno statycznie, jak i dynamicznie.
- W przypadku inkubacji statycznej wymieszaj moduły z komórkami śródbłonka poprzez odwrócenie probówki, a następnie ustaw ją pionowo w temperaturze 37°C na 15 min. Powtórz tę czynność.
- Przeprowadź dynamiczny zasiew komórek śródbłonka, delikatnie kołysząc probówką w temperaturze 37°C przez 60 min.
- Powtórz inkubację statyczną dwukrotnie.
- Umieść moduły na płytce nieprzetraktowanej do hodowli tkanek i inkubuj przez noc w temperaturze 37°C.
- Następnego dnia przenieś moduły na nową płytkę nieprzetraktowaną do hodowli tkanek ze świeżą pożywką (mieszanka 50:50 w przypadku systemu kokultury), aby usunąć nieprzytwierdzone komórki śródbłonka.
- Inkubuj moduły pokryte komórkami śródbłonka, aż pokryją one 100% powierzchni modułów. Zazwyczaj zajmuje to około 7 dni.
8) Reprezentatywne wyniki:
Po wyjęciu z probówki moduły będą miały kształt cylindryczny. Jeśli moduły zawierają zatopione komórki i/lub są pokryte komórkami śródbłonka, mogą skurczyć się o maksymalnie 50% objętości i przyjąć kształt owalny (Rysunek 1). W badaniu pod mikroskopem świetlnym moduły staną się również gęstsze i bardziej nieprzezroczyste (Rysunek 1). Ponadto, gdy komórki śródbłonka osiągną konfluencję na powierzchni modułów, powstają połączenia ścisłe, co można zaobserwować poprzez barwienie immunofluorescence VE-Cadherin (Rysunek 2). Analiza transportu masy wykazała, że moduły są w stanie utrzymać wysoką gęstość komórkową (8x107 komórek/cm3) bez tworzenia się rdzenia nekrotycznego wynikającego z niewystarczającego transportu tlenu, co często stanowi problem w większych tkankach (np. w modułach o dużej średnicy, D = 1,4mm) (Rysunek 3).
Rycina 1: Wytwarzanie i kurczenie się modułu. Kurczenie się modułu wystąpiło w ciągu trzech dni po wysianiu komórek HUVEC-C (linia komórek śródbłonka), co skutkowało istotnie mniejszą średnicą i długością modułu (p < 0,01) (A). Osadzone komórki HepG2 były rozmieszczone równomiernie w obrębie modułów w momencie wytwarzania i zachowały wysoką żywotność (B). [Komórki żywe – zielone; komórki martwe – czerwone] [zaadaptowano z Corstorphine 2010]
Rysunek 2: Barwienie immunofluorescencyjne VE-kadheryny w szczelnych złączach komórkowych EC 10 dni po naniesieniu RAEC na powierzchnię modułu. Pasek skali = 50 μm.
Rysunek 3: Barwienie trichromem Massona typowych modułów (początkowa średnica 0,76 mm) oraz dużych modułów (początkowa średnica 1,4 mm) wykazuje wpływ ograniczeń dyfuzji tlenu. Siedem dni po wytworzeniu w rdzeniu dużych modułów powstała znaczna liczba martwych komórek (panel w prawym dolnym rogu), pozostawiając jedynie cienką obwódkę (~200μm grube) żywych komórek. Odwrotnie, małe moduły zachowały jednolity i wysoki rozkład żywych komórek. [Moduły z zatopionymi komórkami HepG2 i pokryte komórkami śródbłonkowymi.] [Pobrano z Corstorphine 2010]
Rysunek 4: (A) Komórki HMEC-1 wysiane na modułach poloksamina-kolagen. Po pierwszym dniu wysiewu moduły poloksamina-kolagen zachowują swój cylindryczny kształt, a właściwości przylegania komórek są ograniczone w porównaniu z modułami składającymi się z samego kolagenu. Pasek skali = 200 μm(B) Obraz z mikroskopu świetlnego modułu kolagenowego zawierającego biodegradowalne mikrosfery na bazie PLGA. Pasek skali = 500 μm.
Rysunek 5: Przykłady in vitro analizy. (A) Analiza angiogenezy: formacje przypominające kapilary na module zasianym komórkami śródbłonka mogą być łatwo wykryte i ilościowo określone po 5 dniach inkubacji z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej. (B) Obrazy z mikroskopii konfokalnej z analizy żywotności komórek (live/dead assay) na modułach, gdzie barwienie komórek żywych jest zielone, a martwych czerwone.
Rycina 6: Moduły kolagenowe zawierające zatopione mezenchymalne komórki macierzyste oraz powierzchniową warstwę komórek śródbłonka. Moduły poddano naprężeniom ścinającym (~0,64 dyn/cm²).2) przez 7 dni w komorze mikrofluidycznej i zaczynają wykazywać fuzję w punktach styku. Komórki śródbłonka są barwione na vWF (brązowy), a jądra mezenchymalnych komórek macierzystych mają kolor niebieski (H&E). Pasek skali = 100μm.
Rycina 7: Setki modułów kolagenowych zawierających mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) i pokrytych ludzkimi mikrovascularnymi komórkami śródbłonka (HMEC) zostają zaimplantowane pod skórę myszy w celu zbadania interakcji między ASC a HMEC in vivo do zastosowań w regeneracji tkanki tłuszczowej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wyprodukowaliśmy kilka różnych mikro-tkanek, wykorzystując moduły z zatopionymi różnymi typami komórek1-11. Z sukcesem zatopiliśmy pierwotne kardiomiocyty, wysepki trzustkowe, komórki macierzyste tkanki tłuszczowej i mezenchymalne komórki macierzyste, a także kilka linii komórkowych, w tym HepG2, NIH 3T3 i komórki wątroby klonu 9. Powlekliśmy moduły kilkoma typami komórek śródbłonka, w tym szczurzymi komórkami śródbłonka aorty, ludzkimi komórkami śródbłonka żyły pępowinowej oraz ludzkimi komórkami śródbłonka m...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Finansowanie zostało zapewnione przez National Institutes of Health (EB 001013), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada oraz Canadian Institutes of Health Research. Dziękujemy dr A. P. McGuigan za wiedzę ekspercką i pomoc w opracowaniu modułów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przewody Intramedic PE60 | BD Biosciences | 427416 | W celu zmiany średnicy modułów można zastosować przewody o innej średnicy |
| Fosforanowo-buforowana sól fizjologiczna (PBS) | GIBCO, by Life Technologies | 20012-027 | |
| Trypsyna-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25200-072 | |
| Zakwaszony kolagen Purcol, 3 mg/mL | Cedarlane Labs | 5005-B | |
| Wodorowęglan sodu | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Igła 20G | BD Biosciences | 305175 | Średnica igły powinna być zbliżona do średnicy przewodu |
| Strzykawka 3 mL | BD Biosciences | 309585 | |
| Probówka 15 mL | BD Biosciences | 352096 | |
| Probówka 50 mL | BD Biosciences | 352070 | |
| Samouszczelniające opakowania Convertors 7 1/2” x 13” | Cardinal Health | 92713 | |
| Pipeta serologiczna z szerokim końcem 10 ml | BD Biosciences | 357504 | |
| Pipeta serologiczna 10 ml | BD Biosciences | 357551 | |
| Pipeta serologiczna 5 ml | BD Biosciences | 357543 |
Bibliografia
- Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules. , (2010).
- Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells. J Tissue Eng Regen Med. , (2010).
- Gupta, R., Van Rooijen, N., Sefton, M. V. Fate of endothelialized modular constructs implanted in an omental pouch in nude rats. Tissue Eng. Part A 15, 2875-2887 (2009).
- Leung, B. M., Sefton, M. V. A modular tissue engineering construct containing smooth muscle cells and endothelial cells. Ann Biomed Eng. 35, 2039-2049 (2007).
- McGuigan, A. P., Leung, B., Sefton, M. V. Fabrication of cell-containing gel modules to assemble modular tissue-engineered constructs [corrected]. Nat Protoc. 1, 2963-2969 (2006).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Vascularized organoid engineered by modular assembly enables blood perfusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11461-11466 (2006).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Modular tissue engineering: fabrication of a gelatin-based construct. J Tissue Eng Regen Med. 1, 136-145 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Design and fabrication of sub-mm-sized modules containing encapsulated cells for modular tissue engineering. Tissue Eng. 13, 1069-1078 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Design criteria for a modular tissue-engineered construct. Tissue Eng. 13, 1079-1089 (2007).
- McGuigan, A. P., Sefton, M. V. The thrombogenicity of human umbilical vein endothelial cell seeded collagen modules. Biomaterials. 29, 2453-2463 (2008).
- Sosnik, A., Leung, B., McGuigan, A. P., Sefton, M. V. Collagen/poloxamine hydrogels: cytocompatibility of embedded HepG2 cells and surface-attached endothelial cells. Tissue Eng. 11, 1807-1816 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
