Detekcja biomolekularna z wykorzystaniem interferometrycznego czujnika obrazowania odbiciowego (IRIS)

Podsumowanie

Ilościowe, wysokoprzepustowe, w czasie rzeczywistym i bez znakowania wykrywanie biomolekuł (DNA, białek itp.) na powierzchniach SiO₂ można osiągnąć za pomocą prostej techniki interferometrycznej, która opiera się na oświetleniu LED, minimalnej liczbie komponentów optycznych i kamerze. Sensor obrazowania odbiciowego interferometrycznego (IRIS) jest niedrogi, prosty w obsłudze i dostosowany do formatów mikromacierzy.

Streszczenie

Czuły pomiar oddziaływań biomolekularnych znajduje zastosowanie w wielu dziedzinach i przemysłach, takich jak biologia podstawowa i mikrobiologia, monitorowanie środowiska, rolnictwa i obrony biologicznej, nanobiotechnologia i inne. W zastosowaniach diagnostycznych monitorowanie (wykrywanie) obecności, braku lub nieprawidłowej ekspresji celowanych biomarkerów proteomicznych lub genomicznych w próbkach pacjentów może być wykorzystane do określenia metod leczenia lub skuteczności terapii. W badaniach naukowych informacje o powinowactwie i specyficzności cząsteczek są przydatne do pełnej charakterystyki badanych układów.

Wiele z obecnie stosowanych systemów służących do określania stężeń lub powinowactw cząsteczkowych opiera się na zastosowaniu znaczników. Przykładami takich systemów są analizy immunologiczne, takie jak enzymatyczny test immunoabsorpcyjny (ELISA), techniki reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), analizy elektroforezy żelowej oraz spektrometria mas (MS). Zazwyczaj znaczniki te mają charakter fluorescencyjny, radiologiczny lub kolorymetryczny i są przyłączone bezpośrednio lub pośrednio do interesującej nas cząsteczki docelowej. Chociaż stosowanie znaczników jest powszechnie akceptowane i niesie ze sobą pewne korzyści, istnieją wady, które stymulują rozwój nowych metod bez użycia znaczników (label-free) do pomiaru tych oddziaływań. Wady te obejmują aspekty praktyczne, takie jak zwiększony koszt analizy, ograniczony okres trwałości i użyteczność odczynników, kwestie przechowywania i bezpieczeństwa, czas i wysiłek poświęcony na znakowanie oraz zmienność między różnymi odczynnikami wynikająca z procesów znakowania lub samych znaczników. Z naukowego punktu widzenia stosowanie tych znaczników może również powodować trudności, takie jak obawy dotyczące wpływu na funkcjonalność lub strukturę białek w wyniku obecności przyłączonych znaczników oraz niemożność bezpośredniego pomiaru oddziaływań w czasie rzeczywistym.

Przedstawiono tutaj zastosowanie nowego bezznacznika optycznego biosensora odpowiedniego do badań mikroarray, nazwanego Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS), do wykrywania białek, DNA, materiału antygenowego, całych patogenów (wirionów) oraz innego materiału biologicznego. Wykazano, że system IRIS charakteryzuje się wysoką czułością, precyzją i powtarzalnością dla różnych oddziaływań biomolekularnych [1-3]. Do zalet należą możliwości obrazowania multipleksowego, pomiary w czasie rzeczywistym i końcowe, a także inne cechy wysokoprzepustowe, takie jak zmniejszone zużycie odczynników i skrócenie czasu trwania analizy. Ponadto platforma IRIS jest prosta w obsłudze, wymaga niedrogiego sprzętu i wykorzystuje komponenty do analiz w fazie stałej na bazie krzemu, co czyni ją kompatybilną z wieloma współczesnymi podejściami w zakresie chemii powierzchni.

W niniejszym materiale przedstawiamy zastosowanie systemu IRIS, od przygotowania macierzy sond, przez inkubację i pomiar wiązania celu, aż po analizę wyników w formacie punktu końcowego. Systemem modelowym będzie wychwytywanie przeciwciał docelowych specyficznych dla ludzkiej albuminy surowiczej (HSA) na podłożach z naniesioną HSA.

Protokół

1. Przygotowanie podłoża

1. Pokryć warstwową podłoża krzemowe-SiO₂ samoprzyswajającym się kopolimerem (DMA-NAS-MAPS):
   1. Synteza kopolimeru, struktura chemiczna i proces powlekania zostały opisane w: G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, L.E. Depero. Characterization of A Polymeric Adsorbed Coating for DNA Microarray Glass Slides. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-58.
   2. W skrócie: przygotować roztwór polimeru, dodając 100 mg polimeru do 5 mL wody dejonizowanej (DI), a następnie dodać 5 mL 40% nasyconego roztworu siarczanu amonu ((NH₄)2SO₄), aby uzyskać stężenie końcowe 0,92 M.
   3. Zanurzyć chipy w roztworze na 30 min na wytrząsarce, a następnie dokładnie wypłukać wodą DI. Dokładnie osuszyć gazem Argon/N₂.
   4. Wyprażyć chipy w temperaturze 80 °C przez 15 min.
2. Przechowywać podłoża/chipy pokryte polimerem w suchym środowisku (suszarce próżniowej) do 3 miesięcy do czasu przeprowadzenia procedury nanoszenia sond.

2. Przygotowanie macierzy sond: przeciwciała, antygeny, ss/dsDNA, RNA itp.

1. Rozcieńczyć sondę(sondy) do odpowiedniego stężenia w wybranym buforze. Ten krok może się znacznie różnić, jednak w typowym eksperymencie stosuje się antygen lub IgG o stężeniu 0.5 mg/mL (zakres 0.1 -1 mg/mL) w soli fosforanowej z buforem (PBS) o pH≈7.4.
2. Przenieść roztwory do płytki 96- lub 384-dołkowej (lub standardowej płytki źródłowej dla używanego urządzenia do nanoszenia próbek).
3. Ustawić parametry nanoszenia dla pożądanej macierzy: określić odpowiednie parametry nanoszenia dla stosowanej powierzchni i roztworów (czas kontaktu, prędkość zbliżania itp.). Ustalić liczbę powtórzeń każdego warunku na siatkę, układ siatki, liczbę powtórzonych siatek oraz pożądane miejsce nanoszenia na chipie. Umieścić podłoża i płytkę źródłową w odpowiednich miejscach, sprawdzić, czy butelki na odpady i zasilające są gotowe, a następnie rozpocząć proces drukowania.
4. Po zakończeniu nanoszenia umieścić podłoża w środowisku o wysokiej wilgotności na noc (od 4 do 18 godzin), aby umożliwić zajście procesu immobilizacji i dezaktywacji.
5. Przemyć podłoża: umieścić je w następujących roztworach na trzy minuty, wykonując trzy oddzielne płukania: PBS z 0.1% Tween (PBST), PBS, a na koniec w wodzie dejonizowanej (DI). W zależności od rodzaju eksperymentu (na mokro lub na sucho), dokładnie osuszyć chip gazem Argonem i rozpocząć inkubację lub umieścić chip w komorze przepływowej i złożyć układ.
6. Zdezaktywować pozostałe grupy NHS na powierzchni kopolimeru, zanurzając chipy w 50 mM roztworze etanolaminy z pH dostosowanym do 7.4 na 30 minut na płytce wstrząsowej. Można również zastosować związek zawierający aminę pierwszorzędową, taki jak hydroksylamina lub Tris, pod warunkiem, że przygotowany roztwór jest bezpieczny w kontakcie z białkami. Dokładnie wypłukać roztwór dezaktywujący za pomocą PBS, a następnie wody DI.
7. Krok opcjonalny (zależnie od stosowanej chemii powierzchni): Zablokować powierzchnię za pomocą roztworu BSA, kazeiny lub rehydratyzowanego mleka przez 30 minut. W przypadku obecnie stosowanej przez nas polimerowej chemii powierzchni nie wykonujemy tego kroku, ponieważ szkielet polimerowy zapobiega niespecyficznemu wiązaniu białek.

3. Procedura pozyskiwania danych i inkubacji: format końcowy

1. Przygotować roztwór badanego celu w odpowiednim buforze. W tym przypadku będzie to roztwór Anti-BSA o właściwym stężeniu w PBS (np. przygotować 1-10 mL roztworu Anti-BSA o stężeniu 10 ng/mL w PBS). Należy również przygotować równą ilość samego buforu (bez celu) do inkubacji kontroli negatywnej.
2. Wykonać skan lustra krzemowego w celu normalizacji wszystkich następnie gromadzonych danych.
3. Zeskanować przygotowaną matrycę sond za pomocą systemu IRIS przed etapem inkubacji, aby określić początkową wysokość optyczną (masę) w każdym punkcie. Pozwoli to na prawidłową analizę zmian masy na powierzchni, tj. poziomu wiązania, po inkubacji. Na tym etapie zostaną dostosowane parametry dla bieżącego eksperymentu, takie jak czas ekspozycji, pole widzenia, precyzyjne ogniskowanie itp.
4. Zanurzyć chip(y) w przygotowanym roztworze na 1 godzinę na wytrząsarce. Czas inkubacji może znacznie się różnić w zależności od stopnia mieszania, stężenia wykrywanego celu, charakterystyki transportu w komorze przepływowej (jeśli stosowany jest tryb detekcji w czasie rzeczywistym), powinowactw pary cel-sonda itp.
5. Po inkubacji powtórzyć procedurę płukania opisaną w kroku 2.5)
6. Zeskanować tę samą matrycę sond za pomocą systemu IRIS i uzyskać obrazy po inkubacji w celu porównania z wynikami sprzed inkubacji.
7. W razie potrzeby powtórzyć ten proces dla różnych etapów inkubacji, na przykład w formacie testu kanapkowego (sandwich assay), w którym stosowane jest przeciwciało wtórne.

4. Analiza danych

1. Dopasuj zebrane obrazy dla każdego skanu IRIS (sekwencji obrazów intensywności), korzystając z oprogramowania opracowanego w laboratorium, aby uzyskać obraz matrycy sond zawierający informacje o grubości optycznej. Szybką analizę jakościową wiązania można przeprowadzić poprzez odjęcie (zarejestrowanych) obrazów po inkubacji od obrazów przed inkubacją. Wiązanie będzie widoczne jako zmiana intensywności w miejscach, w których zaobserwowano zmiany masy. W celu przeprowadzenia analizy ilościowej wyznacz gęstości masy każdego punktu w porównaniu z tłem, obliczając średnią grubość optyczną dla każdego piksela w obrębie punktu oraz w pierścieniu wokół niego, a następnie dokonując bezpośredniego porównania tych dwóch obszarów.

5. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1 przedstawia przykładowy schemat warstwowego podłoża Si-SiO₂ IRIS z naniesioną reprezentatywną macierzą przeciwciał. Każdy zespół przeciwciał jest nanoszony w powtórzeniach, wykazując specyficzność wobec innego epitopu nakierowanego na różne białka. Jako przykładowe cele przedstawiono dwa różne całe wirusy oraz białko wirusowe. Przeciwciała kontrolne negatywne zależą od rodzaju analizy i mogą być niespecyficzne i/lub specyficzne dla wirusa.

Rysunek 2 przedstawia wiązanie przeciwciał specyficznych dla ludzkiej albuminy surowiczej (HSA) do matrycy z naniesionymi plamkami HSA oraz IgG królika (kontrola). Jak widać, po dopasowaniu i wyznaczeniu grubości optycznych dla obrazów przed i po inkubacji, można utworzyć obraz różnicowy dla matrycy wiązania w celu jakościowej oceny wiązania. Analiza ilościowa wykazuje, że przy stężeniu inkubacyjnym przeciwciał anty-HSA wynoszącym 500 ng/mL zaobserwowano średnią zmianę wysokości optycznej wynoszącą odpowiednio 2,05 i 0,13 nanometra dla plamek HSA i IgG królika.

Rysunek 3 przedstawia pomiar IRIS zależności wiązania białka Fur od stężenia białka i długości oligomeru dsDNA. Górny wykres przedstawia pomiary bezwzględnej wysokości optycznej dla początkowych wysokości unieruchomionych sond oligomerowych oraz wiązania Fur po inkubacji. Wzrost stężeń Fur (50, 100, 200 nM) spowodował zwiększone wiązanie z sondami DNA. Długość oligomerów również wpływa na wiązanie Fur, przy czym dłuższe sekwencje skutkują silniejszym wiązaniem. W tym przypadku słupki błędów reprezentują jedno odchylenie standardowe od średniej. Dolny wykres przedstawia obliczone wiązanie dimerów białka Fur na jedną nić dsDNA. Wiązanie dimerów uległo znacznemu zwiększeniu przy stężeniu białka Fur wynoszącym 200 nM, co sugeruje wysoki poziom wiązania nieswoistego.

Rycina 1. Schemat przykładowej macierzy sond zazwyczaj stosowanej w eksperymentach do multipleksowej detekcji specyficznych wirusów i komponentów wirusowych w systemie IRIS.

Rysunek 2. Obraz różnicowy po inkubacji dla wiązania przeciwciał specyficznych dla ludzkiej albuminy surowicy z naniesioną HSA, zarejestrowany za pomocą tego systemu bezetykietowego przy stężeniu 500 ng/mL. Gęstość masy biomateriału dla każdej plamki jest określana poprzez uśrednienie informacji o grubości optycznej w obrębie plamki, a następnie porównanie tej wartości ze średnią z pierścienia wokół plamki reprezentującego tło.

Rysunek 3. Wykres danych wiązania dla oddziaływań białka Fur z naniesionymi dwuniciowymi oligomerami o znanej sekwencji konsensus w zależności od długości oligomeru, położenia sekwencji konsensus w obrębie oligomeru oraz stężenia białka Fur. Informacje o bezwzględnej ilości białka Fur związanego z każdą naniesioną sekwencją (góra) mogą służyć do oszacowania liczby dimerów Fur związanych z każdym typem oligomeru (dół).

Dyskusja

Platforma IRIS to prosty i szybki system służący do gromadzenia wysokoprzepływowych danych o wiązaniu w formacie mikromacierzy. Poprzez kowalencyjne unieruchomienie różnych funkcjonalnych sond białkowych lub DNA na powierzchni, możliwe jest wychwytywanie docelowych antygenów/biomarkerów itp. z roztworu, podobnie jak w testach immunoologicznych. Pomiar tych oddziaływań w różnych warunkach sond w formacie punktu końcowego lub w czasie rzeczywistym za pomocą systemu IRIS pozwala na gromadzenie wysoce czułych i ilościowych informacji dla każdego oddziaływania. Reprezentatywny eksperyment opisany w niniejszym materiale jest jedynie przykładem rodzajów oddziaływań, które można badać za pomocą tej techniki. Wcześniej wykazano możliwość wykrywania czynników transkrypcyjnych, antygenów wirusowych oraz całych wirusów, co stanowi jedynie kilka przykładów analiz, które system IRIS może z łatwością przeprowadzić.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wafle krzemowe z 500 nm termicznie wyhodowanego dwutlenku krzemu	Silicon Valley Microelectronics
Siarczan amonu w proszku	Sigma-Aldrich	A5132
Gotowy koncentrat 10X roztworu soli fosforanowo-buforowanej (PBS)	Fisher Scientific	BP665-1
Przeciwciało przeciwko ludzkiej albuminie surowiczej (Anti-HSA)	Sigma-Aldrich	A0433
Ludzka albumina surowicza (HSA)	Sigma-Aldrich	A9511
Argon lub azot (ultra-wysokiej czystości)	Airgas	AR UHP300 or NI UHP300
Szalki Petriego, 60 mm x 15 mm	Fisher Scientific	0875713A
Desykator próżniowy Scienceware®	Sigma-Aldrich	Z119016
Probówki do mikrocentryfugi	Fisher Scientific	05-408-120
Płytki 96-dołkowe, o niskim wiązaniu komórek	Nalge Nunc international	145399
BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer	Bio-Rad
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Etanoloamina	Sigma-Aldrich	398136
Wodorotlenek amonu	Thermo Fisher Scientific, Inc.	26103
Rotator wielozadaniowy, model # 2314	Thermo Fisher Scientific, Inc.	2314Q
Kamera Retiga 2000R	QImaging	01-RET-2000R-F-M-12
Źródło oświetlenia AcuLED	PerkinElmer, Inc.
Komponenty optyczne (soczewki, obiektywy, przysłony, szyny, wsporniki itp.)	Thorlabs Inc.