Ilościowe, wysokoprzepustowe, w czasie rzeczywistym i bez znakowania wykrywanie biomolekuł (DNA, białek itp.) na powierzchniach SiO2 można osiągnąć za pomocą prostej techniki interferometrycznej, która opiera się na oświetleniu LED, minimalnej liczbie komponentów optycznych i kamerze. Sensor obrazowania odbiciowego interferometrycznego (IRIS) jest niedrogi, prosty w obsłudze i dostosowany do formatów mikromacierzy.
Artykuł metodologiczny
Detekcja biomolekularna z wykorzystaniem interferometrycznego czujnika obrazowania odbiciowego (IRIS)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Czuły pomiar oddziaływań biomolekularnych znajduje zastosowanie w wielu dziedzinach i przemysłach, takich jak biologia podstawowa i mikrobiologia, monitorowanie środowiska, rolnictwa i obrony biologicznej, nanobiotechnologia i inne. W zastosowaniach diagnostycznych monitorowanie (wykrywanie) obecności, braku lub nieprawidłowej ekspresji celowanych biomarkerów proteomicznych lub genomicznych w próbkach pacjentów może być wykorzystane do określenia metod leczenia lub skuteczności terapii. W badaniach naukowych informacje o powinowactwie i specyficzności cząsteczek są przydatne do pełnej charakterystyki badanych układów.
Wiele z obecnie stosowanych systemów służących do określania stężeń lub powinowactw cząsteczkowych opiera się na zastosowaniu znaczników. Przykładami takich systemów są analizy immunologiczne, takie jak enzymatyczny test immunoabsorpcyjny (ELISA), techniki reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), analizy elektroforezy żelowej oraz spektrometria mas (MS). Zazwyczaj znaczniki te mają charakter fluorescencyjny, radiologiczny lub kolorymetryczny i są przyłączone bezpośrednio lub pośrednio do interesującej nas cząsteczki docelowej. Chociaż stosowanie znaczników jest powszechnie akceptowane i niesie ze sobą pewne korzyści, istnieją wady, które stymulują rozwój nowych metod bez użycia znaczników (label-free) do pomiaru tych oddziaływań. Wady te obejmują aspekty praktyczne, takie jak zwiększony koszt analizy, ograniczony okres trwałości i użyteczność odczynników, kwestie przechowywania i bezpieczeństwa, czas i wysiłek poświęcony na znakowanie oraz zmienność między różnymi odczynnikami wynikająca z procesów znakowania lub samych znaczników. Z naukowego punktu widzenia stosowanie tych znaczników może również powodować trudności, takie jak obawy dotyczące wpływu na funkcjonalność lub strukturę białek w wyniku obecności przyłączonych znaczników oraz niemożność bezpośredniego pomiaru oddziaływań w czasie rzeczywistym.
Przedstawiono tutaj zastosowanie nowego bezznacznika optycznego biosensora odpowiedniego do badań mikroarray, nazwanego Interferometric Reflectance Imaging Sensor (IRIS), do wykrywania białek, DNA, materiału antygenowego, całych patogenów (wirionów) oraz innego materiału biologicznego. Wykazano, że system IRIS charakteryzuje się wysoką czułością, precyzją i powtarzalnością dla różnych oddziaływań biomolekularnych [1-3]. Do zalet należą możliwości obrazowania multipleksowego, pomiary w czasie rzeczywistym i końcowe, a także inne cechy wysokoprzepustowe, takie jak zmniejszone zużycie odczynników i skrócenie czasu trwania analizy. Ponadto platforma IRIS jest prosta w obsłudze, wymaga niedrogiego sprzętu i wykorzystuje komponenty do analiz w fazie stałej na bazie krzemu, co czyni ją kompatybilną z wieloma współczesnymi podejściami w zakresie chemii powierzchni.
W niniejszym materiale przedstawiamy zastosowanie systemu IRIS, od przygotowania macierzy sond, przez inkubację i pomiar wiązania celu, aż po analizę wyników w formacie punktu końcowego. Systemem modelowym będzie wychwytywanie przeciwciał docelowych specyficznych dla ludzkiej albuminy surowiczej (HSA) na podłożach z naniesioną HSA.
Protokół
1. Przygotowanie podłoża
- Pokryj warstwowe podłoża krzemowe-SiO2 samoprzysiadającym kopolimerem (DMA-NAS-MAPS):
- Synteza kopolimeru, jego struktura chemiczna oraz proces powlekania zostały opisane w publikacji: G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, L.E. Depero. Characterization of A Polymeric Adsorbed Coating for DNA Microarray Glass Slides. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-58.
- W skrócie: przygotuj roztwór polimeru, dodając 10 mg polimeru do 5 mL wody dejonizowanej (DI), a następnie dodaj 5 mL 40% nasyconego roztworu siarczanu amonu ((NH4)2SO4), aby uzyskać końcowe stężenie 0,92 M.
- Zanurz chipy w roztworze na 30 min na wstrząsarce, a następnie dokładnie wypłucz wodą DI. Wysusz dokładnie gazem Argon/N2.
- Wypalaj chipy w temperaturze 80 °C przez 15 min.
- Przechowuj podłoża/chipy pokryte polimerem w suchym środowisku (desykator próżniowy) do 3 miesięcy do momentu przeprowadzenia procedury nanoszenia sond.
2. Przygotowanie macierzy sond: przeciwciała, antygeny, ss/dsDNA, RNA itp.
- Rozcieńczyć sondy do odpowiedniego stężenia w wybranym buforze. Ten etap może się znacznie różnić, ale w typowym eksperymencie wykorzystuje się antygen lub IgG o stężeniu 0.5 mg/mL (zakres 0.1 -1 mg/mL) w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) o pH≈7.4.
- Przenieść roztwory do płytki 96- lub 384-dołkowej (lub standardowej płytki źródłowej dla używanego urządzenia do nanoszenia próbek)
- Skonfigurować parametry nanoszenia dla pożądanej macierzy: ustalić odpowiednie parametry nanoszenia dla stosowanej powierzchni i roztworów (czas kontaktu, prędkości zbliżania itp.). Określić liczbę powtórzeń każdego warunku w obrębie siatki, układ siatki, liczbę powtórzonych siatek oraz pożądane miejsce nanoszenia na chipie. Umieścić podłoża i płytkę źródłową w odpowiednich miejscach, sprawdzić gotowość butelek z odpadami i odczynnikami, a następnie rozpocząć proces drukowania.
- Po zakończeniu nanoszenia umieścić podłoża w środowisku o wysokiej wilgotności na noc (4-18 godzin), aby umożliwić zajście procesom immobilizacji i dezaktywacji.
- Przepłukać podłoża: umieścić je w następujących roztworach po trzy minuty podczas trzech oddzielnych przemyć: PBS z 0.1% Tween (PBST), PBS, a na koniec w wodzie dejonizowanej (DI). W zależności od rodzaju eksperymentu (metoda mokra vs sucha), dokładnie wysuszyć chip gazem argonowym i rozpocząć inkubację lub umieścić chip w komorze przepływowej i złożyć układ.
- Zdezaktywować pozostałe grupy NHS na powierzchni kopolimeru, zanurzając chipy w 50 mM roztworze etanolaminy z pH dostosowanym do 7.4 przez 30 minut na wytrząsarce. Można również zastosować związek zawierający aminę pierwszorzędową, taki jak hydroksamina lub Tris, pod warunkiem, że przygotowany roztwór jest bezpieczny w kontakcie z białkami. Dokładnie wypłukać roztwór dezaktywujący, używając PBS, a następnie wody DI.
- Krok opcjonalny (w zależności od zastosowanej chemii powierzchni): Zablokować powierzchnię za pomocą roztworu BSA, kazeiny lub rehydratowanej mleka przez 30 minut. W przypadku obecnie stosowanej przez nas polimerowej chemii powierzchni nie wykonujemy tego kroku, ponieważ szkielet polimerowy zapobiega niespecyficznemu wiązaniu białek.
3. Procedura pozyskiwania danych i inkubacji: format końcowy (endpoint)
- Przygotuj roztwór badanego celu w odpowiednim buforze. W tym przypadku będzie to roztwór odpowiedniego stężenia Anti-BSA w PBS (np. przygotuj 1-10 mL roztworu Anti-BSA o stężeniu 10 ng/mL w PBS). Należy również przygotować równą ilość buforu (bez celu) do inkubacji kontroli negatywnej.
- Wykonaj skan lustra krzemowego w celu normalizacji wszystkich danych zbieranych w dalszej części procesu.
- Przed etapem inkubacji przeskanuj przygotowaną macierz sond za pomocą systemu IRIS, aby określić początkową wysokość optyczną (masę) w każdym punkcie. Pozwoli to na właściwą analizę zmian masy na powierzchni, tzn. poziomu wiązania, po inkubacji. Na tym etapie zostaną dostosowane parametry dla aktualnego eksperymentu, takie jak czas ekspozycji, pole widzenia, precyzyjne ogniskowanie itp.
- Zanurz chip(y) w przygotowanym roztworze na 1 godzinę na wytrząsarce. Czas inkubacji może znacznie różnić się w zależności od stopnia wytrząsania, stężenia wykrywanego celu, charakterystyki transportu w komorze przepływowej (jeśli stosowany jest tryb detekcji w czasie rzeczywistym), powinowactwa pary cel-sonda itp.
- Po inkubacji powtórz procedurę płukania opisaną w kroku 2.5)
- Przeskanuj tę samą macierz sond za pomocą systemu IRIS i uzyskaj obrazy po inkubacji w celu porównania z obrazami przed inkubacją.
- W razie potrzeby powtórz ten proces dla kolejnych etapów inkubacji, na przykład w formacie testu kanapkowego (sandwich assay), w którym stosowane jest przeciwciało wtórne.
4. Analiza danych
- Dopasuj zebrane obrazy dla każdego skanu IRIS (sekwencji obrazów intensywności), korzystając z opracowanego w laboratorium oprogramowania, aby uzyskać obraz macierzy sond zawierający informacje o grubości optycznej. Szybką analizę jakościową wiązania można przeprowadzić poprzez odjęcie (zarejestrowanych) obrazów po i przed inkubacją. Wiązanie objawi się jako zmiana intensywności w miejscach, w których zaobserwowano zmiany masy. W analizie ilościowej wyznacz gęstość masy każdego punktu w porównaniu z tłem, uśredniając informacje o grubości optycznej dla każdego piksela w obrębie punktu oraz w pierścieniu wokół punktu, a następnie dokonując bezpośredniego porównania tych dwóch obszarów.
5. Reprezentatywne wyniki:
Rysunek 1 przedstawia przykładowy schemat warstwowej podłoża Si-SiO2 IRIS z naniesionym reprezentatywnym macierzysem przeciwciał. Każdy zestaw przeciwciał jest naniesiony w powtórzeniach, wykazując swoistość względem innego epitopu skierowanego przeciwko różnym białkom. Jako przykładowe cele przedstawiono dwa różne całe wirusy oraz białko wirusowe. Przeciwciała kontrolne ujemne zależą od analizy i mogą być nieswoiste i/lub swoiste względem wirusa.
Rycina 2 przedstawia wiązanie przeciwciał specyficznych dla ludzkiej albuminy surowiczej (HSA) z macierzą naniesionych punktów HSA oraz IgG królika (kontrola). Jak widać, po dopasowaniu i wyznaczeniu grubości optycznej dla obrazów przed i po inkubacji, można utworzyć obraz różnicowy dla macierzy wiązań, aby jakościowo ocenić stopień wiązania. Analiza ilościowa wykazuje, że przy stężeniu inkubacyjnym anty-HSA wynoszącym 50 ng/mL, średnia zmiana wysokości optycznej wyniosła odpowiednio 2,05 nm dla punktów HSA oraz 0,13 nm dla punktów IgG królika.
Rysunek 3 przedstawia pomiar IRIS zależności wiązania białka Fur od stężenia białka i długości oligomeru dsDNA. Górny wykres pokazuje pomiary bezwzględnej wysokości optycznej dla początkowych wysokości unieruchomionych sond oligomerowych oraz wiązania białka Fur po inkubacji. Zwiększenie stężeń Fur (50, 10, 20 nM) doprowadziło do zwiększonego wiązania z sondami DNA. Długość oligomerów również wpływa na wiązanie Fur, przy czym dłuższe sekwencje skutkują większym wiązaniem. Słupki błędów reprezentują tutaj jedno odchylenie standardowe od średniej. Dolny wykres przedstawia obliczone wiązanie dimerów białka Fur na jedną nić dsDNA. Wiązanie dimerów znacznie wzrosło przy stężeniu białka Fur wynoszącym 20 nM, co sugeruje wysoki poziom wiązania niespecyficznego.
Rysunek 1. Schemat przykładowej macierzy sond zazwyczaj stosowanej w badaniu do jednoczesnej detekcji specyficznych wirusów i komponentów wirusowych przy użyciu systemu IRIS.
Rysunek 2. Obraz różnicowy po inkubacji dla wiązania przeciwciał specyficznych dla ludzkiej albuminy surowiczej (HSA) do naniesionych kroplami HSA, pobrany za pomocą tego systemu bezetykietowego w stężeniu 50 ng/mL. Gęstość masy biomateriału dla każdej kropki jest wyznaczana poprzez uśrednienie informacji o grubości optycznej w obrębie kropki, a następnie porównanie tej wartości ze średnią z pierścienia wokół kropki reprezentującego tło.
Rycina 3. Wykres danych wiązania białka Fur z naniesionymi dwuniciowymi oligomerami o znanej sekwencji konsensus w zależności od długości oligomeru, położenia sekwencji konsensus w obrębie oligomeru oraz stężenia białka Fur. Informacje o bezwzględnej ilości białka Fur związanego z każdą naniesioną sekwencją (góra) mogą posłużyć do oszacowania liczby dimerów Fur związanych z każdym typem oligomeru (dół).
Dyskusja
Platforma IRIS to prosty i szybki system służący do gromadzenia wysokoprzepływowych danych o wiązaniu w formacie mikromacierzy. Poprzez kowalencyjne unieruchomienie różnych funkcjonalnych sond białkowych lub DNA na powierzchni, możliwe jest wychwytywanie docelowych antygenów/biomarkerów itp. z roztworu, podobnie jak w testach immunoologicznych. Pomiar tych oddziaływań w różnych warunkach sond w formacie punktu końcowego lub w czasie rzeczywistym za pomocą systemu IRIS pozwala na gromadzenie wysoce czułych i ilościowych informacji dla każdego oddziaływania. Reprezentatywny eksperyment opisany w niniejszym materiale jest jedynie przykładem rodzajów oddziaływań, które można badać za pomocą tej techniki. Wcześniej wykazano możliwość wykrywania czynników transkrypcyjnych, antygenów wirusowych oraz całych wirusów, co stanowi jedynie kilka przykładów analiz, które system IRIS może z łatwością przeprowadzić.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować firmie Zoiray Technologies Inc., współsponsorowi i partnerowi w komercjalizacji, za udzielone wsparcie.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wafle krzemowe z 500 nm termicznie wyhodowanego dwutlenku krzemu | Silicon Valley Microelectronics | ||
| Siarczan amonu w proszku | Sigma-Aldrich | A5132 | |
| Gotowy koncentrat 10X roztworu soli fosforanowo-buforowanej (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Przeciwciało przeciwko ludzkiej albuminie surowiczej (Anti-HSA) | Sigma-Aldrich | A0433 | |
| Ludzka albumina surowicza (HSA) | Sigma-Aldrich | A9511 | |
| Argon lub azot (ultra-wysokiej czystości) | Airgas | AR UHP300 or NI UHP300 | |
| Szalki Petriego, 60 mm x 15 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Desykator próżniowy Scienceware® | Sigma-Aldrich | Z119016 | |
| Probówki do mikrocentryfugi | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Płytki 96-dołkowe, o niskim wiązaniu komórek | Nalge Nunc international | 145399 | |
| BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer | Bio-Rad | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Etanoloamina | Sigma-Aldrich | 398136 | |
| Wodorotlenek amonu | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 26103 | |
| Rotator wielozadaniowy, model # 2314 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2314Q | |
| Kamera Retiga 2000R | QImaging | 01-RET-2000R-F-M-12 | |
| Źródło oświetlenia AcuLED | PerkinElmer, Inc. | ||
| Komponenty optyczne (soczewki, obiektywy, przysłony, szyny, wsporniki itp.) | Thorlabs Inc. |
Bibliografia
- Özkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., Ünlö, M. S. Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).
- Özkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., Ünlö, M. S. Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches. Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).
- Özkumur, E., Lopez, C. A., Yalcin, A., Bergstein, D. A., Connor, J. H., Chiari, M., Ünlö, M. S. Spectral reflectance imaging for a multiplexed, high-throughput, label-free, and dynamic biosensing platform. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16, 635-646 (2010).
- Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., Özkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., Ünlö, M. S. Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging. Biosensors and Bioelectronics. , (2011).
Przedruki i uprawnienia
