Oznaczanie struktur molekularnych glikoprotein otoczki HIV za pomocą tomografii krioelektronowej i automatycznego uśredniania subtomogramu

Podsumowanie

Protokół opisuje wysokoprzepustowe podejście do określania struktur białek błonowych za pomocą krio-elektronowej tomografii i przetwarzania obrazów 3D. Obejmuje on szczegóły przygotowania próbek, gromadzenia danych, przetwarzania i interpretacji danych, a kończy się opracowaniem reprezentatywnego celu dla podejścia, glikoproteiny otoczki HIV-1. Te procedury obliczeniowe zostały zaprojektowane w sposób, który umożliwia naukowcom i studentom pracę zdalną i przyczynianie się do przetwarzania danych i analizy strukturalnej.

Streszczenie

Od czasu jego odkrycia prawie 30 lat temu, ponad 60 milionów ludzi zostało zarażonych ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV) (www.usaid.gov). Wirus infekuje i niszczy limfocyty T CD4+, paraliżując w ten sposób układ odpornościowy i powodując zespół nabytego niedoboru odporności (AIDS) ². Zakażenie rozpoczyna się, gdy "kolec" glikoproteiny otoczki HIV wchodzi w kontakt z receptorem CD4 na powierzchni limfocytu T CD4 +. Ta interakcja indukuje zmianę konformacyjną w kolcu, która sprzyja interakcji z koreceptorem ^5,9 na powierzchni drugiej komórki. Znaczenie tych interakcji białkowych w szlaku zakażenia wirusem HIV sprawia, że mają one ogromne znaczenie w podstawowych badaniach nad wirusem HIV oraz w dążeniu do opracowania szczepionki przeciwko HIV.

Potrzeba lepszego zrozumienia interakcji w skali molekularnej kontaktu z komórkami HIV i neutralizacji zmotywowała do opracowania techniki określania struktur kolca HIV oddziałującego z białkami receptorowymi na powierzchni komórki i cząsteczkami, które blokują infekcję. Korzystając z kriotomografii elektronowej i przetwarzania obrazu 3D, wykazaliśmy niedawno zdolność do określania takich struktur na powierzchni rodzimego wirusa, w rozdzielczości ^{̃20 A 9,14}. Podejście to nie ogranicza się do rozwiązywania struktur otoczki HIV i może być rozszerzone na inne białka błony błonowej wirusa i białka odtworzone na liposomie. W tym protokole opisujemy, jak uzyskać struktury glikoprotein otoczki HIV, zaczynając od oczyszczonych wirionów HIV i przechodząc krok po kroku przez przygotowanie zeszklonych próbek, zbieranie, dane z mikroskopii krioelektronowej, odtwarzanie i przetwarzanie objętości danych 3D, uśrednianie i klasyfikowanie podobjętości białek 3D oraz interpretację wyników w celu wytworzenia modelu białka. Obliczeniowe aspekty naszego podejścia zostały zaadaptowane do modułów, do których można uzyskać dostęp i które można wykonywać zdalnie za pomocą klastra przetwarzania równoległego Biowulf GNU/Linux w NIH (http://biowulf.nih.gov). Ten zdalny dostęp, w połączeniu z tanim sprzętem komputerowym i szybkim dostępem do sieci, umożliwił zaangażowanie naukowców i uczniów pracujących w szkole lub w domu.

Protokół

Opisane tutaj podejście zostało opracowane przy użyciu określonego zestawu instrumentów, narzędzi i oprogramowania. Ponieważ nie wszystkie laboratoria będą korzystać z tej samej konfiguracji eksperymentalnej, starano się uogólnić podejście tam, gdzie to możliwe, i zapewnić alternatywy tam, gdzie nie było to możliwe.

1. Przygotowanie próbek wirusa zeszklonego

W poniższej sekcji kratki zeszklone są przygotowywane za pomocą FEI Vitrobot Mark III, robota do blottingu i zamrażania wgłębnego. Zobacz Iancu, et al., aby uzyskać szczegółowy protokół korzystania z tego systemu ⁷. Jako alternatywa dla tłoka automatycznego, w zupełności wystarczy tłok gilotynowy lub grawitacyjny ⁶.

W sekcjach 1.2. i 1.3. do czyszczenia siatek próbek i zwiększania ich hydrofilowości używana jest jednostka wyładowcza Gatan Solarus 950, chociaż można zastąpić dowolne urządzenie do wyładowań jarzeniowych przeznaczone do użytku z siatkami do mikroskopii elektronowej.

Chociaż objętość próbki nałożonej na siatkę przed blottingiem i głębokim zamrożeniem powinna mieścić się w zakresie 2 μL, objętość koloidu złota wirusa i białka-A w mieszaninie próbek będzie się różnić w zależności od źródła. W związku z tym prawdopodobne jest, że zakres rozcieńczeń lub proporcji wirusa i złota będzie musiał zostać przetestowany i zobrazowany pod mikroskopem, a idealna mieszanina zostanie określona empirycznie. Należy pamiętać, że gdy dane obrazu są pozyskiwane w sekcji 3, powinno być obecnych od 10 do 20 złotych znaczników odniesienia w celu prawidłowego wyrównania serii nachylenia.

Uwaga: Ta sekcja opisuje użycie gazowego etanu, wodoru i tlenu, które są wysoce łatwopalne. Należy zachować odpowiednią ostrożność podczas stosowania tych gazów. Ponadto należy zachować ostrożność, aby obchodzić się z próbkami wirusa zgodnie z zaleceniami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego. Wreszcie, zawsze noś okulary i odzież ochronną podczas pracy z ciekłym azotem (_N2) i etanem.

1. Przygotuj FEI Vitrobot Mark III, włączając dopływ gazu N₂, instalując wkład nawilżacza, a następnie napełniając wkład przefiltrowaną wodą dejonizowaną. Włącz Vitrobota i ustaw temperaturę w komorze klimatycznej na 22 °C, wilgotność docelową na 100%, czas osuszania na 6 sekund i przesunięcie blot na -2 mm.
2. Włącz jednostkę wyładowczą jarzeniową Gatan Solarus 950 i otwórz kanistry_H2 i_O2, które zasilają jednostkę. Wstępnie wyczyść komorę próbki, uruchamiając wyładowanie jarzeniowe przez 1 minutę przy mocy 50 watów.
3. Ułóż żądaną liczbę dziurawych siatek węglowych na szklanym szkiełku nakrywkowym, stroną węglową do góry i umieść w komorze na próbki jarzeniowe przez górne drzwiczki załadowcze. Wyczyść siatki, uruchamiając wyładowanie żarowe przez 6-10 sekund przy 25 watach. (Należy pamiętać, że strona węglowa siatek marki Quantifoil użytych w tym protokole ma matowy wygląd. Nie będzie to prawdą w przypadku wszystkich sieci komercyjnych, dlatego najlepiej jest uzyskać te informacje od producenta.)
4. Umieść skrzynkę (skrzynki) kratową w misce pojemnika na płyn chłodzący i trzpień dyfuzora termicznego na centralnym miseczce, która znajduje się w misce płynu chłodzącego. Powoli wlewaj płyn N₂ do miski, aż ustąpi energiczne bulgotanie, wskazując równowagę między miską a płynem. Utrzymuj poziom płynu_N2 przez pozostałą część zabiegu, uważając, aby nie dostał się on do centralnego kubka.
5. Podłącz jeden koniec plastikowego węża do kanistra z gazem etanowym, a drugi koniec do szklanej pipety. Przyłóż szklaną końcówkę pipety do dna środkowego kubka, ustal powolny, stały przepływ etanu, a etan zacznie się skraplać. Kontynuuj napełnianie, aż środkowa filiżanka będzie pełna. Wyjmij wrzeciono z centralnej miseczki.
6. Przygotować mieszaninę próbek, dodając 2 μl złotego koloidu białko-A do 10 μl inaktywowanej zawiesiny wirusa HIV-1 AT-2. Delikatnie odpipetować mieszaninę, aby wprowadzić powierników do roztworu. Trzymaj na lodzie.
7. Chwyć zewnętrzną krawędź siatki za pomocą specjalistycznej pęsety Vitrobot. Nanieść 2 μl mieszaniny próbek na węglową stronę siatki. Natychmiast poinstruuj robota, aby załadował próbkę do wilgotnej komory klimatycznej, osuszył i zanurzył zamrażanie w ciekłym etanie.
8. Przenieś zeszkloną siatkę do skrzynki kratowej. Powtórz krok 1.7. , aby wyprodukować żądaną liczbę siatek. Po zakończeniu dokręć na pokrywie (pokrywach) skrzynki siatkowej, a następnie szybko przenieś skrzynkę (skrzynki) do małego dewara transportu ciekłego azotu.

2. Ładowanie próbek do transmisyjnego mikroskopu elektronowego

W tej sekcji poziom cieczy N₂ w komorze załadunkowej powinien być czujnie monitorowany i uzupełniany w razie potrzeby, aby upewnić się, że skrzynki kratowe pozostają zanurzone. Przed zetknięciem się narzędzia z siatką należy je schłodzić, zanurzając je w cieczy_N2, aż zrównoważy się z cieczą. Po każdym użyciu narzędzia należy rozmrozić za pomocą pistoletu na gorące powietrze.

W całej tej sekcji transmisyjny mikroskop elektronowy FEI Tecnai G2 Polara (TEM) jest używany w połączeniu ze stacją roboczą Gatan Cryo. Chociaż zasada ładowania próbek w warunkach ciekłego N₂ ma zastosowanie do wszystkich prac związanych z mikroskopią krioelektronową, etapy tej sekcji są specyficzne dla sprzętu użytego w eksperymencie. Kroki stosowane dla różnych urządzeń będą się różnić w zależności od producenta.

UWAGA: W tej sekcji zawsze noś okulary ochronne i odzież podczas pracy z płynem N₂.

1. Upewnij się, że TEM Compustage nie zawiera kasety z próbką oraz że pręt selekcyjny próbki i pręt wprowadzający mają temperaturę poniżej 110 K.
2. Ostudzić i przygotować stację roboczą Cryo do załadunku siatek do bloku do przechowywania próbek, który jest częścią pręta selekcyjnego próbki.
3. Przenieś schłodzony (< 110 K) pręt selekcyjny z mikroskopu do stacji roboczej Cryo.
4. Przesuń pręt selekcyjny do przodu, aby włożyć blok selekcyjny do kąpieli azotowej na stacji roboczej Cryo. Wyjmij wszystkie wkłady z próbkami z bloku do przechowywania za pomocą specjalistycznych kleszczy do obsługi wkładów. Umieść skrzynkę (skrzynki) kratową w stacji załadowczej i poluzuj pokrywę (pokrywy) śrubokrętem.
5. Użyj pęsety, aby usunąć siatkę z pudełka z siatką i umieścić w kartridżu. Użyj specjalistycznego narzędzia do umieszczania zacisków C, aby umieścić zacisk C na górze siatki, zabezpieczając siatkę we wkładzie .
6. Powtarzaj krok 2.5., aż żądana liczba siatek znajdzie się we wkładach. Przenieś wkłady do bloku wyboru próbki.
7. Przygotuj stację roboczą Cryo do usunięcia pręta do pobierania próbek. Przesuń pręt selekcyjny do tyłu, aby usunąć blok selekcyjny z kąpieli azotowej. Wyjmij pręt selekcyjny ze stacji roboczej Cryo i przymocuj do TEM.

3. Pozyskiwanie danych z mikroskopii krioelektronowej

Podczas tej sekcji, interfejs oprogramowania tomografii wsadowej FEI jest używany do konfiguracji pliku wsadowego, który przechowuje współrzędne wszystkich interesujących pozycji siatki. Na polecenie użytkownika oprogramowanie do tomografii wsadowej ponownie przyjrzy się każdej z pozycji i skoordynuje rejestrację serii przechyłu za pomocą mikrografu cyfrowego. Jeśli to oprogramowanie nie jest dostępne, pakiet oprogramowania Leginon jest opłacalną darmową alternatywą open source ¹³. Obrazowanie wykonano przy 200 keV, przy użyciu filtra obrazowania Gatan (GIF) z kamerą CCD 2K x 2K post-GIF (Gatan).

1. Ustaw Compustage tak, aby wiązka elektronów przechodziła przez próżnię. Przełącz się na tryb ekspozycji z dużym powiększeniem (34 kX) i wykonaj bezpośrednie wyrównanie.
2. Dopasuj szczyt zerowej straty na filtrze energii. (Zapewnia to filtrowi energii odniesienie dla elektronów o zerowej stracie energii).
3. Przenieś narzędzie Compustage do obszaru siatki z węglem. W trybie wyszukiwania o małym powiększeniu (4.5 kX) użyj funkcji Wobler, aby przechylić stolik do przodu iz powrotem w zakresie +/-15°. W międzyczasie dostosuj położenie stage osi Z, aż zaobserwuje się minimalne przesunięcie stage. (Spowoduje to ustawienie stolika w przybliżeniu na wysokości eucentrycznej). Wyłącz Wobbler, gdy nie obserwuje się zmiany stopnia.
4. Użyj automatycznej funkcji wysokości eucentrycznej, aby doprecyzować wysokość eucentryczną. (Ta procedura wykorzystuje korelację krzyżową w celu uzyskania dokładniejszej wysokości eucentrycznej niż w kroku 3.3). Wysokość eucentryczna jest automatycznie zapisywana do późniejszego wykorzystania przez oprogramowanie do tomografii wsadowej.
5. Znajdź obszar zainteresowania zawierający około trzech do sześciu wirionów i nie mniej niż dziesięć znaczników odniesienia. Dodaj tę pozycję siatki do pliku tomografii wsadowej.
6. Powtarzaj kroki 3.4. i 3.5., aż zostanie wyznaczona żądana liczba pozycji. Zdefiniuj parametry wsadu (±60° z przyrostem pochylenia 2°, widok 1-2 e-/^{Å 2}/tilt) i uruchom partię.

4. Rekonstrukcja tomogramów krioelektronowych

1. Wyrównaj serię pochylenia za pomocą automatycznego wyrównania opartego na zaufaniu w RAPTOR ¹.
2. Zrekonstruuj tomogramy za pomocą projekcji wstecznej z korekcją R w IMOD ⁸. Standardowym formatem pliku dla wynikowych woluminów danych jest plik MRC z rozszerzeniem .mrc.

5. Segmentacja podobjętości wirionu i identyfikacja skoków

Ta sekcja korzysta z niestandardowego rozszerzenia IMOD, które pozwala użytkownikowi na oznaczanie podobjętości wirionu w tomogramie. W sekcji 6 zdefiniowane przez użytkownika granice wirionu są używane jako powierzchnia, wzdłuż której automatycznie wybierane są kolce.

1. Otwórz IMOD i załaduj tomogram wypełniony wirionami.
2. Poruszaj się wzdłuż osi Z tomogramu, aż znajdzie się centralny przekrój przez jeden z wirionów. Sprawdzić, czy środek ciężkości wirionu został zidentyfikowany. Po wykonaniu tej czynności zdeponuj marker wirionowy. Ten marker będzie używany przez narzędzie do automatycznej segmentacji wirionów w sekcji 6.
3. Kontynuuj oznaczanie środka ciężkości, aż wszystkie objętości wirionu zostaną zidentyfikowane.
4. Zamknij tomogram i zapisz zestaw znaczników definiujący centroidy wirionu. Powtarzać tę czynność, aż wiriony zostaną oznaczone we wszystkich tomogramach.
5. Korzystając z IMOD, zmniejsz próbkę subtomogramów wirionu czterokrotnie.
6. Odszumianie wirionów za pomocą dyfuzji anizotropowej zwiększającej krawędzie, zaimplementowanej w IMOD.
7. Poddaj wiriony nienadzorowanej segmentacji błony przy użyciu trójwymiarowego podejścia opartego na energii (szczegółowo opisanego w Bartesaghi i in. 2005) ³.
8. Kolce są identyfikowane w miejscach na segmentowanych powierzchniach wirionów odpowiadających lokalnym maksimom korelacji krzyżowej między daną lokalizacją a syntetyczną symetryczną objętością przypominającą kolce. Lokalizacje powyżej określonego progu są dodawane do listy współrzędnych dla przypuszczalnych podwoluminów spajków.

6. Klasyfikacja i uśrednianie cząstek

1. Wyodrębnij obliczeniowo podwoluminy tomogramu (100 x 100 x 100 wokseli) w każdym miejscu, które zostało zidentyfikowane w kroku 5.8. (Odbywa się to bez odszumiania i binningu). Wynikowy zbiór podobjętości zawiera białka kolców, które zostaną sklasyfikowane i uśrednione w kolejnych krokach.
2. Określ orientację długiej osi kolca, używając normalnej do automatycznie segmentowanej membrany w miejscu każdego kolca. Podejście to zapewnia wstępne oszacowania dla dwóch z trzech kątów Eulera.
3. Losowo należy wylosować pozostały obrót w miejscu, aby zapobiec ewentualnym odchyleniom w kolejnych wyrównaniach.
4. Zastosuj kąty Eulera do podobjętości, a następnie translacyjnie wyrównaj podobjętości do ich cylindrycznie uśrednionej średniej globalnej, aby upewnić się, że wszystkie mają ten sam środek masy.
5. Usuń 10% podwoluminów, które są najsłabiej skorelowane ze zaktualizowaną średnią globalną. Ma to na celu usunięcie zagęszczeń, w przypadku których istnieje największe ryzyko błędnej identyfikacji skoków.
6. Dopasuj i sklasyfikuj objętości spajków bez korzystania z odniesień zewnętrznych i z prawidłowym uwzględnieniem brakującego klina (szczegółowo w Bartesaghi i in. 2008) ⁴. Stopniowo uściślaj wyrównania podobjętości i klasyfikuj objętości spajków w każdej iteracji.
7. Symetria trójdzielna powinna być wyraźnie zaobserwowana we wczesnych etapach klasyfikacji, a w czwartej iteracji narzucona jest symetria 3-krotna. W każdej rundzie najlepiej zdefiniowane klasy są uśredniane i wykorzystywane jako odniesienie w następnej rundzie.
8. Zazwyczaj dla każdego zestawu danych należy wybrać ̃4000 spajków. Ostateczne mapy zagęszczenia są uzyskiwane po ��5–12 rundach uściślania i będą zawierać wkłady ̃50% podtomów w każdym zbiorze danych.

7. Dopasowanie współrzędnych

1. Mapy gęstości wynikające z kroku 6.8 są otwierane w UCSF Chimera ¹².
2. Stwórz symulowaną mapę 20 A współrzędnych rentgenowskich za pomocą Chimera lub EMAN ¹⁰.
3. Dokuj współrzędne w losowych orientacjach. Korzystając z wbudowanej lokalnej optymalizacji Chimery dla najbardziej stromych podjazdów, dopasuj współrzędne, wykonując wielokrotność 100 najbardziej stromych kroków wzniesienia, aż do uzyskania zbieżności.

8. Reprezentatywne wyniki

Korzystając z uśredniania 3D i dopasowywania współrzędnych, rozwiązano problem różnych struktur kolców HIV i SIV Env. Na rycinie 3A przedstawiono strukturę kolca otoczki szczepu HIV-1, BaL (fioletowy). Kolec ma trzykrotną symetrię o wymiarach ̃ 120 A mierzonych od błony do wierzchołka kolca i maksymalnej szerokości ̃ 150 A, która zwęża się do ̃ 35 A u podstawy kolca. Jak widać na rysunku 3B, łącząc mapę gęstości dla trimerycznego Env oznaczonego za pomocą tomografii krioelektronowej z krystalograficznie wyznaczoną strukturą dla monomerycznego gp120 (czerwony, pochodzący z PDB ID, 2NY7), byliśmy w stanie uzyskać działający model molekularny dla trimerycznego kompleksu glikoproteinowego otoczki (PDB ID, 3DNN) ⁹.

Nasze podejście pozwala również na analizę strukturalną kompleksów utworzonych między trimerycznym Env a różnymi fragmentami białek i przeciwciałami specyficznymi dla gp120. Przykład tego, w którym Env jest skompleksowany z szeroko neutralizującym b12 Fab pokazano na rysunku 4A (cały kompleks jest pokazany na fioletowo). Na tym rysunku widać dodatkową gęstość odpowiadającą b12 wystającą na zewnątrz z kolca i równoległą do membrany. Strukturalne interpretacje takich kompleksów można rozszerzyć na poziom molekularny poprzez dopasowanie map gęstości do współrzędnych atomowych dla części kolca, związanych z odpowiednim ligandem. Jak widać na rysunku 4B, gdy ta mapa gęstości jest wyposażona we współrzędne białka kolca gp120 (czerwone, pochodzące od PDB ID, 2NY7) związane przez b12 Fab (biały), można dostrzec względne orientacje trzech rdzeni gp120 (PDB ID, 3DNL). Te konformacyjne relacje są pouczające dla zrozumienia, w jaki sposób takie ligandy oddziałują ze szpikulcem i zakłócają aktywność wirusa. Niektóre inne struktury nieligandowego i zligandowanego Env, które zostały rozwiązane za pomocą przedstawionej tutaj metody, obejmują HIV-1 R3A, SIV CP-MAC, SIVmneE11S i SIVmac239, trójskładnikowy kompleks między HIV-1 Bal Env, sCD4 i 17b Fab oraz SIV CP-Mac Env skompleksowany do przeciwciała 7D3 ^9,14.

Rysunek 1. Od zawiesiny wirusa do struktury 3D: koncepcyjne kroki w mikroskopii krioelektronowej i rekonstrukcji 3D.

Rysunek 2. (A) Reprezentatywny wycinek z tomogramu wirionów HIV-1. (B) Pojedynczy wirion HIV-1, z rdzeniem i powierzchniowymi kolcami pokazanymi schematycznie.

Rysunek 3. (A) Trójwymiarowa struktura glikoproteiny HIV-1 BaL Envelope (kolce powierzchniowe) wyświetlana na powierzchni błony wirusowej. (B) Model molekularny dla kolców trimerycznych wyznaczony przez umieszczenie trzech kopii struktur dla monomerycznego gp120 (czerwonego) uzyskanego za pomocą krystalografii rentgenowskiej na mapie gęstości ⁹.

Rysunek 4. (A) Trójwymiarowa struktura glikoproteiny HIV-1 BaL Envelope w kompleksie z fragmentem Fab szeroko neutralizującego przeciwciała b12. (B) Model molekularny kompleksu wyznaczony przez umieszczenie trzech kopii struktur monomerycznego kompleksu gp120-B12 Fab otrzymanego za pomocą krystalografii rentgenowskiej ^na mapie gęstości 9.

Dyskusja

Przedstawiona tu mikroskopia krioelektronowa oraz trójwymiarowe metody klasyfikacji i uśredniania pozwalają na wyznaczenie trójwymiarowych struktur kompleksów glikoproteinowych otoczki z rozdzielczością do ̃ 20 A. Dopasowanie współrzędnych rentgenowskich składników monomerycznych do map gęstości pozwala na interpretację strukturalną na poziomie molekularnym. Ciągłe ulepszenia w zakresie taniego sprzętu komputerowego w połączeniu z rozwojem narzędzi naukowych typu open source i rozprzestrzenianiem się infrastruktury sieciowej umożliwiają niewyobrażalne wcześniej wysiłki w zakresie współpracy naukowej. Wykorzystujemy te osiągnięcia i pokazujemy, że zaawansowane techniki naukowe mogą być dostępne dla uczniów w różnym wieku.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Multi-A Holey Carbon Grids	Quantifoil Micro		Tools-200 mesh
Białko Koloid złota	Uniwersytet w Utrech -		Holandia-10 średnica nm
HIV-1 BaL	National Institutes of Health	-	~ 1011 wiriony/mL
Pudełko do przechowywania Cryo-EM	Pacific Grid Tech	GB-4R	4-otworowy, okrągły
Vitrobot Mark III	FEI-6		sekundowy czas blot, przesunięcie -2 mm, 100% wilgotności
Tecnai G2 Transmisyjny mikroskop elektronowy Polara		FEI200 keV
Gatan Filtr obrazowania	Gatan	-	-
Gatan Post-GIF CCD	Gatan	-	-2K x 2K pikseli
Gatan Cryo Workstation Gatan		-
System czyszczenia plazmowego Gatan Solarus 950		Gatan-Plazma	tlenowa i wodorowa
C - klipy	FEI	ZIT0634-Klaster
obliczeniowy Biowulf	National Institutes of Health	-	http://biowulf.nih.gov/
UCSF Chimera	Uniwersytet Kalifornijski - San Francisco	-	http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
IMOD	University of Colorado - Boulder	-	http://bio3d.colorado.edu/imod/
EMAN	Baylor College of Medicine	-	http://blake.bcm.tmc.edu/eman/
RAPTOR	Uniwersytet Stanforda	-	http://www-vlsi.stanford.edu/TEM/index.htm