Wyznaczanie struktur molekularnych glikoprotein otoczki HIV z wykorzystaniem krioelektronowej tomografii i zautomatyzowanego uśredniania subtomogramów

Podsumowanie

Protokół opisuje wysokoprzepustowe podejście do wyznaczania struktur białek błonowych z wykorzystaniem krio-tomografii elektronowej oraz trójwymiarowego przetwarzania obrazów. Obejmuje on szczegóły przygotowania preparatów, gromadzenia danych, ich przetwarzania i interpretacji, a kończy się opracowaniem reprezentatywnego celu dla tej metody, jakim jest glikoproteina otoczki HIV-1. Procedury obliczeniowe zostały zaprojektowane w sposób umożliwiający badaczom i studentom pracę zdalną oraz wkład w przetwarzanie danych i analizę strukturalną.

Streszczenie

Od czasu jego odkrycia prawie 30 lat temu, ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) zainfekował ponad 60 milionów ludzi (www.usaid.gov). Wirus infekuje i niszczy limfocyty T CD4+, osłabiając w ten sposób układ odpornościowy i powodując zespół nabytego niedoboru odporności (AIDS) ². Infekcja rozpoczyna się, gdy glikoproteina „kolca” otoczki HIV styka się z receptorem CD4 na powierzchni limfocytu T CD4+. Interakcja ta indukuje zmianę konformacyjną kolca, co sprzyja oddziaływaniu z drugim koreceptorem na powierzchni komórki ^5,9. Znaczenie tych interakcji białkowych w ścieżce infekcji HIV sprawia, że są one niezwykle istotne w podstawowych badaniach nad HIV oraz w dążeniu do stworzenia szczepionki przeciwko HIV.

Konieczność lepszego zrozumienia oddziaływań w skali molekularnej podczas kontaktu komórkowego HIV oraz neutralizacji skłoniła do opracowania techniki pozwalającej na określenie struktur kolca HIV oddziałującego z białkami receptorowymi powierzchni komórki oraz cząsteczkami blokującymi infekcję. Wykorzystując krio-tomografię elektronową i przetwarzanie obrazów 3D, wykazaliśmy niedawno możliwość określenia takich struktur na powierzchni natywnego wirusa z rozdzielczością ˜20 Å ^9,14. Podejście to nie ogranicza się do rozstrzygania struktur otoczki HIV i może zostać rozszerzone na inne białka błonowe wirusów oraz białka zrekonstytuowane na liposomie. W niniejszym protokole opisujemy sposób uzyskiwania struktur glikoprotein otoczki HIV, zaczynając od oczyszczonych wirionów HIV, a następnie przechodząc krok po kroku przez przygotowanie próbek witryfikowanych, gromadzenie danych z krio-mikroskopii elektronowej, rekonstrukcję i przetwarzanie trójwymiarowych wolumenów danych, uśrednianie i klasyfikowanie trójwymiarowych podwolumenów białkowych oraz interpretację wyników w celu stworzenia modelu białka. Aspekty obliczeniowe naszego podejścia zostały zaadaptowane do modułów, do których można uzyskać dostęp i które można uruchamiać zdalnie, korzystając z klastra przetwarzania równoległego Biowulf GNU/Linux w NIH (http://biowulf.nih.gov). Ten zdalny dostęp, w połączeniu z niedrogim sprzętem komputerowym i szybkim dostępem do sieci, umożliwił zaangażowanie badaczy i studentów pracujących w szkołach lub w domu.

Protokół

Opisane tutaj podejście zostało opracowane przy użyciu konkretnego zestawu instrumentów, narzędzi i oprogramowania. Ponieważ nie wszystkie laboratoria będą korzystać z takiej samej konfiguracji eksperymentalnej, podjęto starania, aby w miarę możliwości uogólnić tę metodę oraz zaproponować alternatywy tam, gdzie nie było to możliwe.

1. Przygotowanie witryfikowanych próbek wirusa

W następnej sekcji przygotowano siatki witryfikowane przy użyciu FEI Vitrobot Mark III, robota do osuszania i mrożenia metodą zanurzeniową. Szczegółowy protokół dotyczący obsługi tego systemu znajduje się w pracy Iancu, et al. ⁷. Jako alternatywa dla robota do mrożenia, całkowicie wystarczający będzie plunger grawitacyjny lub typu gilotyna ⁶.

W rozdziałach 1.2. i 1.3. do oczyszczania siatek z próbkami i zwiększenia ich hydrofilowości wykorzystano urządzenie do wyładowań żarowych Gatan Solarus 950, choć można je zastąpić dowolnym urządzeniem do wyładowań żarowych przeznaczonym do pracy z siatkami do mikroskopii elektronowej.

Choć objętość próbki naniesionej na siatkę przed odsączaniem i mrożeniem szokowym powinna wynosić około 2 μL, objętość wirusa i koloidu złota z białkiem A w mieszaninie próbek będzie różnić się w zależności od źródła. W związku z tym prawdopodobne jest, że konieczne będzie przetestowanie i zobrazowanie w mikroskopie różnych rozcieńczeń lub stosunków wirusa do złota w celu empirycznego wyznaczenia optymalnej mieszaniny. Należy pamiętać, że podczas pozyskiwania danych obrazowych w sekcji 3, dla prawidłowego wyrównania serii pochyleń powinno być obecnych od 10 do 20 złotych markerów fiducjalnych.

Uwaga: Niniejszy rozdział opisuje użycie gazowego etanu, wodoru i tlenu, które są wysoce łatwopalne. Podczas korzystania z tych gazów należy zachować szczególną ostrożność. Ponadto próbki wirusów należy obchodzić zgodnie z zaleceniami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego. Na koniec, podczas pracy z ciekłym azotem (N₂) i etanem należy zawsze nosić odzież oraz okulary ochronne.

1. Przygotować FEI Vitrobot Mark III, włączając zasilanie gazem N₂, instalując wkład nawilżacza, a następnie napełniając go filtrowaną wodą dejonizowaną. Włączyć Vitrobot i ustawić temperaturę komory klimatycznej na 22 °C, docelową wilgotność na 100%, czas blotowania na 6 sec oraz przesunięcie blotowania (blot offset) na -2 mm.
2. Włączyć urządzenie do wyładowań żarowych Gatan Solarus 950 i otworzyć butle z H₂ oraz O₂ zasilające urządzenie. Wstępnie oczyścić komorę na próbki, przeprowadzając wyładowanie żarowe przez 1 min przy mocy 50 Watts.
3. Ułożyć odpowiednią liczbę ażurowych siatek węglowych na szklanym szkiełku nakrywkowym, stroną węglową do góry, i umieścić je w komorze na próbki urządzenia do wyładowań żarowych przez górne drzwiczki załadowcze. Oczyścić siatki, przeprowadzając wyładowanie żarowe przez 6-10 sec przy mocy 25 Watts. (Należy zauważyć, że strona węglowa siatek marki Quantifoil użytych w tym protokole ma matowy wygląd. Nie będzie to miało miejsca w przypadku wszystkich siatek komercyjnych, dlatego najlepiej uzyskać tę informację od producenta).
4. Umieścić pudełko(pudełka) na siatki w misie pojemnika z chłodziwem, a wrzeciono dyfuzora termicznego w centralnym kielichu znajdującym się w misie z chłodziwem. Powoli wlewać ciekły N₂ do misy, aż gwałtowne bąbelkowanie ustanie, co wskazuje na osiągnięcie równowagi między misą a cieczą. Utrzymywać poziom ciekłego N₂ przez resztę procedury, dbając o to, aby nie dostał się on do centralnego kielicha.
5. Przymocować jeden koniec plastikowego węża do butli z gazem etanem, a drugi koniec do szklanej pipety. Przystawić końcówkę szklanej pipety do dna centralnego kielicha, ustalić powolny, stały przepływ etanu, aż zacznie on kondensować. Kontynuować napełnianie, aż centralny kielich będzie pełny. Wyjąć wrzeciono z centralnego kielicha.
6. Przygotować mieszaninę próbki, dodając 2 μL koloidu złota z białkiem A (fiducials) do 10 μL zawiesiny inaktywowanego wirusa HIV-1 szczepu AT-2. Delikatnie pipetować mieszaninę, aby wprowadzić znaczniki do roztworu. Przechowywać w lodzie.
7. Chwycić zewnętrzną krawędź siatki za pomocą specjalistycznej pęsety do Vitrobota. Nanieść 2 μL mieszaniny próbki na stronę węglową siatki. Niezwłocznie wydać robotowi polecenie załadowania próbki do nawilżonej komory klimatycznej, blotowania i mrożenia w ciekłym etanie (plunge freeze).
8. Przenieść zwitryfikowaną siatkę do pudełka na siatki. Powtórzyć krok 1.7, aby przygotować odpowiednią liczbę siatek. Po zakończeniu dokręcić śruby w pokrywach pudełka(pudełek) na siatki, a następnie szybko przenieść pudełko(pudełka) do małego transportowego naczynia Dewar z ciekłym azotem.

2. Wprowadzanie próbek do transmisyjnego mikroskopu elektronowego

Przez cały czas trwania tej sekcji należy uważnie monitorować poziom ciekłego N₂ w komorze załadunkowej i uzupełniać ciecz w razie potrzeby, aby zapewnić stałe zanurzenie kasetek z siatkami. Przed kontaktem narzędzia z siatką należy je schłodzić, zanurzając w ciekłym N₂ do czasu wyrównania temperatury z cieczą. Po każdym użyciu narzędzia należy rozmrozić za pomocą opalarki.

W całej tej sekcji transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM) FEI Tecnai G2 Polara jest wykorzystywany wraz ze stacją roboczą Gatan Cryo Workstation. Choć zasada wprowadzania próbek w warunkach ciekłego N₂ ma zastosowanie do wszystkich prac w zakresie krio-mikroskopii elektronowej, kroki opisane w tej sekcji są specyficzne dla sprzętu użytego w eksperymencie. Procedury dla innego sprzętu będą się różnić w zależności od producenta.

OSTRZEŻENIE: W całym tym rozdziale, podczas pracy z ciekłym N₂, należy zawsze stosować odzież ochronną oraz okulary ochronne.

1. Upewnij się, że TEM Compustage nie zawiera wkładu z próbką oraz że pręt wyboru próbek i pręt wprowadzający mają temperaturę poniżej 110 K.
2. Ochłodź i przygotuj stację kriogeniczną (Cryo Workstation) do ładowania siatek do bloku przechowywania próbek, który jest częścią pręta wyboru próbek.
3. Przenieś schłodzony (< 110 K) pręt wyboru z mikroskopu do stacji kriogenicznej.
4. Przesuń pręt wyboru do przodu, aby wprowadzić blok wyboru do kąpieli azotowej w stacji kriogenicznej. Usuń wszystkie wkłady z próbkami z bloku przechowywania, używając specjalistycznej pęsety do obsługi wkładów. Umieść pudełko (pudełka) z siatkami w stacji ładowania i poluzuj pokrywę (pokrywy) za pomocą śrubokręta.
5. Używając pęsety, wyjmij siatkę z pudełka i umieść ją we wkładzie. Użyj specjalistycznego narzędzia do zakładania klipsów w kształcie litery C, aby umieścić taki klips na górze siatki, zabezpieczając ją we wkładzie.
6. Powtarzaj krok 2.5, aż pożądana liczba siatek znajdzie się we wkładach. Przenieś wkłady do bloku wyboru próbek.
7. Przygotuj stację kriogeniczną do wyjęcia pręta wyboru próbek. Przesuń pręt wyboru z powrotem, aby wyjąć blok wyboru z kąpieli azotowej. Zdejmij pręt wyboru ze stacji kriogenicznej i zamocuj go w TEM.

3. Pozyskiwanie danych z kriomikroskopii elektronowej

W tej sekcji interfejs oprogramowania FEI Batch Tomography służy do skonfigurowania pliku wsadowego, w którym przechowywane są współrzędne wszystkich interesujących pozycji na siatce. Po otrzymaniu instrukcji od użytkownika oprogramowanie Batch Tomography ponownie odwiedzi każdą z pozycji i skoordynuje akwizycję serii przechyłów za pomocą programu Digital Micrograph. Jeśli to oprogramowanie nie jest dostępne, darmowym i otwartym pakietem alternatywnym jest Leginon ¹³. Obrazowanie przeprowadzono przy 200 keV, używając filtra Gatan Imaging Filter (GIF) z kamerą CCD 2K x 2K umieszczoną za filtrem GIF (Gatan).

1. Ustaw Compustage tak, aby wiązka elektronów przechodziła przez próżnię. Przełącz tryb ekspozycji na wysokie powiększenie (34kX) i przeprowadź bezpośrednie wyrównania.
2. Wyrównaj pik zerowej straty energii na filtrze energetycznym. (Dostarcza to filtrowi energetycznemu punktu odniesienia dla elektronów o zerowej stracie energii).
3. Przesuń Compustage na obszar siatki z warstwą węgla. W trybie wyszukiwania przy niskim powiększeniu (4.5kX) użyj funkcji Wobbler, aby przechylać stolik w przód i w tył w zakresie +/-15°. Jednocześnie reguluj pozycję stolika w osi Z, aż zaobserwowane zostanie minimalne przesunięcie stolika. (Pozwala to ustawić stolik w przybliżeniu na wysokości eukentrycznej). Wyłącz funkcję Wobbler, gdy nie będzie już zaobserwowane przesunięcia stolika.
4. Użyj zautomatyzowanej funkcji wysokości eukentrycznej, aby precyzyjnie ustawić wysokość eukentryczną. (Procedura ta wykorzystuje korelację wzajemną, aby uzyskać dokładniejszą wysokość eukentryczną niż w kroku 3.3). Wysokość eukentryczna jest zapisywana automatycznie do późniejszego wykorzystania przez oprogramowanie Batch Tomography.
5. Znajdź interesujący obszar zawierający od trzech do sześciu wirionów oraz nie mniej niż dziesięć markerów fiducjalnych. Dodaj tę pozycję siatki do pliku tomografii seryjnej.
6. Powtarzaj kroki 3.4. i 3.5., aż zostanie wyznaczona pożądana liczba pozycji. Zdefiniuj parametry seryjne (±60° z przyrostem nachylenia 2°, 1-2 e-/Ų/widok pod kątem) i uruchom serię pomiarową.

4. Rekonstrukcja tomogramów krio-elektronowych

1. Wyrównaj serie pochyleń, korzystając z automatycznego wyrównania opartego na znacznikach fiducjalnych w programie RAPTOR ¹.
2. Zrekonstruuj tomogramy, stosując wsteczną projekcję z wagowaniem R w programie IMOD ⁸. Standardowym formatem plików dla otrzymanych wolumenów danych jest plik MRC z rozszerzeniem .mrc.

5. Segmentacja podobjętości wirionów i identyfikacja kolców

W tej sekcji wykorzystano dostosowane rozszerzenie programu IMOD, które umożliwia użytkownikowi wyznaczenie podobjętości wirionów w tomogramie. W sekcji 6 zdefiniowane przez użytkownika granice wirionów służą jako powierzchnia, wzdłuż której automatycznie wybierane są kolce.

1. Otwórz program IMOD i wczytaj tomogram zawierający wiriony.
2. Przesuwaj się wzdłuż osi Z tomogramu, aż zlokalizujesz przekrój środkowy jednego z wirionów. Zweryfikuj, czy zidentyfikowano centroid wirionu. Następnie umieść marker wirionu. Marker ten zostanie wykorzystany przez zautomatyzowane narzędzie do segmentacji wirionów w Sekcji 6.
3. Kontynuuj wyznaczanie centroidów, aż zostaną zidentyfikowane objętości wszystkich wirionów.
4. Zamknij tomogram i zapisz zestaw markerów definiujących centroidy wirionów. Powtórz tę czynność, aż wiriony zostaną wyznaczone we wszystkich tomogramach.
5. Za pomocą programu IMOD zmniejsz próbkowanie subtomogramów wirionów czterokrotnie.
6. Odszumij wiriony, stosując anizotropową dyfuzję z wzmacnianiem krawędzi, zaimplementowaną w programie IMOD.
7. Poddaj wiriony nienadzorowanej segmentacji błon za pomocą trójwymiarowego podejścia opartego na energii (szczegóły w pracy Bartesaghi et al. 2005) ³.
8. Kolce są identyfikowane w miejscach na segmentowanych powierzchniach wirionów, które odpowiadają lokalnym maksimom korelacji krzyżowej pomiędzy daną lokalizacją a syntetyczną, symetryczną objętością przypominającą kolec. Lokalizacje przekraczające określony próg są dodawane do listy współrzędnych potencjalnych podobjętości kolców.

6. Klasyfikacja i uśrednianie cząsteczek

1. Oblicz i wyekstrahuj podwolumeny tomogramu (100 x 100 x 100 wokseli) w każdej lokalizacji zidentyfikowanej w kroku 5.8. (czynność ta jest wykonywana bez odszumiania ani binowania). Powstały zbiór podwolumenów zawiera białka spike, które zostaną sklasyfikowane i uśrednione w kolejnych krokach.
2. Wyznacz orientację długiej osi białka spike, wykorzystując wektor normalny do automatycznie zsegmentowanej błony w miejscu każdego białka. Podejście to pozwala na uzyskanie wstępnych szacunków dla dwóch z trzech kątów Eulera.
3. Zrandomizuj pozostały obrót w miejscu, aby zapobiec ewentualnym błędom systematycznym w późniejszych dopasowaniach.
4. Zastosuj kąty Eulera do podwolumenów, a następnie dopasuj podwolumeny translacyjnie do ich cylindrycznie uśrednionej średniej globalnej, aby upewnić się, że wszystkie mają ten sam środek masy.
5. Usuń 10% podwolumenów, które wykazują najsłabszą korelację z zaktualizowaną średnią globalną. Służy to usunięciu gęstości, które są najbardziej narażone na błędną identyfikację jako białka spike.
6. Wyrównaj i sklasyfikuj wolumeny białek spike bez użycia referencji zewnętrznych, uwzględniając brakujący klin (missing wedge) (opisany szczegółowo w Bartesaghi et al. 2008) ⁴. Stopniowo doprecyzuj dopasowania podwolumenów i klasyfikuj wolumeny białek spike w każdej iteracji.
7. Symetria trójskładnikowa powinna być wyraźnie widoczna we wczesnych etapach klasyfikacji; w czwartej iteracji narzuca się symetrię 3-krotną. W każdej rundzie najlepiej zdefiniowane klasy są uśredniane i wykorzystywane jako referencja dla kolejnej rundy.
8. Zazwyczaj do każdego zestawu danych powinno zostać wybranych ˜4000 białek spike. Końcowe mapy gęstości uzyskuje się po ˜5-12 rundach doprecyzowania; będą one obejmować wkład z ˜50% podwolumenów w każdym zestawie danych.

7. Dopasowanie współrzędnych

1. Mapy gęstości uzyskane w kroku 6.8 otwiera się w programie UCSF Chimera ¹².
2. Za pomocą programu Chimera lub EMAN ¹⁰ generuje się symulowaną mapę 20 Å na podstawie współrzędnych rentgenowskich.
3. Współrzędności dopasowuje się do mapy w losowych orientacjach. Wykorzystując wbudowaną w program Chimera lokalną optymalizację metodą najszybszego wzrostu (steepest-ascent), dopasowuje się współrzędne, wykonując wielokrotność 100 kroków najszybszego wzrostu aż do uzyskania zbieżności.

8. Reprezentatywne wyniki

Dzięki zastosowaniu uśredniania 3D i dopasowania współrzędnych udało się rozstrzygnąć struktury różnych kolców Env HIV i SIV. Na rysunku 3A przedstawiono strukturę kolca otoczki szczepu HIV-1, BaL (fioletowy). Kolce wykazują symetrię trzyskładnikową o wymiarach ˜ 120 Å mierzonych od błony do wierzchołka kolca, oraz maksymalnej szerokości ˜ 150 Å, która zwęża się do ˜ 35 Å u podstawy kolca. Jak widać na rysunku 3B, poprzez połączenie mapy gęstości trymerycznego Env wyznaczonej za pomocą krio-tomografii elektronowej ze strukturą krystalograficzną monomeru gp120 (czerwony, pochodząca z PDB ID, 2NY7), możliwe było uzyskanie roboczego modelu molekularnego trymerycznego kompleksu glikoproteiny otoczki (PDB ID, 3DNN) ⁹.

Nasze podejście umożliwia również analizę strukturalną kompleksów tworzonych między trymerycznym białkiem Env a różnymi fragmentami białek specyficznych dla gp120 oraz przeciwciałami. Przykład takiego kompleksu, w którym Env jest związany z szeroko neutralizującym fragmentem b12 Fab, przedstawiono na rysunku 4A (cały kompleks zaznaczono na fioletowo). Na tym rysunku dodatkowa gęstość odpowiadająca b12 jest widoczna jako wyprojektowana na zewnątrz kolca, równolegle do błony. Interpretacje strukturalne takich kompleksów można rozszerzyć do poziomu molekularnego poprzez dopasowanie map gęstości do współrzędnych atomowych fragmentów kolca związanych z odpowiednim ligandem. Jak widać na rysunku 4B, gdy ta mapa gęstości zostanie dopasowana do współrzędnych białka kolca gp120 (czerwone, pochodzące z PDB ID, 2NY7) związanego z b12 Fab (białe), można rozpoznać względną orientację trzech rdzeni gp120 (PDB ID, 3DNL). Te relacje konformacyjne są pomocne w zrozumieniu, w jaki sposób takie ligandy oddziałują z kolcem i zakłócają aktywność wirusa. Inne struktury niezwiązanego i związanego Env, które zostały rozwiązane za pomocą przedstawionej tutaj metody, obejmują struktury HIV-1 R3A, SIV CP-MAC, SIVmneE11S i SIVmac239, kompleks ternarny między HIV-1 Bal Env, sCD4 a 17b Fab, a także SIV CP-Mac Env w kompleksie z przeciwciałem 7D3 ^9,14.

Rycina 1. Od zawiesiny wirusowej do struktury 3D: koncepcyjne etapy krio-mikroskopii elektronowej i rekonstrukcji 3D.

Rysunek 2. (A) Reprezentatywny przekrój z tomogramu wirionów HIV-1. (B) Pojedynczy wirion HIV-1 ze schematycznym przedstawieniem rdzenia i kolców powierzchniowych.

Rysunek 3. (A) Struktura trójwymiarowa glikoproteiny otoczki HIV-1 BaL (kolce powierzchniowe) przedstawiona na powierzchni błony wirusowej. (B) Model molekularny trymerycznych kolców wyznaczony poprzez umieszczenie trzech kopii struktur monomeru gp120 (czerwone), uzyskanych metodą krystalografii rentgenowskiej, w mapie gęstości ⁹.

Rysunek 4. (A) Struktura trójwymiarowa glikoproteiny otoczki HIV-1 BaL w kompleksie z fragmentem Fab szeroko neutralizującego przeciwciała b12. (B) Model molekularny kompleksu wyznaczony poprzez umieszczenie trzech kopii struktur monomerycznego kompleksu gp120-B12 Fab, uzyskanych metodą krystalografii rentgenowskiej, w mapie gęstości ⁹.

Dyskusja

Przedstawione tutaj metody krio-mikroskopii elektronowej oraz klasyfikacji i uśredniania trójwymiarowego umożliwiają wyznaczenie struktur trójwymiarowych kompleksów glikoprotein otoczki z rozdzielczością do ˜ 20 Å. Dopasowanie współrzędnych rentgenowskich komponentów monomerów do map gęstości pozwala na interpretację strukturalną na poziomie molekularnym. Stały postęp w dziedzinie niedrogiego sprzętu komputerowego, w połączeniu z rozwojem otwartoźródłowych narzędzi naukowych i upowszechnieniem infrastruktury sieciowej, umożliwia podejmowanie wcześniej niewyobrażalnych wspólnych przedsięwzięć naukowych. Korzystamy z tych osiągnięć i pokazujemy, że zaawansowane techniki naukowe mogą stać się dostępne dla uczniów i studentów w różnym wieku.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Siatki z dziurkowym węglem Multi-A	Quantifoil Micro Tools	-	200 mesh
Koloid złota z Proteiną A	University of Utrech - The Netherlands	-	średnica 10 nm
HIV-1 BaL	National Institutes of Health	-	~ 1011 wirionów/mL
Pojemnik do przechowywania Cryo-EM	Pacific Grid Tech	GB-4R	4 otwory, okrągły
Vitrobot Mark III	FEI	-	czas odsączania 6 s, przesunięcie -2 mm, wilgotność 100%
Transmisyjny mikroskop elektronowy Tecnai G2 Polara	FEI	-	200 keV
Filtr obrazowania Gatan	Gatan	-	-
Gatan Post-GIF CCD	Gatan	-	2K x 2K pikseli
Gatan Cryo Workstation	Gatan	-	-
System czyszczenia plazmowego Gatan Solarus 950	Gatan	-	Plazmy tlenowa i wodorowa
Klipsy C	FEI	ZIT0634	-
Klaster obliczeniowy Biowulf	National Institutes of Health	-	http://biowulf.nih.gov/
UCSF Chimera	University of California - San Francisco	-	http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
IMOD	University of Colorado - Boulder	-	http://bio3d.colorado.edu/imod/
EMAN	Baylor College of Medicine	-	http://blake.bcm.tmc.edu/eman/
RAPTOR	Stanford University	-	http://www-vlsi.stanford.edu/TEM/index.htm