Technika sekcji ilustruje proces usuwania ciała szklistego, siatkówki oraz soczewki z oka myszy, ich rozdzielenie za pomocą wirowania oraz charakterystykę z wykorzystaniem analiz białkowych.
Artykuł metodologiczny
Ewisceracja ciała szklistego i siatkówki myszy do analiz proteomicznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Choć siatkówka myszy stała się ważnym modelem genetycznym w badaniach nad dziedzicznymi chorobami siatkówki, ciało szkliste myszy pozostaje wciąż słabo zbadane. Ciało szkliste to wysoce wodnista macierz zewnątrzkomórkowa pokrywająca siatkówkę, w której podczas przebiegu choroby gromadzą się białka wewnątrz- i zewnątrzgałkowe.1-3 Nieprawidłowe interakcje między ciałem szklistym a siatkówką leżą u podstaw wielu schorzeń, takich jak odwarstwienie siatkówki, proliferacyjna retinopatia cukrzycowa, zapalenie błony naczyniowej oraz proliferacyjna witreoretinopatia.1,4 Względna objętość ciała szklistego myszy jest znacznie mniejsza niż w przypadku człowieka (Rysunek 1), ponieważ soczewka myszy zajmuje niemal 75% gałki ocznej.5 Sprawia to, że badania biochemiczne ciała szklistego myszy są trudne do przeprowadzenia. W niniejszym artykule wideo prezentujemy technikę wycinania i izolowania ciała szklistego myszy z siatkówki, co umożliwi wykorzystanie transgenicznych modeli mysich do dokładniejszego zdefiniowania roli tej macierzy zewnątrzkomórkowej w rozwoju chorób witreoretinalnych.
Protokół
1. Disekcja segmentu przedniego.
- Tkankę twardówki za limbusEM chwyta się pęsetą 0,22, stabilizując gałkę oczną.
- Za pomocą skalpela mikrosurgicalnego wykonuje się liniowe nacięcie rogówki od limbusa do limbusa.
- Następnie używa się pęsety Colibri 0,12 do chwycenia rogówki w miejscu nacięcia.
- Płyn z przedniej komory oka jest następnie wchłaniany za pomocą chirurgicznego tamponu Weck-Cel.
2. Ewisceracja soczewki.
- Do stabilizacji gałki ocznej używa się pęsety Colibri 0.12, chwytającej rogówkę.
- Za soczewkę, w stronę tylnej części gałki ocznej, wprowadza się precyzyjny uchwyt do zakrzywionych igieł (lub zakrzywioną pęsetę chirurgiczną). Uchwyt do igieł jest częściowo zamknięty i przesuwany do przodu. Pęsetą wywierany jest nacisk na zewnętrzną powierzchnię twardówki, co wypycha soczewkę do przodu przez nacięcie rogówki, nie uszkadzając ściany oka. Ciało szkliste ma postać półprzezroczystego żelu i jest częściowo przylega do soczewki.
- Tkankę soczewki i ciała szklistego umieszcza się następnie w filtrowanej probówce do wirowania zawierającej 20 µl koktajlu inhibitorów proteaz (Roche) rozpuszczonego w PBS.
3. Ewisceracja siatkówki.
- Nadal stabilizuj gałkę oczną, chwytając nacięcie rogówki pęsetą Colibri 0,12.
- Subtelny zakrzywiony uchwyt igłowy (lub zakrzywiona pęseta chirurgiczna) zostaje umieszczony tak daleko w stronę tylnej części gałki ocznej, jak to możliwe, w pobliżu nerwu wzrokowego. Uchwyt igłowy jest częściowo zamknięty i przesuwany do przodu. Pęsetą wywiera się nacisk na zewnętrzną powierzchnię twardówki, co wypycha siatkówkę do przodu przez nacięcie rogówki. Ciało szkliste ma postać przeźroczystego żelu przylegającego do siatkówki. Siatkówka jest widoczna jako żółta, unaczyniona tkanka. Wszelkie pasma tkanki pigmentowej można usunąć pęsetą.
- Tkanka siatkówkowo-szklista zostaje następnie umieszczona w filtrowanej probówce do wirowania zawierającej tkankę soczewkowo-szklistą.
4. Wirowanie z filtrowaniem.
- Przefiltrowaną probówkę do wirowania umieszcza się w wirówce laboratoryjnej. Wirować przy 14 000 x G przez 12 minut.
- Odssać eluat z dolnej komory, który stanowi ciało szkliste. Siatkówka pozostaje w górnej komorze. Próbki te mogą zostać wykorzystane do badań białek.
5. Reprezentatywne wyniki
Próbki ciała szklistego przeanalizowano za pomocą SDS-PAGE (Rysunek 2). Próbki wykorzystano również do oznaczenia aktywności enzymatycznej (Rysunek 3).
Rycina 1. Schemat oka myszy. Przekrój schematyczny oka ludzkiego i mysiego pokazuje względnie mniejszą objętość ciała szklistego w oku myszy ze względu na większą soczewkę.
Rysunek 2. Jednowymiarowa elektroforeza SDS-PAGE ciała szklistego i siatkówki myszy. Profile białkowe ciała szklistego myszy, 13,6 mg/mL (ścieżka 1) oraz siatkówki, 11,35 mg/mL (ścieżka 2). Elektroforezę żelową przeprowadzono przy 150 kV przez 45 minut, barwiąc żel barwnikiem fluorescencyjnym Flamingo i wizualizując za pomocą systemu obrazowania VersaDoc (BioRad, Hercules, CA).
Rycina 3. Aktywność enzymu dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) w ciele szklistym myszy i człowieka. Pomiar całkowitej aktywności SOD (zestaw do kolorymetrycznego oznaczenia aktywności SOD, #AB65354, Abcam, Inc, Cambridge, MA) przeprowadzono na ciele szklistym i siatkówce pobranych drogą ewakuacji z myszy linii DBA oraz myszy albinosów. Wyniki te porównano z aktywnością SOD w ludzkim ciele szklistym oraz ludzkiej siatkówce pobranej z oczu dawców po śmierci w celu określenia aktywności względnej. Próbki nie-rozcieńczonego ciała szklistego aspirowano ręcznie za pomocą igły 23G, 11 a siatkówkę pobierano poprzez otwarcie gałki ocznej i wycięcie tkanki od kompleksu nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE)/naczyniówki. Chociaż test nie rozróżnia izoform SOD, aktywność SOD w ciele szklistym prawdopodobnie odzwierciedla obecność SOD3, ponieważ jest to jedyna izoforma pozakomórkowa.12 Aktywność SOD w siatkówce prawdopodobnie odzwierciedla wszystkie trzy izoformy SOD: wewnątrzkomórkową SOD1, mitochondrialną SOD2 oraz pozakomórkową SOD3. 12 W przypadku wysoce czułych testów enzymatycznych, w tym wspomnianego testu SOD, istnieje możliwość kontaminacji krzyżowej białek, co wymaga dalszych badań. Słupki błędów reprezentują SEM.
Dyskusja
Myszy transgeniczne stanowią istotny model badania chorób siatkówki i ciała witrażowego.6-10 Ciało witrażowe myszy zajmuje jednak znacznie mniejszą proporcję oka w porównaniu z ludzkim ciałem witrażowym, co wynika z obecności dużej soczewki w oku myszy.5 Utrudnia to izolację i oczyszczanie ciała witrażowego myszy. Zrozumienie zmian białkowych zachodzących w ciele witrażowym podczas takich schorzeń, jak proliferacyjna retinopatia cukrzycowa, zwyrodnienie plamki związane z wiekiem, zapalenie błony naczyniowej oka oraz odwarstwienie siatkówki, pozwoli na wgląd w mechanizmy ich postępu. Niniejszy wizualizowany protokół eksperymentalny umożliwia pozyskanie i oczyszczenie ciała witrażowego myszy, maksymalizując jednocześnie wydajność białek do analiz enzymatycznych i proteomicznych.
Oświadczenia
Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Association for Research and Vision in Ophthalmology dotyczącymi wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzroku.
Podziękowania
Finansowanie zostało zapewnione przez Fight for Sight oraz Research to Prevent Blindness.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Skalpel mikrochirurgiczny BD Beaver 15° | BD Biosciences | 374881 | |
| PBS, pH 7.4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| Pęseta do szycia Fine-Castroviejo 0.22 | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| Pęseta Colibri 0.12 | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| Filtr wirówkowy Microcon Ultracel YM-100 lub YM-50 | EMD Millipore | 42412, 42415 | |
| Zestaw do kolorymetrycznego oznaczenia aktywności SOD | Abcam | Ab65354 | |
| Surgical spears Weck-Cel | Medtronic Inc. | 0008680 | |
| Koktajl inhibitorów proteaz | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| Fluorescencyjny barwnik do żeli Flamingo | Bio-Rad | 161-04910 |
Bibliografia
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Prog. Retin. Eye Res. 19, 323-344 (2000).
- Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P. &, Feener, E. P. Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy. J. Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).
- Izuta, H. Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients. Mol. Vis. 15, 2663-2672 (2009).
- Sebag, J. Molecular biology of pharmacologic vitreolysis. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 103, 473-494 (2005).
- Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. Systematic evaluation of the mouse eye: Anatomy, pathology, and biomethods. , CRC Press. 161-195 (2002).
- Ihanamaki, T., Metsaranta, M., Rintala, M., Vuorio, E., Sandberg-Lall, M. Ocular abnormalities in transgenic mice harboring mutations in the type II collagen gene. Eur. J. Ophthalmol. 6, 427-435 (1996).
- Kaarniranta, K. A mouse model for Stickler's syndrome: ocular phenotype of mice carrying a targeted heterozygous inactivation of type II (pro)collagen gene (Col2a1. Exp. Eye Res. 83, 297-303 (2006).
- Marneros, A. G. &, Olsen, B. R. Age-dependent iris abnormalities in collagen XVIII/endostatin deficient mice with similarities to human pigment dispersion syndrome. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 2367-2372 (2003).
- Martin, A. C. Pathogenesis of persistent hyperplastic primary vitreous in mice lacking the arf tumor suppressor gene. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 3387-3396 (2004).
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene. Ther. Mol. Biol. 11B, 229-262 (2007).
- Skeie, J. M., Mahajan, V. B. Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis. J Vis Exp. , (2011).
- Ciechanowski, K. Impaired synthesis is not the reason for decreased activity of extracellular superoxide dismutase in patients with diabetes. Arch Med Res. 36, 148-153 (2005).
Przedruki i uprawnienia
