W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę przygotowania bibliotek do sekwencjonowania mRNA-Seq systemu Illumina, zarówno do odczytów pojedynczych, jak i parowanych, przeznaczonych do analizy ekspresji genów w oparciu o liniową amplifikację RNA za pomocą T7. Protokół ten wymaga jedynie 10 nanogramów całkowitego RNA wyjściowego i pozwala na uzyskanie wysoce spójnych bibliotek reprezentujących pełne transkrypty.
Artykuł metodologiczny
Biblioteki mRNA-Seq Illumina do sekwencjonowania pojedynczego odczytu oraz sekwencjonowania par końców z 10 nanogramów całkowitego RNA
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Sekwencjonowanie całego transkryptomu metodą mRNA-Seq jest obecnie szeroko stosowane do przeprowadzania globalnych analiz ekspresji genów, mutacji, ekspresji allelo-specyficznej oraz innych analiz w skali całego genomu. mRNA-Seq umożliwia ponadto analizę ekspresji genów w genomach niesekwencjonowanych. mRNA-Seq charakteryzuje się wysoką czułością, szerokim zakresem dynamicznym i pozwala na pomiar liczby kopii transkryptów w próbce. Analizator genomu firmy Illumina przeprowadza sekwencjonowanie dużej liczby (> 107) stosunkowo krótkich odczytów sekwencji (< 150 bp). Podejście "paired end", w którym pojedynczy długi odczyt jest sekwencjonowany z obu końców, pozwala na śledzenie alternatywnych miejsc splicingu, insercji i delecji oraz jest użyteczne przy składaniu transkryptomu de novo.
Jednym z głównych wyzwań, z jakimi mierzą się badacze, jest ograniczona ilość materiału wyjściowego. Na przykład w eksperymentach, w których komórki są pozyskiwane metodą mikrodysekcji laserowej, dostępna ilość całkowitego RNA na starcie może być liczona w nanogramach. Opisano przygotowanie bibliotek mRNA-Seq z takich próbek1, 2, jednak wiąże się ono ze znaczną amplifikacją PCR, która może wprowadzać błędy systematyczne. Opublikowano również inne procedury konstrukcji bibliotek RNA-Seq z minimalną amplifikacją PCR3, 4, lecz wymagają one mikrogramowych ilości wyjściowego całkowitego RNA.
Opisujemy tutaj protokół przygotowania bibliotek do sekwencjonowania mRNA-Seq na platformie Illumina Genome Analyzer II, który pozwala uniknąć znacznej amplifikacji PCR i wymaga zaledwie 10 ng całkowitego RNA. Choć protokół ten został opisany wcześniej i zwalidowany dla sekwencjonowania jednostronnego (single-end)5, wykazując tworzenie bibliotek kierunkowych bez wprowadzania istotnego błędu amplifikacji, w niniejszej pracy poddajemy go dalszej walidacji pod kątem zastosowania jako protokół dwustronny (paired-end). Wybiórczo amplifikujemy poliadenylowane mRNA z wyjściowego całkowitego RNA, wykorzystując opartą na T7 metodę amplifikacji liniowej Eberwine, nazwaną "T7LA" (liniowa amplifikacja T7). Amplifikowane poli-A mRNA są fragmentowane, poddawane odwrotnej transkrypcji, a następnie ligowane z adapterami w celu uzyskania końcowej biblioteki sekwencjonowania. Zarówno w przypadku odczytów jednostronnych, jak i dwustronnych, sekwencje są mapowane do ludzkiego transkryptomu6 i normalizowane, aby umożliwić porównanie danych z wielu serii pomiarowych. Poziom ekspresji genów raportujemy w jednostkach transkryptów na milion (TPM), co stanowi lepszą miarę niż RPKM przy porównywaniu próbek7.
Protokół
1. Izolacja całkowitego RNA
- Do komórek/tkanki dodać 1ml Trizol i w razie potrzeby homogenizować za pomocą igły o rozmiarze 18-2 G.
- Dodać 20 μl chloroformu i wirować przy 14 0 rpm przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
- Pobrać górną warstwę wodną, dodać 0,5 μl akryloamidu liniowego, a następnie dodać 50 μl izopropanolu. Pozostawić w temperaturze pokojowej na 20 minut.
- Wirować przy 14 0 rpm w temperaturze 4 °C, przemyć osad 70% etanolem i wysuszyć próżniowo.
- Resuspendować w 1 μl wodzie wolnej od nukleaz i przenieść do probówki PCR o pojemności 20 μl.
2. Przygotowanie dwuniciowego cDNA
- Do powyższej ilości 1 μl RNA dodać 1 μl 10 μM primera do odwrotnej transkrypcji oligo-dT-T7 (5'- GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTT -3'), podgrzać w temperaturze 70 °C (blok grzejny) przez 5 min, a następnie szybko schłodzić na lodzie.
- Dodać 1 μl buforu 5x FS, 0,5 μl DTT, 0,5 μl mieszaniny dNTP oraz 0,5 μl RnaseOUT (z zestawu SuperScript II).
- Podgrzać do 42 °C w termocyklerze przez 1 minutę, następnie dodać 0,5 μl odwrotnej transkryptazy Superscript II. Inkubować przez 1 h w temperaturze 42 °C.
- Podgrzać w temperaturze 70 °C przez 10 minut, schłodzić do 4 °C.
- Na lodzie dodać do powyższej reakcji następujące składniki:
- Woda wolna od nukleaz - 2.75 μl
- Bufor 5X do syntezy drugiej nici - 7.5 μl
- Mieszanina dNTP - 0.75 μl
- Ligaza DNA z E. coli - 0.25 μl
- Polimeraza DNA z E. coli - 1 μl
- Rnaza H - 0.25 μl
Inkubować przez 2 hr w temperaturze 16 °C, a następnie dodać 1 μl polimerazy DNA T4 i inkubować przez kolejne 10 minut w temperaturze 16 °C.
- Przenieś do probówki Eppendorf 1,5 ml i dodaj 80 μl wody.
- Dodaj 0,5 μl akrylamidu liniowego.
- Dodaj 72 μl 3 M NH4OAc oraz 480 μl zimnego 10% etanolu. Wytrąć przez 1 h w temperaturze -20 °C.
- Wiruj przy 14 0 rpm w temperaturze 4 °C przez 30 minut, przemyj 1 mL 70% etanolu, odwiruj przy 14 0 rpm przez 2 minuty i wysusz w próżni przez około 10 minut.
3. Amplifikacja mRNA z ogonem poly-A poprzez transkrypcję in vitro
- Resuspender powyższe cDNA w 3,5 μl wody wolnej od nukleaz.
- Do powyższej mieszaniny dodać po 1 μl każdego z dNTP (łącznie 4 μl), 1 μl buforu reakcyjnego 10X, 1 μl polimerazy T7 oraz 0,5 μl RnaseOUT z zestawu Megascript.
- Inkubować w temperaturze 37 °C w termocyklerze przez noc.
- Próbka jest gotowa do następnego etapu. Można ją przechowywać w temperaturze -80 °C.
4. Fragmentacja amplifikowanego mRNA typu poly-A
- Dodaj do powyższej reakcji 26 μl wody oraz 4 μl 10x odczynnika do fragmentacji.
- Inkubuj w termocyklerze w temperaturze 70 °C przez dokładnie 7 minut.
- Dodaj 5 μl buforu zatrzymującego fragmentację, a następnie umieść próbkę na lodzie.
5. Oczyszczanie RNA
- Do powyższej reakcji dodać 60 μl wody oraz 350 μl buforu RLT z zestawu Rneasy MinElute i wymieszać za pomocą pipety.
- Dodać 250 μl etanolu, wymieszać za pomocą pipety i przenieść do kolumny wirowej.
- Wirować przy 800 rcf przez 20 sekund.
- Przepłukać raz buforem RPE, wirować przez 20 sekund, przepłukać drugi raz 80% EtOH, wirować przez 2 minuty, a następnie osuszyć kolumnę, wirując przez 5 minut.
- Eluować RNA w 10 μl wody wolnej od nukleaz.
6. Synteza cDNA
Synteza pierwszej nici dla biblioteki z pojedynczym odczytem:
- Do probówki PCR dodać następujące składniki:
- Pofragmentowany mRNA poli-A - 10 μl
- NotI Random nonamer Primer - 1 μl
Inkubować w temperaturze 70 °C przez 5 minut w termocyklerze, a następnie szybko schłodzić na lodzie. Primer NotI Nonamer (5'- TGAATTCGCGGCCGCTCAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT NNN -3'). Sekwencja proksymalna 5' stanowi miejsce restrykcyjne NotI, natomiast kolejna sekwencja aż do regionu randomowego jest odwrotnym komplementem sekwencji adaptera B firmy Illumina z zestawu Chip-Seq.
- Do powyższych składników dodać na lodzie następujące odczynniki (z zestawu SuperScript III):
- bufor do pierwszej nici 5X - 4 μl
- DTT - 2 μl
- mieszanina dNTP* - 1.5 μl
Umieścić w termocyklerze na 2 minuty w temperaturze 42°C, dodać 1 μl odwrotnej transkryptazy SuperScript III i inkubować w 42 °C przez 1hr.
*Zamiast dCTP, w mieszaninie dNTP zastosowano 5-methyl dCTP.
Synteza pierwszej nici dla biblioteki typu paired-end:
- Do probówki do PCR dodać następujące składniki:
- Fragmentowany mRNA z ogonem Poly-A - 10 μl
- Losowy primer heksamerowy - 1 μl
Inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut w termocyklerze, a następnie szybko schłodzić na lodzie.
- Do powyższego dodać na lodzie następujące składniki (z zestawu SuperScript firststrand III):
- Bufor do pierwszej nici 5X - 4 μl
- DTT - 2 μl
- dNTP (z zestawu) - 1.5 μl
Umieść w termocyklerze na 1 min w 45 °C, dodaj 1 μl odwrotnej transkryptazy SuperScript III i inkubuj w 45 °C przez 1 godzinę.
Synteza drugiej nici (dla obu bibliotek):
- Do powyższej mieszaniny dodać na lodzie następujące składniki (z zestawu SuperScript II):
- Woda (wolna od RNazy) - 91 μl
- Bufor do drugiej nici 5X - 30 μl
- dNTP (z zestawu) - 3 μl
- Ligaza DNA E. coli - 1 μl
- Polimeraza DNA E. coli - 4 μl
- RNaza H E. coli - 1 μl
Wymieszaj zawartość probówki poprzez odwracanie, krótko wiruj i inkubuj w temperaturze 16 °C przez 2 hr.
7. Oczyszczanie cDNA
- Oczyścić próbkę cDNA za pomocą kolumienek Zymo; eluować w 40 μl wody dla pojedynczego odczytu (single read) lub w 30 μl wody dla biblioteki z odczytem końców parzystych (paired end).
8. Naprawa końców
Dla biblioteki z pojedynczym odczytem:
(Należy użyć zestawu do przygotowywania próbek Illumina Chip-Seq)
- Do powyższych 40 μl cDNA dodać:
- Bufor do ligazy DNA T4 z 10mM ATP - 5 μl
- Mieszanina dNTP - 2 μl
- Polimeraza DNA T4 - 1 μl
- Enzym Klenow (rozcieńczony 1:5 wodą do 1U/ μl) - 1 μl
- T4 PNK - 1 μl
Inkubować w termocyklerze przez 30 minut w temperaturze 20 °C.
Dla biblioteki z odczytem z obu końców:
(Należy użyć zestawu do przygotowania próbek Illumina paired end)
- Do powyższych 30 μl cDNA dodać:
- Woda wolna od RNaz i DNaz - 45 μl
- Bufor do ligazy T4 DNA z 10mM ATP - 10 μl
- Mieszanka dNTP 10mM - 4 μl
- Polimeraza T4 DNA - 5 μl
- Enzym Klenowa - 1 μl
- T4 PNK - 5 μl
Inkubować w termocyklerze przez 30 minut w temperaturze 20 °C.
9. Oczyszczanie cDNA
- Oczyść cDNA przy użyciu kolumienek Zymo. Eluuj w 34 μl buforu EB dla biblioteki single read oraz w 32 μl buforu EB dla biblioteki paired end.
10. Dodanie zasad 'A' do końca 3' fragmentów DNA
Dla biblioteki do odczytu pojedynczego:
- Przygotować następującą mieszaninę reakcyjną:
- próbka DNA - 34 μl
- bufor Klenowa - 5 μl
- dATP - 10 μl
- Klenow exo - 1 μl
Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
Dla biblioteki z odczytem z obu końców (paired-end):
- Przygotować następującą mieszaninę reakcyjną:
- próbka DNA - 32 μl
- bufor Klenowa - 5 μl
- dATP - 10 μl
- Klenow exo - 3 μl
Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
1. Oczyszczanie cDNA
- Oczyść cDNA za pomocą kolumien Zymo. Eluuj w 10 μl buforu EB.
12. Ligacja adapterów
W przypadku biblioteki do odczytu pojedynczego:
(Należy użyć zestawu do przygotowania próbek Illumina Chip-Seq)
- Przygotować następującą mieszaninę reakcyjną:
- próbka DNA - 10 μl
- mieszanina oligonu adaptera - 1 μl
- 2X bufor do ligazy DNA - 15 μl
- ligaza DNA - 4 μl
Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Adaptery należy rozmrozić na lodzie i rozcieńczyć w stosunku 1:20.
W przypadku biblioteki typu paired-end:
(Użyć zestawu Illumina do przygotowania próbek z odczytem par końców)
- Przygotować następującą mieszaninę reakcyjną:
- próbka DNA - 10 μl
- mieszanina oligonukleotydów adapterów PE - 10 μl
- bufor 2X do ligazy DNA - 25 μl
- ligaza DNA - 5 μl
Inkubować przez 15 minut w temperaturze 20 °C. Adaptery należy rozmrozić na lodzie i rozcieńczyć w stosunku 1:20.
13. Oczyszczanie reakcji ligacji
- Oczyść reakcję ligacji przy użyciu kolumien Zymo. Eluuj w 4 μl wody dla biblioteki do pojedynczego odczytu oraz w 6 μl buforu EB, a następnie wykonaj kolejną elucję w 5 μl buforu EB dla biblioteki typu paired-end.
Przeprowadź trawienie enzymem NotI, WYŁĄCZNIE dla biblioteki do odczytu pojedynczego (single read)
- cDNA - 4 μl
- bufor NEB 3 - 5 μl
- BSA - 0.5 μl
- NotI - 1 μl
Inkubować przez 2 h lub przez noc w temperaturze 37 °C, a następnie oczyścić produkt reakcji za pomocą kolumny zymo. Eluować 6 μl buforu EB, a następnie przeprowadzić drugą eluację przy użyciu 5 μl EB.
14. Selekcja według wielkości/Oczyszczanie żelowe
Wykonaj poniższe czynności, używając żelu 2% Sybr Safe E-Gel od firmy Invitrogen.
- Uruchom program 0-PreRun przez 2 minuty.
- Załaduj marker 1kb plus od Invitrogen rozcieńczony 1:4, nakładając 10 μl.
- Załaduj całą próbkę DNA, a puste dołki wypełnij 10 μl wody.
- Uruchom program 1-EGel 2% Run przez 28 minut.
- Wytnij fragment żelu odpowiadający wielkości 20-30 bp za pomocą nowej żyletki.
15. Elucja DNA z wycinka żelu
- Odważyć wycinek żelu i dodać 3 objętości buforu QG na 1 objętość żelu (użyć zestawu Gel Extraction firmy Qiagen)
- Inkubować w temperaturze 50 °C przez 10 minut lub do czasu rozpuszczenia wycinka żelu.
- Dodać 1 objętość izopropanolu i wymieszać poprzez odwracanie probówki lub pipetowanie.
- Przenieść do kolumny, wirować przez 1 minutę z maksymalną prędkością i odrzucić przelew.
- Dodać do kolumny 50 μl buforu QG, wirować przez 1 minutę z maksymalną prędkością i odrzucić przelew.
- Dodać do kolumny 750 μl buforu PE, wirować przez 1 minutę z maksymalną prędkością i odrzucić przelew.
- Wirować przez 1 minutę z maksymalną prędkością.
- Eluować w 36 μl buforu EB dla odczytu pojedynczego (single read) oraz w 23 μl buforu EB dla biblioteki typu paired-end.
16. PCR
Dla biblioteki z odczytem pojedynczym:
(Należy użyć zestawu do przygotowywania próbek Illumina Chip-Seq)
- Przygotować następującą mieszaninę do reakcji PCR:
- DNA - 36 μl
- Bufor Phusion 5X - 10 μl
- Mieszanina dNTP - 1.5 μl
- Starter PCR 1.1 - 1 μl
- Starter PCR 2.1 - 1 μl
- Polimeraza Phusion - 0.5 μl
Należy zastosować następujący protokół PCR:
- 30 sekund w 98 °C
- 10 cykli:
- 10 sekund w 98 °C
- 30 sekund w 65 °C
- 30 sekund w 72 °C
- 5 minut w 72 °C
- Przechowywanie w 4°C
*Przy pierwszym użyciu zestawu należy rozcieńczyć primery PCR w stosunku 1:2 przy użyciu buforu EB.
Dla biblioteki z odczytem z obu końców:
(Należy użyć zestawu do przygotowywania próbek Illumina paired end)
- Przygotować następującą reakcję PCR:
- DNA - 23 μl
- Polimeraza DNA Phusion - 25 μl
- Starter PCR PE 1.1 - 1 μl
- Starter PCR PE 2.1 - 1 μl
Przeprowadzić amplifikację zgodnie z poniższym protokołem PCR:
- 30 sekund w 98°C
- 10 cykli:
- 10 sekund w 98°C
- 30 sekund w 65°C
- 30 sekund w 72°C
- 5 minut w 72°C
- Przechowywanie w 4°C
*Przy pierwszym użyciu zestawu należy rozcieńczyć primery PCR w stosunku 1:2 buforem EB.
17. Oczyszczanie biblioteki
- Oczyść bibliotekę przy użyciu kolumien Zymo. Eluuj w 12 μl buforu EB
18. Oznaczenie ilościowe biblioteki
- Oznacz ilość biblioteki za pomocą Qubit. Jest ona gotowa do sekwencjonowania. W przypadku biblioteki do odczytu pojedynczego (single read) należy użyć starterów do sekwencjonowania z zestawu Illumina single read cluster generation kit V4 lub nowszego, a w przypadku biblioteki do odczytu parzystego (paired end) – z zestawu Illumina paired end cluster generation kit V4 lub nowszego.
19. Analiza danych
Do mapowania odczytów na zestaw genów RefSeq (NCBI Build 36.1) wykorzystano program Bowtie6. Odczyty pojednocznikowe (30 nukleotydów) oraz odczyty parzyste (42 nukleotydów) mapowano, dopuszczając do 10 dopasowań do zestawu genów oraz maksymalnie dwa niedopasowania na odczyt. Wartości TPM (Transcripts Per Million) służące do pomiaru ekspresji genów wyznaczono za pomocą programu RSEM7 (RNA-Seq by Expectation-Maximization).
20. Reprezentatywne wyniki: Przygotowano biblioteki T7LA zarówno dla odczytów pojedynczych, jak i parowanych, z wykorzystaniem wyjściowych ilości całkowitego RNA wynoszących 1 μg, 10 μg, 10 μg, 1 μg i 10 pg (Rysunek 1). W celu oceny naszego protokołu przygotowano biblioteki z odczytem pojedynczym i parowanym bez amplifikacji RNA T7, zaczynając od 10 μg całkowitego RNA. Biblioteki kontrolne te, nazwane „MinAmp”, charakteryzują się minimalną amplifikacją. Jedyną amplifikacją, której podlegają, jest 10 cykli PCR pod koniec protokołu w celu ligacji adapterów sekwencjonowania Illumina, co jest krokiem wspólnym dla wszystkich bibliotek. Wszystkie wykorzystane próbki RNA wyizolowano z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych H148.
W pierwszej kolejności oceniono liczbę genów zidentyfikowanych przez poszczególne biblioteki (Tabela 1 i Tabela uzupełniająca 1). Zarówno w przypadku bibliotek single read, jak i paired end, biblioteki T7LA 10 ng zidentyfikowały niemal taką samą liczbę genów jak biblioteki MinAmp 10 μg przy TPM równym lub większym od 10. W przypadku bibliotek single read biblioteka T7LA 10 ng zidentyfikowała 10% z 850 genów wykrytych w nieamplifikowanej bibliotece 10 μg. W przypadku bibliotek paired end biblioteka T7LA 10 ng zidentyfikowała 86% genów wykrytych w nieamplifikowanej bibliotece 10 μg (7961 z 9267 genów). Biblioteki przygotowane z ilości mniejszych niż 10 ng nie pozwoliły na identyfikację tak dużej liczby genów. Na przykład w protokole single read biblioteka 1 ng zidentyfikowała jedynie ok. 50% genów wykrytych w bibliotece MinAmp 10 μg, co skłoniło nas do ograniczenia najniższej ilości całkowitego RNA stosowanego w protokole T7LA do 10 ng. Ponadto mapowanie genu konstytutywnego GAPDH (Rysunek 2) wykazuje, że wszystkie biblioteki T7LA przygotowane z co najmniej 10 ng RNA wyjściowego zidentyfikowały wszystkie eksony, w tym skrajny ekson 5'. Porównanie bibliotek T7LA 10 ng single read i paired end z bibliotekami MinAmp wykazuje wysoki stopień podobieństwa (korelacja Spearmana, odpowiednio R = 0,90 i 0,95, Rysunki 3a i b). Porównano również dwie biblioteki single read i paired end przygotowane z 10 ng całkowitego RNA, które wykazały bardzo wysoki współczynnik korelacji (R = 0,92), co dowodzi, że oba typy bibliotek przygotowanych zgodnie z protokołem T7LA generują bardzo podobny profil ekspresji genów (Rysunek 3c.). Zatem metoda T7LA umożliwia przygotowanie bibliotek do sekwencjonowania, które są tak samo wiarygodne i kompleksowe jak biblioteki MinAmp, przy zastosowaniu materiału wyjściowego mniejszego o 10 razy.
Rysunek 1 Schemat protokołu przygotowania biblioteki dla odczytów parzystych i pojedynczych.
Rycina 2 Obraz z przeglądarki genomu dla genu konstytutywnego GAPDH dla wszystkich bibliotek odczytów pojedynczych oraz parzystych. Pasek skali po lewej stronie dla bibliotek odczytów pojedynczych wskazuje łącznie 350 odczytów. Pasek skali w centrum dla bibliotek odczytów parzystych wskazuje łącznie 50 odczytów. Oś pozioma przedstawia sekwencję genomową genu GAPDH.
Rysunek 3 Korelacja ekspresji genów pomiędzy poszczególnymi bibliotekami (Spearmana): A. Pomiędzy pojedynczym odczytem 10 ng T7LA a 10 μg Biblioteka MinAmp wykazuje, że obie te biblioteki mają bardzo podobny profil ekspresji genów (R = 0,90). B. Pomiędzy sparowanymi końcami 10 ng T7LA a 10 μg Biblioteka MinAmp wykazuje podobieństwo ich profili ekspresji genów (R = 0,95). C. Korelacja ekspresji genów między bibliotekami 10 ng paired-end a bibliotekami 10 ng single-read wykazuje wysoki stopień podobieństwa między bibliotekami przygotowanymi metodą T7LA (R = 0,92).
Rysunek 4 Identyfikacja genów specyficznych dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych ze wszystkich bibliotek odczytów pojedynczych i parowanych.
| Biblioteka | Typ° | Surowe klastry | % klastrów przechodzących filtr | % dopasowań do genomu | % wskaźnik błędów | Zidentyfikowane geny |
| MinAmp 10ug | Single read | 25602 +/- 4952 | 65.48 +/- 2.58 | 47.61 +/- 0.53 | 0.62 +/- 0.06 | 850 |
| 1ug T7LA | Single read | 14818 +/- 6513 | 82.21 +/- 6.45 | 48.09 +/- 0.27 | 0.42 +/- 0.03 | 8757 |
| 10ng T7LA | Single read | 27385 +/- 1818 | 81.3 +/- 1.75 | 4.46 +/- 4.53 | 0.49 +/- 0.10 | 8709 |
| 10ng T7LA | Single read | 184 +/- 985 | 60.70 +/- 3.70 | 14.96 +/- 1.15 | 0.9 +/- 0.30 | 8589 |
| 1ng T7LA | Single read | 12695 +/- 1365 | 53.27 +/- 16.76 | 4.08 +/- 0.79 | 2.25 +/- 1.56 | 4720 |
| 10pg T7LA | Single read | 10390 +/- 1398 | 72.99 +/- 2.90 | 1.48 +/- 0.20 | 1.51 +/- 0.39 | 121 |
| MinAmp 10ug | Paired End R1 | 95786 +/- 12937 | 90.77 +/- 2.79 | 58.50 +/- 0.95 | 0.94 +/- 0.38 | 9267 |
| Paired End R2 | 95786 +/- 12937 | 90.77 +/- 2.79 | 58.13 +/- 1.13 | 0.9 +/- 0.37 | ||
| 1ug T7LA | Paired End R1 | 29769 +/- 10196 | 91.35 +/- 0.36 | 46.89 +/- 0.14 | 0.47 +/- 0.01 | 734 |
| Paired End R2 | 29769 +/- 10196 | 91.35 +/- 0.36 | 45.52 +/- 0.12 | 0.51 +/- 0.01 | ||
| 100ng T7LA | Paired End R1 | 205602 +/- 932 | 90.53 +/- 0.76 | 63.4 +/- 1.0 | 0.48 +/- 0.02 | 801 |
| Paired End R2 | 205602 +/- 932 | 90.53 +/- 0.76 | 61.80 +/- 8.09 | 0.60 +/- 0.36 | ||
| 10ng T7LA | Paired End R1 | 21462 +/- 155 | 89.98 +/- 1.13 | 56.32 +/- 1.94 | 0.80 +/- 0.26 | 7961 |
| Paired End R2 | 21462 +/- 15 | 89.98 +/- 1.13 | 46.41 +/- 18.39 | 2.48 +/- 2.68 | ; | |
| 1ng T7LA | Paired End R1 | 14951 +/- 19841 | 90.54 +/- 1.19 | 3.91 +/- 0.16 | 8.71 +/- 0.86 | 8124 |
| Paired End R2 | 14951 +/- 19841 | 90.54 +/- 1.19 | 3.27 +/- 1.21 | 9.1 +/- 3.52 | ||
| 10pg T7LA | Paired End R1 | 187600 +/- 1759 | 89.52 +/- 1.1 | 1.78 +/- 0.05 | 13.42 +/- 0.50 | 623 |
| Paired End R2 | 18760 +/- 1759 | 89.52 +/- 1.1 | 1.9 +/- 0.23 | 15.29 +/- 0.96 | ||
° R1 i R2 to sekwencje bezpośrednia i odwrotna tagu
* ≥10 TPM
Tabela 1. Informacje o liczbie klastrów, zidentyfikowanych genach, współczynniku błędów oraz procencie dopasowania dla bibliotek single read i paired end.
Tabela uzupełniająca 1. Lista wszystkich genów oraz ich wartości TPM dla wszystkich próbek, odczytów pojedynczych i parowanych.
Dyskusja
Obecne protokoły przygotowywania bibliotek paired-end wymagają od 1 μg9 do 2,5 μg10 początkowej ilości całkowitego RNA. Przedstawiamy tutaj naszą metodę opartą na liniowej amplifikacji T7 (T7LA) do przygotowania bibliotek do sekwencjonowania Illumina zarówno typu single read, jak i paired-end, oraz wykazujemy, że metoda ta pozwala na generowanie bibliotek z ilości całkowitego RNA wynoszącej już 10 ng, dostarczając danych porównywalnych z danymi z bibliotek minimalnie amplifikowanych (MinAmp) przygotowanych z 1000-krotnie większej ilości materiału wyjściowego (10 μg całkowitego RNA). Biblioteki z 10 ng nie tylko identyfikują podobną całkowitą liczbę genów, ale także generują podobne sygnatury ekspresji genów (ryciny 3a i b). Co więcej, biblioteki single read i paired-end przygotowane metodą T7LA są do siebie bardzo zbliżone (rycina 3c), co pozwala badaczom na porównywanie danych generowanych przez biblioteki sporządzone według obu protokołów. Ponieważ biblioteki te zostały przygotowane z RNA ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, przeszukaliśmy je pod kątem 30 genów specyficznych dla komórek macierzystych i stwierdziliśmy, że prawie wszystkie te geny (93-100%) są identyfikowane w bibliotekach przygotowanych z co najmniej 10 ng początkowego całkowitego RNA (rycina 4), co potwierdza skuteczność naszego protokołu. Uważamy, że nasz protokół byłby bardzo użyteczny dla badaczy, szczególnie w sytuacjach takich jak analiza komórek sortowanych przepływowo lub tkanek mikrodissekowanych laserowo, gdzie ilość materiału wyjściowego jest ograniczona. W takich okolicznościach nasz protokół pozwoliłby na generowanie danych o ekspresji genów porównywalnych z bibliotekami przygotowanymi z znacznie większych ilości materiału, ponieważ nasza metoda uzyskuje profile ekspresji porównywalne w zakresie co najmniej 3 rzędów wielkości początkowego RNA.
Oświadczenia
Autorzy ujawniają, że J.A.T. jest założycielem, udziałowcem, konsultantem i członkiem zarządu firmy Cellular Dynamics International (CDI). Pełni on również funkcję doradcy naukowego i posiada interesy finansowe w Tactics II Stem Cell Ventures.
Podziękowania
Praca ta została sfinansowana przez Morgridge Institute for Research oraz University of Wisconsin Foundation. Dziękujemy Kristie Eastman za pomoc redakcyjną.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Odczynnik do fragmentacji | Ambion | AM8740 | |
| Liniowa akrylamid | Ambion | AM9520 | |
| Zestaw MEGAscript T7 | Ambion | AM1334 | |
| Woda wolna od nukleaz, niepoddana działaniu DEPC | Ambion | AM9932 | |
| Zestaw dNTP | Fermentas | R0181 | |
| metylowane dNTP | Fermentas | R0431 | Tylko do przygotowania próbek Single Read |
| Zestaw TruSeq SR Cluster Generation v5 | Illumina | GD-203-5001 | Tylko do przygotowania próbek Single Read |
| Zestaw TruSeq Seq Kit v5 36 cykli | Illumina | FC-104-5001 | |
| Zestaw Chip Seq Sample Prep | Illumina | IP-102-1001 | Tylko do przygotowania próbek Single Read. Można zastąpić zestawem NEB DNA sample prep Master Mix Set 1 nr kat. E6040S |
| Zestaw TruSeq PE Cluster Generation v5 | Illumina | PE-203-5001 | Tylko do przygotowania próbek paired end |
| Zestaw Paired End Sample Prep | Illumina | PE-102-1001 | Tylko do przygotowania próbek paired end |
| Marker 1kb plus | Invitrogen | 10787-018 | |
| E. coli RNaza H | Invitrogen | 18021-014 | |
| RNase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| Bufor do drugiej nici 5x | Invitrogen | 10812-014 | |
| Polimeraza DNA E. coli | Invitrogen | 18010-017 | |
| E-gel SYBR safe 2% | Invitrogen | G521802 | |
| Superscript III (z buforem 5X FS i 0,1M DTT) | Invitrogen | 18080-085 | |
| Trizol | Invitrogen | 12183555 | |
| Zestaw RNA Qubit assay | Invitrogen | Q32852 | |
| Zestaw dsDNA HS Qubit assay | Invitrogen | Q32851 | |
| Ligaza DNA E. coli | Invitrogen | 18052-019 | |
| Polimeraza DNA T4 | Invitrogen | 18005-025 | |
| Ultrapure woda wolna od DNazy i RNazy | Invitrogen | 10977-015 | |
| Zestaw Superscript II do syntezy dwuniciowego cDNA | Invitrogen | 11917-020 | |
| Losowe primery (Invitrogen) | Invitrogen | 48190-011 | Tylko do przygotowania próbek paired end |
| Primer Not1Nonamer B | IDT | N/A | Tylko do przygotowania próbek Single Read |
| Oligo dT T7 | IDT | N/A | |
| Zestaw do trawienia Not1 | New England Biolabs | R0189S | Tylko do przygotowania próbek Single Read |
| Zestaw Rneasy Minelute | Qiagen | 74204 | |
| Zestaw RNEasy Mini (50) | Qiagen | 74104 | |
| Zestaw do oczyszczania z żelu | Qiagen | 28604 | |
| Zestaw DNazy | Qiagen | 79254 | |
| Zestaw Rneasy MinElute | Qiagen | 74204 | |
| Zestaw do oczyszczania i zagęszczania DNA (250X) | Zymo Research Corp. | D4014 |
Bibliografia
- Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6, 377-382 (2009).
- Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis. Nature Methods. 6, 647-649 (2009).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
- Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing. Nature Methods. 5, 130-132 (2010).
- Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA. Biotechniques. 49, 898-904 (2010).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).
- Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty. Biotechniques. 26, 493-500 (2010).
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- mRNA-Seq-8 Sample Prep Kit [Internet]. , Illumina. Available from: http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn Forthcoming.
- ScriptSeq mRNA-Seq Library Preparation Kit (Illumina -compatible) Epicentre [Internet]. , Epicenter. Available from: http://www.epibio.com/item.asp?id=578 Forthcoming.
Przedruki i uprawnienia
