Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Andreia Gianotti Sommer; Sarah S. Rozelle; Spencer Sullivan; Jason A. Mills; Seon-Mi Park; Brenden W. Smith; Amulya M. Iyer; Deborah L. French; Darrell N. Kotton; Paul Gadue; George J. Murphy; Gustavo Mostoslavsky

doi:10.3791/4327

Artykuł metodologiczny

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

26.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/4327

⸱

31 października 2012

Andreia Gianotti Sommer¹ , Sarah S. Rozelle¹ , Spencer Sullivan² , Jason A. Mills³ , Seon-Mi Park¹ , Brenden W. Smith¹ , Amulya M. Iyer¹ , Deborah L. French³ , Darrell N. Kotton¹ , Paul Gadue³ , George J. Murphy¹ , Gustavo Mostoslavsky¹

¹Center for Regenerative Medicine (CReM), Boston University School of Medicine, ²Department of Hematology, Children's Hospital of Philadelphia, ³Center for Cellular and Molecular Therapeutics, Children's Hospital of Philadelphia

W tym artykule

Podsumowanie

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Streszczenie

Poprzez ektopową ekspresję czterech czynników transkrypcyjnych: Oct4, Klf4, Sox2 i cMyc, ludzkie komórki somatyczne mogą zostać przekształcone w stan pluripotencji, co prowadzi do powstania tzw. indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs)^1-4. Specyficzne dla pacjenta iPSCs nie budzą zastrzeżeń etycznych towarzyszących embrionalnym komórkom macierzystym (ESCs) i pozwoliłyby uniknąć ewentualnego odrzucenia immunologicznego. W związku z tym iPSCs przyciągnęły znaczną uwagę w badaniach nad modelowaniem chorób, przesiewaniu związków farmakologicznych oraz w terapiach regeneracyjnych⁵.

Wykazaliśmy możliwość generowania wolnych od transgenów ludzkich iPSC od pacjentów z różnymi chorobami płuc przy użyciu pojedynczej, wycinanej policistronicznej lentiwirusowej kasety komórek macierzystych (STEMCCA) kodującej czynniki Yamanaki⁶. Linie iPSC te zostały wygenerowane z fibroblastów skóry, najczęściej stosowanego typu komórek w procesie reprogramowania. Zazwyczaj pozyskanie fibroblastów wymaga biopsji skóry wycięciem cylindrycznym, a następnie namnożenia komórek w hodowli przez kilka pasaży. Co ważne, szereg grup badawczych zgłosiło reprogramowanie ludzkich komórek krwi obwodowej do iPSC^7-9. W jednym z badań zastosowano indukowalną Tet wersję wektora STEMCCA⁹, co wymagało jednoczesnego zainfekowania komórek krwi konstytutywnie aktywnym lentiwirusem kodującym odwrotny transaktywator tetracykliny. W przeciwieństwie do fibroblastów, komórki krwi obwodowej można pobrać za pomocą procedur małoinwazyjnych, co znacznie zmniejsza dyskomfort i stres pacjenta. Prosty i skuteczny protokół reprogramowania komórek krwi z użyciem pojedynczego, konstytutywnego, wycinanego wektora może przyspieszyć zastosowanie technologii iPSC, czyniąc ją dostępną dla szerszej społeczności badawczej. Co więcej, reprogramowanie komórek krwi obwodowej umożliwia generowanie iPSC od osób, u których należy unikać biopsji skóry (tj. w przypadku nieprawidłowego bliznowacenia) lub ze względu na istniejące stany chorobowe uniemożliwiające wykonanie biopsji wycięciem cylindrycznym.

W niniejszej pracy prezentujemy protokół generowania ludzkich iPSC z mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) z wykorzystaniem pojedynczego, floksowanego, wycinanego wektora lentiwirusowego konstytutywnie ekspresującego 4 czynniki. Świeżo pobrane lub rozmrożone PBMC są namnażane przez 9 dni zgodnie z opisem^10,11 w medium zawierającym kwas askorbinowy, SCF, IGF-1, IL-3 i EPO przed transdukcją lentiwirusem STEMCCA. Następnie komórki są wysiewane na MEF, a kolonie przypominające ESC można zaobserwować dwa tygodnie po infekcji. Na koniec wybrane klony są namnażane i testowane pod kątem ekspresji markerów pluripotencji SSEA-4, Tra-1-60 i Tra-1-81. Protokół ten jest prosty, odporny i wysoce powtarzalny, stanowiąc niezawodną metodologię generowania ludzkich iPSC z łatwo dostępnej ilości 4 ml krwi.

Protokół

1. Izolacja i namnażanie mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMCs)

DZIEŃ 0

Pobrać 4 ml krwi obwodowej do probówki BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube z cytrynianem sodu. Odwrócić probówkę od 8 do 10 razy i wirować przy 1,800 x g przez 30 min w temperaturze pokojowej. Optymalnie ten etap należy przeprowadzić w ciągu 2 h od pobrania krwi.
Zebrać komórki mononuklearne (MCs), pipetując warstwę leukocytarną (warstwa komórek między barierą żelową a osoczem) do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Uzupełnić całkowitą objętość do 10 ml sterylnym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), kilkukrotnie odwrócić i wirować przy 300 x g przez 15 min.
Resuspendować komórki w 10 ml sterylnego PBS i przeprowadzić zliczenie komórek. Przenieść od 1 do 2x10⁶ komórek do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 300 x g przez 10 min.
Resuspendować komórki w 2 ml pożywki do ekspansji (EM) (pożywka QBSF-60 Stem Cell Medium zawierająca 50 μg/ml kwasu askorbinowego, 50 ng/ml SCF, 10 ng/ml IL-3, 2 U/ml EPO, 40 ng/ml IGF-1, 1 μM deksametazonu oraz 100 μg/ml primociny lub 1% Pen/Strep) i przenieść do jednego dołka płytki 12-dołkowej. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂.
Wirować pozostałe komórki przy 300 x g przez 10 min i zamrozić ok. 2x10⁶ komórek/fiolkę w FBS zawierającym 10% DMSO.
Aby rozpocząć protokół z użyciem zamrożonych PBMC, rozmrozić 1 fiolkę komórek w 10 ml pożywki QBSF i wirować przy 300 x g przez 10 min. Resuspendować komórki w 2 ml EM i przenieść do jednego dołka płytki 12-dołkowej. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂.

DZIEŃ 3 i DZIEŃ 6

Przenieść komórki do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i wypłukać studzienkę raz 1 ml pożywki QBSF-60 Stem Cell Medium w celu zebrania komórek adherentnych.
Odwirować komórki z prędkością 300 x g przez 10 min.
Resuspender komórki w 2 ml EM i przenieść do jednej studzienki płytki 12-dołkowej. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂.

2. Transdukcja PBMC lentiwirusem STEMCCA

DZIEŃ 9

Przenieść komórki do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i wypłukać dołek raz 1 ml pożywki QBSF-60 Stem Cell Medium w celu zebrania komórek adherentnych.
Odwirować komórki z prędkością 300 x g przez 10 min.
Resuspendować komórki w 1 ml świeżego EM zawierającego 5 μg/ml polybrene oraz lentiwirus STEMCCA (MOI=1 do 10), a następnie przenieść do jednego dołka płytki 12-dołkowej. (Protokół opisujący produkcję cząstek lentiwirusowych znajduje się pod adresem http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/)
Wirować płytkę z prędkością 2 250 rpm w temperaturze 25 °C przez 90 min.
Po wirowaniu dodać kolejny 1 ml świeżego EM zawierającego 5 μg/ml polybrene, tak aby całkowita objętość pożywki wynosiła 2 ml, i inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂.

DZIEŃ 10

Przenieś komórki do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i przepłucz studzienkę raz 1 ml pożywki QBSF-60 Stem Cell Medium, aby zebrać komórki adherentne.
Odwiruj komórki przy 300 x g przez 10 min.
Resuspenduj komórki w 2 ml EM i przenieś do jednej studzienki płytki 12-dołkowej. Inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO₂.

3. Wysiewanie transdukowanych komórek na MEFs

DZIEŃ 11

Do studzienek płytki 6-dołkowej nanieść 0,1% żelatynę, a następnie wysiać inaktywowaną linię embrionalnych fibroblastów mysich (MEF) w zagęszczeniu 2x10⁵ komórek/studzienkę w pożywce MEF (IMDM zawierającej 10% FBS, 1% nieessentialnych aminokwasów, 100 μM β-merkaptoetanolu, 2 mM L-glutaminy, 100 μg/ml primocyny lub 1% penicyliny/streptomycyny). Przygotować 3 studzienki na każdą infekcję.

DZIEŃ 12

Przenieść komórki do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i przemyć dołek raz 1 ml pożywki QBSF-60 Stem Cell Medium, aby zebrać komórki adherentne.
Resuspendować komórki w 3 ml pożywki MEF zawierającej 10 ng/ml bFGF, kwas askorbinowy oraz czynniki wzrostu w tych samych stężeniach, co w pożywce EM (50 μg/ml kwasu askorbinowego, 50 ng/ml SCF, 10 ng/ml IL-3, 2 U/ml EPO, 40 ng/ml IGF-1, 1 μM dekzametazonu).
Wysiać 1 ml komórek na każdy dołek płytki 6-dołkowej zawierającej MEF. Dodać 1,5 ml pożywki MEF z bFGF, kwasem askorbinowym i czynnikami wzrostu, tak aby całkowita objętość pożywki wynosiła 2,5 ml na dołek.
Wirować płytkę z prędkością 500 rpm w temperaturze 25 °C przez 30 min. Inkubować płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂.

DZIEŃ 14

Dokarmiać komórki co drugi dzień 2,5 ml pożywki MEF zawierającej 10 ng/ml bFGF i 50 μg/ml kwasu askorbinowego (bez czynników wzrostu). Przy każdym dokarmianiu odessać i usunąć komórki pływające.
Dodawać kolejne MEF w razie potrzeby (zazwyczaj raz w tygodniu).

~ DZIEŃ 20

Po pojawieniu się małych kolonii, codziennie dokarmiać komórki 2 ml pożywki dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) (DMEM/F12 zawierającej 20% Knockout Serum Replacement, 1% nieessentialnych aminokwasów, 100 μM β-merkaptoetanolu, 2 mM L-glutaminy, 100 μg/ml primocyny lub 1% Pen/Strep oraz 10 ng/ml bFGF).

4. Wybieranie i ekspansja klonów iPSC

~ DZIEŃ 30 - 40

Przenieś każdą kolonię do oddzielnych studzienek płytki 12-dołkowej, uprzednio zasianej nieaktywnymi MEF w 1 ml/studzienka pożywki do hESC z dodatkiem 10 μM Stemolecule Y27632 (inhibitor ROCK).
Następnie codziennie dostarczaj komórkom 1 ml samej pożywki do hESC (bez inhibitora ROCK).

5. Barwienie immunofluorescencyjne markerów pluripotencji

Barwienie przeprowadzono przy użyciu zestawu „ES Cell Marker Sample Kit” firmy Millipore, zgodnie z protokołem producenta.

6. Wycięcie zintegrowanego wektora STEMCCA

Wycięcie kasety reprogramującej przeprowadza się przy użyciu wektora wykazującego ekspresję Cre-IRES-Puro po transfekcji i krótkiej selekcji puromycyną, zgodnie z opisem⁶.