Przedkliniczny, mysi model przerzutów do wątroby wykonany techniką iniekcji hemispleen
.Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przedkliniczny mysi model przerzutów do wątroby
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Liczne modele mysie zostały opracowane do badania ludzkich nowotworów i pogłębiania wiedzy na temat leczenia i rozwoju raka. W tym miejscu opisano przedkliniczny, mysi model guza trzustki z przerzutami do wątroby poprzez wstrzyknięcie hemispleenu syngenicznych mysich komórek guza trzustki. Model ten naśladuje wiele stanów klinicznych u pacjentów z chorobą przerzutową do wątroby. Myszy konsekwentnie rozwijają przerzuty do wątroby, co pozwala na badanie procesu przerzutowego, eksperymentalne testy terapii i badania immunologiczne nowotworu.
Wprowadzenie
Gruczolakorak przewodowy trzustki (PDA) jest czwartą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem w Stanach Zjednoczonych1. Pięcioletnie przeżycie u pacjentów z PDA z przerzutami wynosi 2-12%1. Chociaż chemioterapia adjuwantowa i neoadjuwantowa w raku trzustki jest dziś bardziej skuteczna niż kiedykolwiek, nadal istnieje desperacka potrzeba nowych terapii.
Rozwój nowych terapii wymaga wiarygodnych przedklinicznych modeli zwierzęcych. Chociaż podskórne modele guzów są proste w użyciu, wady obejmują niezdolność tych guzów do dawania przerzutów i naśladowania progresji guza i mikrośrodowisk obserwowanych w nowotworach u ludzi. Genetycznie modyfikowane modele, takie jak genetycznie zmodyfikowana mysz zawierająca onkogenne mutacje knock-in Kras i p53 (model KPC)2 oraz model KPC ze znacznikiem linii YFP (model PKCY)3 pozwalają na badanie naturalnie występujących nowotworów u myszy immunokompetentnych. Dodatkowo, mikrośrodowisko guza jest niezmienione i bardziej przypomina to, które obserwuje się w progresji guza u człowieka. Niestety, czas rozwoju guza jest zmienny w tych modelach, co utrudnia badanie eksperymentalnych terapii. Dodatkowo krzyżowanie wsteczne tych myszy wymaga znacznej ilości czasu i zaangażowania finansowego, co nie zawsze jest wykonalne. Wreszcie, wszczepione modele myszy PDA z ksenoprzeszczepem wymagają myszy z obniżoną odpornością, które mają zmienione mikrośrodowiska guza lub nie mają ich wcale. W rezultacie skuteczność terapii eksperymentalnych wykazanych w tych modelach przedklinicznych często nie jest odtwarzalna w badaniach klinicznych na ludziach4.
Ten model myszy hemisplenektomii wykorzystuje komórki nowotworowe Panc02, które są wysoce rakotwórczą, indukowaną metylocholantrenem linią komórkową guza trzustki pochodzącą od myszy C57BL/6 5,6. Dodatkowo w tym modelu można wykorzystać inne mysie linie komórkowe PDA pochodzące od myszy KPC. Schulick i wsp. opracowali wcześniej technikę hemisplenektomii i stworzyli syngeniczny mysi model przerzutów raka jelita grubego7. Ten model hemisplenektomii (ryc. 1) oferuje spójną i równą inokulację guza u myszy immunokompetentnych, nadając się do badania nowych środków terapeutycznych7-10.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były zgodne z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa, a zwierzęta były utrzymywane zgodnie z wytycznymi Stowarzyszenia Oceny i Akredytacji Opieki Laboratoryjnej (AAALAC). Zabieg chirurgiczny jest wykonywany w sterylnych warunkach na sali operacyjnej, która przechodzi minimum piętnaście wymian powietrza na godzinę. Wszystkie narzędzia są sterylizowane w autoklawie przed zabiegiem i ponownie z 70% etanolem pomiędzy każdą myszą podczas zabiegu. Wszystkie myszy, które nie mają szans na przeżycie zabiegu chirurgicznego, są poddawane eutanazji pod wpływem CO2 przez 3 minuty, a następnie zwichnięciu szyjki macicy jeszcze pod narkozą.
1. Przygotowanie komórek
- Zawiesić wyhodowane komórki Panc02 w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami w stężeniu 2 x107 komórek/ml i przechowywać na lodzie.
2. Przygotowanie myszy
- Podawać ketaminę (100 mg/kg) zmieszaną z ksylazyną (10 mg/kg) dootrzewnowo 8-12-tygodniowym samicom myszy C57BL/6 w dawkach podzielonych.
- Sprawdź, czy odruch wycofania się z uszczypnięcia palca u nogi został zniesiony, aby upewnić się, że mysz jest w pełni znieczulona.
- Podaj dodatkowe dawki ketaminy (100 mg / kg) zmieszanej z ksylazyną (10 mg / kg) w razie potrzeby do pełnego znieczulenia myszy.
- Nałóż maść Puralube Vet na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu, gdy myszy są pod narkozą.
- Ogolić obszar chirurgiczny myszy, aby uniknąć zanieczyszczenia rany.
- Przygotuj lewy obszar podżebrowy nacięcia za pomocą 70% etanolu, a następnie jodu.
- Umieść serwetę chirurgiczną wokół brzucha, aby zachować sterylność.
3. Laparotomia
- Wykonaj lewe nacięcie podżebrowe w linii z lewym uchem przez skórę i przez otrzewną za pomocą skalpela.
- Wyraź śledzionę przez nacięcie, wywierając jednoczesny nacisk cyfrowy wzdłuż czaszkowych i ogonowych aspektów nacięcia.
- Zlokalizuj naczynia krwionośne śledziony na dolnym końcu śledziony.
- Podziel śledzionę, umieszczając dwa średniej wielkości klipsy podwiązujące Horizon na środku śledziony, uważając, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych śledziony na biegunach śledziony.
- Umieść górny biegun śledziony z powrotem w otrzewnej, aby uniknąć zanieczyszczenia.
4. Wstrzyknięcie guza
- Pobrać 150 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami do strzykawki o wymiarach 26 G x 5/8".
- Pobrać 100 μl komórek Panc02 (2 x 106) do tej samej strzykawki, utrzymując strzykawkę w pozycji pionowej przez cały czas wstrzyknięcia.
- Zanurz igłę w 70% roztworze etanolu. Igła jest zanurzona w 70% etanolu, aby zapewnić sterylność.
- Wstrzykiwać komórki powoli do odsłoniętej półśledziony, upewniając się, że strzykawka jest zawsze trzymana w pozycji pionowej. Przez cały czas należy obserwować skos strzykawki przez torebkę śledzionową, aby uniknąć wstrzyknięcia komórek pod śledzionę. Po wstrzyknięciu należy zaobserwować wybielanie śledziony i naczyń krwionośnych.
- Podnieś śledzionę i przyłóż jeden średni klips Horizon pod śledzioną, aby zamknąć naczynia krwionośne śledziony.
- Przyłóż jeden mały klips Horizon do najbardziej dystalnej części naczyń trzustkowych i śledziony.
- Podwiązaj naczynia trzustkowe i śledzionowe z półpleenu, przecinając powyżej klipsów Horizon.
- Połóż mysz na boku i przepłucz nacięcie wodą destylowaną.
5. Zamknięcie brzucha i rekonwalescencja po znieczuleniu
- Zamknij otrzewną ściegiem biegowym 4-0.
- Zastosuj dwa lub trzy klipsy do skóry, aby zamknąć nacięcie skóry.
- Podawać podskórnie 0,1 mg/kg buprenorfiny lub 5-10 mg/kg karprofenu w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego.
- Umieść mysz na poduszce grzewczej w celu odzyskania sprawności, aż będzie mobilna, a mysz będzie wykazywać regularne wzorce oddychania. Zwierzęta wracają do towarzystwa innych zwierząt dopiero po pełnym wyzdrowieniu po zabiegu chirurgicznym.
6. Sekcja zwłok i pobieranie wątroby
- Między 30 a 60 dniem po operacji myszy zaczną wykazywać kliniczne objawy przerzutów i będą wymagały eutanazji. Objawy choroby przerzutowej wymagającej humanitarnej eutanazji obejmują powiększenie brzucha i rozwój wodobrzusza. Poddaj myszy eutanazji przez wdychanie CO2 .
- Po inhalacji należy wykonać zwichnięcie szyjki macicy.
- Po ustaleniu, że zwierzę nie reaguje, wykonaj nacięcie przez otrzewną, aby odsłonić brzuch za pomocą nożyczek.
- Za pomocą kleszczy i nożyczek delikatnie wytnij wątrobę z brzucha.
- Umieść wątrobę w związku OCT i błyskawicznie zamroź za pomocą ciekłego azotu. Wątrobę należy przechowywać w temperaturze -80°C. Alternatywnie, wątrobę można utrwalić w 16% neutralnej buforowanej formalinie w temperaturze pokojowej przez 24 godziny i zatopić w parafinie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Komórki nowotworowe Panc02 wstrzyknięte do części śledziony (Rycina 1) tworzą przerzuty do wątroby u 100% myszy, podczas gdy przerzuty do płuc i otrzewnej nie są obserwowane, jeśli technika zostanie wykonana prawidłowo. Metoda ta została zastosowana u ponad stu myszy z wykorzystaniem komórek Panc02 w wielu niezależnych eksperymentach i w sposób powtarzalny wszystkie myszy nieleczone giną z powodu przerzutów do wątroby od 30 do 60 dni po zabiegu hemisplenektomii (Rycina 2). Aby uzyskać is...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ten przedkliniczny mysi model przerzutów raka trzustki do wątroby za pomocą techniki iniekcji połowiczej jest pierwszym opisanym modelem, który odzwierciedla wiele stanów klinicznych i immunologicznych pacjentów z chorobą przerzutową do wątroby. Ten model ma kilka zalet w porównaniu z innymi modelami myszy. Po pierwsze, w przeciwieństwie do transgenicznych modeli raka trzustki, w których tylko u 30% myszy rozwijają się przerzuty do wątroby, a czas powstawania przerzutów jest dość zmienny, ten model ma tę zaletę, że konse...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych istotnych konfliktów interesów.
Podziękowania
KF i KO są współautorami wraz z KS
Ta praca była częściowo wspierana przez AHPBA Fellowship (K.S.), NIH K23 CA148964-01 (L.Z.), Johns Hopkins School of Medicine Clinical Scientist Award (L.Z.), Viragh Foundation i Skip Viragh Pancreatic Cancer Center w Johns Hopkins (E.M.J. i L.Z.), National Pancreas Foundation (L.Z.), Lefkofsky Family Foundation (L.Z.), NCI SPORE in Gastrointestinal Cancers P50 CA062924 (E.M.J., L.Z.), Lustgarten Foundation (L.Z.) i Sol Goldman Pancreatic Cancer Center (K.S., B.H.E., L.Z.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pożywki i składniki | będą się różnić w zależności od linii komórkowej | ||
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Gibco firmy Life Technologies | 10010-023 | |
| 15 ml probówki wirówkowe | Corning | 430052 | |
| Zakrzywione nożyczki operacyjne | Sklep chirurgiczny Roboz | RS-6835 | |
| Mikro preparatory Graefe | Sklep chirurgiczny Roboz | RS-5130 | |
| Uchwyt igły (regularny) | World Precision Instruments, Inc | ||
| Szew | dzięki uprzejmości Departamentu Chirurgii, Johns Hopkins | ||
| Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, mały, kątowy | Teleflex | 137085 | |
| Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, średni, kątowy | Teleflex | 237115 | |
| Średnie klipsy podwiązywalne Weck Horizon | Teleflex | 002200 | |
| Małe klipsy podwiązywalne Weck Horizon | Teleflex | 001200 | |
| Strzykawka, 1 cc, strzykawka o pojemności TB, końcówka 3/8" | do 309625 | Becton Dickinson | |
| , 1 cc, strzykawka TB, końcówka ślizgowa 5/8" | Becton Dickinson | 309597 | |
| 9 mm Autoclip Applier | Mikron | 427630 | |
| 9 mm Autoclip | Becton Dickinson | 427631 | |
| Poduszka grzewcza | Sunbeam | CAT93 | |
| 70% etanolu | sprzedawanego przez wielu sprzedawców | ||
| Chlorowodorek ketaminy | Hospira | 22395DD | |
| Chlorowodorek ksylazyny | Sigma | X1251 |
Bibliografia
- American Cancer Society. Cancer Facts & Figures. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).
- Clark, C. E., Beatty, G. L., Vonderheide, R. H. Immunosurveillance of pancreatic adenocarcinoma: insights from genetically engineered mouse models of cancer. Cancer letters. 279, 1-7 (2009).
- Rhim, A. D., et al. EMT and dissemination precede pancreatic tumor formation. Cell. 148, 349-361 (2012).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nature reviews. Cancer. 7, 645-658 (2007).
- Corbett, T. H., et al. Induction and chemotherapeutic response of two transplantable ductal adenocarcinomas of the pancreas in C57BL/6 mice. Cancer research. 44, 717-726 (1984).
- Leao, I. C., Ganesan, P., Armstrong, T. D., Jaffee, E. M. Effective depletion of regulatory T cells allows the recruitment of mesothelin-specific CD8 T cells to the antitumor immune response against a mesothelin-expressing mouse pancreatic adenocarcinoma. Clinical and translational science. 1, 228-239 (2008).
- Jain, A., et al. Synergistic effect of a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-transduced tumor vaccine and systemic interleukin-2 in the treatment of murine colorectal cancer hepatic metastases. Annals of surgical oncology. 10, 810-820 (2003).
- Yoshimura, K., et al. Selective targeting of antitumor immune responses with engineered live-attenuated Listeria monocytogenes. Cancer research. 66, 1096-1104 (2006).
- Yoshimura, K., et al. Live attenuated Listeria monocytogenes effectively treats hepatic colorectal cancer metastases and is strongly enhanced by depletion of regulatory T cells. Cancer research. 67, 10058-10066 (2007).
- Olino, K., et al. Tumor-associated antigen expressing Listeria monocytogenes induces effective primary and memory T-cell responses against hepatic colorectal cancer metastases. Annals of surgical oncology. 19, Suppl 3. 597-607 (2012).
- Hingorani, S. R., et al. Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice. Cancer cell. 7, 469-483 (2005).
- Marion, A., Aoudi, W., Basarab, A., Delachartre, P., Vray, D. Blood flow evaluation in high-frequency, 40 MHz imaging: a comparative study of four vector velocity estimation methods. Ultrasonics. 50, 683-690 (2010).
- Zheng, L., et al. Tyrosine 23 phosphorylation-dependent cell-surface localization of annexin A2 is required for invasion and metastases of pancreatic cancer. PloS one. 6, e19390(2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
