Osteoklasty pochodzące ze szpiku kostnego myszy

Summary

Osteoklasty są główną komórką resorpcyjną kości w organizmie. Zdolność do izolowania osteoklastów w dużych ilościach zaowocowała znaczącym postępem w zrozumieniu biologii osteoklastów. W tym protokole opisujemy metodę izolacji, hodowli i ilościowego określania aktywności osteoklastów in vitro.

Abstract

Osteoklasty to wysoce wyspecjalizowane komórki, które wywodzą się z linii monocytów/makrofagów szpiku kostnego. Ich wyjątkowa zdolność do resorpcji zarówno organicznych, jak i nieorganicznych matryc kości oznacza, że odgrywają kluczową rolę w regulacji przebudowy szkieletu. Razem osteoblasty i osteoklasty są odpowiedzialne za dynamiczny proces sprzężenia, który obejmuje zarówno resorpcję kości, jak i tworzenie kości, działając razem w celu utrzymania normalnego szkieletu podczas zdrowia i choroby.

Jako główna komórka resorbująca kości w ciele, zmiany w różnicowaniu lub funkcji osteoklastów mogą powodować głębokie skutki w organizmie. Choroby związane ze zmienioną funkcją osteoklastów mogą mieć różne nasilenie, od śmiertelnej choroby noworodka spowodowanej niemożnością wytworzenia przestrzeni szpikowej dla hematopoezy, po częściej obserwowane patologie, takie jak osteoporoza, w której nadmierna osteoklastyczna resorpcja kości predysponuje do powstawania złamań.

Zdolność do izolowania osteoklastów w dużych ilościach in vitro pozwoliła na znaczący postęp w zrozumieniu cyklu przebudowy kości i utorowała drogę do odkrycia nowych strategii terapeutycznych, które zwalczają te choroby.

Tutaj opisujemy protokół izolowania i hodowli osteoklastów ze szpiku kostnego myszy, który daje dużą liczbę osteoklastów.

Introduction

Przebudowa kości jest dynamiczna i polega na sprzężeniu procesu tworzenia kości z resorpcją kości¹. Ten ściśle regulowany proces jest odpowiedzialny za utrzymanie szkieletu podczas normalnej homeostazy oraz w odpowiedzi na urazy i choroby.

Osteoklasty to unikalne, wielojądrowe komórki, które są zdolne do resorpcji zarówno organicznych, jak i nieorganicznych matryc kości. Osteoklasty pochodzą z linii monocytów/makrofagów szpiku kostnego^2-5. Nieprawidłowości w funkcjonowaniu lub tworzeniu osteoklastów mogą powodować różne patologie kliniczne, w tym powszechne schorzenia, takie jak osteoporoza.

Zdolność do generowania osteoklastów in vitro pozwoliła na znaczący postęp w naszym zrozumieniu biologii kości⁶. W rezultacie pojawiają się nowe środki terapeutyczne do leczenia chorób związanych z osteoklastami, które są odpowiedzialne za znaczną zachorowalność i śmiertelność⁷. Homeostatyczne utrzymanie masy i siły kostnej wymaga skoordynowanego działania osteoblastów tworzących kości i osteoklastów resorpcyjnych^{kości 8,9}. Homeostaza kości jest zmieniona w wielu chorobach, w tym w osteoporozie pomenopauzalnej, w której zwiększona aktywność osteoklastów prowadzi do patogennej utraty masy i gęstości kości¹⁰. Wraz z rosnącą dostępnością transgenicznych mysich modeli chorób u ludzi, istnieje więcej możliwości rozszyfrowania roli osteoklastów w chorobach kości^{u ludzi 11-13}.

W literaturze pojawiają się liczne protokoły technik hodowli osteoklastów, z wieloma wariantami opisanymi^9,12,14. Xing i współpracownicy opisują podobną metodologię do protokołu opisanego poniżej, w swoim opisie testów osteoklastogennych z mysich komórek szpiku kostnego. Jednakże, aby uwolnić komórki szpiku kostnego po długim pobraniu kości, Xing i wsp. przepłukują jamę szpiku za pomocą kompletnego podłoża α-MEM¹⁴. Catalfamo bada wpływ hiperglikemii na funkcję osteoklastów i opisuje metodę, w której wszystkie komórki zmobilizowane przez płukanie szpiku kostnego są hodowane przez 24 godziny, po czym nieprzylegające komórki są odrzucane¹², technika stosowana również przez Boyle'a i wsp.⁹ Te wcześniej opublikowane protokoły wymagają praktyki płukania szpiku kostnego, co jest żmudną praktyką, która również wiąże się z ryzykiem zranienia igłą i utraty cennego szpiku kostnego, ponieważ należy przeciąć oba końce kości. Protokół, który opisujemy, implementuje użycie moździerza i tłuczka do izolacji osteoklastów, co jest podobne do metody izolacji makrofagów opisanej przez Weischenfeldta i wsp.¹⁵

Nasze doświadczenie jest jednak takie, że izolacja osteoklastów i hodowla in vitro przy użyciu wcześniej opublikowanych technik skutkuje zmiennymi wynikami w zakresie produkcji osteoklastów, często skutkując niemożnością uprawy osteoklastów. Dlatego opracowaliśmy protokół, który pozwala na konsekwentną izolację szpiku kostnego myszy w celu wytworzenia dużej liczby wielojądrowych osteoklastów in vitro, z przybliżoną wydajnością 70-80% komórek początkowo posianych, tworząc makrofagi, a następnie osteoklasty, w obecności pożywki indukującej osteoklasty.

Protocol

UWAGA: Oświadczenie etyczne: Wszystkie badania z udziałem kręgowców zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Stanford Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC).

1. Przygotowanie

1. Pozwolić, aby 10 ml dostępnej w handlu pożywki do separacji komórek z gradientem gęstości (zawierającej polisacharozę i ditrizoinian sodu, dostosowanych do gęstości 1,077 g/ml) znalazło się w temperaturze pokojowej w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
2. Przygotować bufor do cytometrii przepływowej (FACS) z 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i 2% płodową surowicą cielęcą (FCS). Pobrać podwielokrotność o objętości 50 ml i utrzymywać ją w temperaturze pokojowej do użycia podczas etapu separacji komórek w gradieniu gęstości.
3. Przygotuj wiadro z lodem do przechowywania izolowanych tkanek i komórek podczas procedury izolacji.

2. Przygotuj pożywkę hodowlaną

1. Przygotuj podłoże podstawowe: MEM (Minimal Essential Medium), bez czerwieni fenolowej (500 ml), glutaminianu (1x), FCS (10x), 10 000 jednostek/ml penicyliny (1x).
2. Przefiltruj media podstawowe za pomocą filtra 0,22 μm.
3. Przygotuj pożywkę do indukcji makrofagów szpiku kostnego:
   1. Pobrać 50 ml podłoża podstawowego przygotowanego w kroku 2.1.
   2. Dodać prostaglandynę E2 (PGE2, Mr 352,465 g/mol) w stężeniu końcowym ^10-7 M.
   3. Dodać czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) w stężeniu 10 ng/ml.
   4. Nie filtrować końcowego roztworu pożywki stymulującej makrofagi szpiku kostnego.
4. Przygotować pożywkę do indukcji osteoklastów:
   1. Pobrać 50 ml podłoża podstawowego przygotowanego w kroku 2.1.
   2. Dodać prostaglandynę E2 (PGE2, Mr 352,465 g/mol) w stężeniu końcowym ^10-7 M
   3. Dodać czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) w stężeniu 10 ng/ml.
   4. Dodać RANKL w stężeniu 10 ng/ml.
   5. Nie filtrować końcowego roztworu pożywki indukcyjnej osteoklastów.

3. Izolacja szpiku kostnego

1. Poddaj eutanazji jedną mysz C57BL/6 metodą inhalacji dwutlenkiem węgla, a następnie zwichnięciu szyjki macicy.
   UWAGA: Gryzonie muszą być poddawane eutanazji przez przeszkolony personel przy użyciu odpowiedniej techniki, sprzętu i środków.
2. Ustaw i zabezpiecz mysz na desce preparacyjnej i spryskaj 70% alkoholem.
3. Wypreparuj kości udowe, piszczelowe, ramienne i kręgosłup.
   1. Zacznij od myszy w pozycji leżącej. Wykonaj nacięcie pionowo wzdłuż kończyny dolnej i zacznij od wycięcia wzdłuż kości udowej i piszczelowej, dzieląc przyczepy tkanek miękkich. Na koniec zwichnij kości z kolana i stawu biodrowego, aby całkowicie uwolnić kości od szkieletu.
   2. Przystąp do wykonania nacięcia wzdłuż kończyny górnej, aby odizolować kość ramienną. Zwichnąć kość ramienną w stawach barkowych i łokciowych, rozcinając przyczep torebki tkanek miękkich.
   3. Na koniec odwróć mysz tak, aby mysz leżała na brzuchu. Wykonaj nacięcie skóry wzdłuż kręgosłupa, w linii środkowej. Obserwuj tkankę miękką przykręgosłupa po obu stronach kręgosłupa i naciąć wzdłuż kostnej krawędzi kręgosłupa, przecinając masę tkanek miękkich przykręgosłupa. Za pomocą nożyczek wykonaj poziome cięcie w poprzek kręgosłupa u podstawy szyi i na końcu kręgosłupa, tuż proksymalnie do przyczepu ogona, uwalniając kręgosłup od przyczepu tkanek miękkich.
4. Po zebraniu kości przechowuj je w buforze FACS na lodzie.
5. Użyj bibuły, aby oczyścić mięśnie i tkanki miękkie z kości.
6. Oczyszczone kości umieścić w tłuczku i moździerzu z 3 ml buforu FACS.
7. Delikatnie zmiażdż kości w tłuczku i moździerzu.
8. Odessać płyn zabarwiony krwią i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, przepuszczając roztwór przez sitko o wielkości 70 μm.
9. Dodać 5 ml buforu FACS do zmiażdżonej kości i dalej rozdrabniać. Ponownie usunąć płyn za pomocą pipety i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml przez sitko o średnicy 70 μm.
10. Zazwyczaj miażdży się kości dwa do trzech razy w świeżym buforze FACS, używając moździerza i tłuczka, za każdym razem dodając kolejne 5 ml świeżego buforu FACS, aż płyn nie zabarwi się na czerwono.
11. Odwirować roztwór szpiku kostnego o stężeniu 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać osad komórkowy.

4. Gradientowa separacja komórek szpiku kostnego

1. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml buforu FACS (utrzymywanego w temperaturze pokojowej stężenia).
2. Pobrać stożkową probówkę o pojemności 50 ml zawierającą 10 ml dostępnych w handlu pożywek do separacji komórek z gradientem gęstości (RT).
3. Nałożyć roztwór szpiku kostnego na pożywkę do separacji komórek o gradiencie gęstości. Zrób to powoli za pomocą pipety elektrycznej. Ustawić końcówkę pipety pod kątem względem wewnętrznej powierzchni w pobliżu górnej części stożkowej rurki i przechylić stożkową rurkę pod kątem około 30°. Używając niskiej prędkości na pipecie, delikatnie usunąć roztwór szpiku kostnego, aby nie naruszyć gradientu gęstości pożywki do separacji komórek.
   UWAGA: Ostatecznie będzie jasna definicja między tymi dwoma roztworami (roztwór komórkowy i roztwór pożywki do separacji komórek z gradientem gęstości).
4. Za pomocą wirówki RT odwirować pożywkę do separacji komórek w gradiencie gęstości i roztwór komórkowy w zbalansowanej wirówce o sile 200 x g przez 15 minut. Ponadto należy usunąć przyspieszanie i zwalnianie wirówki, aby zapewnić odpowiednią separację faz za pomocą gradientu mediów do separacji komórek w gradiencie gęstości.
5. Po odwirowaniu odessać mętną warstwę środkową, która zawiera interesujące komórki szpiku kostnego.
6. Przenieś te komórki do nowej stożkowej rurki. Dodać 20 ml dodatkowego buforu FACS (trzymanego na lodzie) w celu przemycia komórek.
7. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać osad komórkowy.
8. Ponownie zawiesić końcową osadkę komórkową w 1 ml pożywki stymulującej makrofagi, aby umożliwić zliczenie komórek za pomocą hemocytometru.

5. Liczenie komórek

1. Pobrać 10 μl roztworu komórkowego i wymieszać z 10 μl błękitu trypanowego. Załadować 10 μl powstałej mieszaniny do hemocytometru i uzyskać liczbę komórek na ml roztworu.

6. Hodowla komórek

1. Umieścić 2 ml pożywki stymulującej makrofagi w każdym dołku 24-dołkowej płytki.
2. Dodaj 200 000 komórek do każdej studzienki.
   UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że gęstość posiewu komórkowego jest jednym z najważniejszych wymagań dla odpowiedniej hodowli in vitro osteoklastów.
3. Delikatnie wymieszać płytkę i umieścić w zwykłym inkubatorze w temperaturze 37 °C.
4. Nie zmieniaj nośnika przez 3 dni.
5. Po 3 dniach w pożywce stymulującej makrofagi zmień pożywkę na pożywkę osteoklastową.
6. Następnie należy zmieniać pożywkę codziennie przez 5–7 dni, po czym na płytce hodowlanej powinny być widoczne duże, wielojądrowe osteoklasty.

7. Barwienie kwaśną fosfatazą odporną na winian (TRAP)

1. Po 5–7 dniach hodowli in vitro dobrze odessać pożywkę z kultury.
2. Delikatnie umyj studzienki 1x PBS trzy razy.
3. Utrwalić komórki, dodając 4% roztwór paraformaldehydu i pozostawić na 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
4. W tym czasie należy przygotować bejcę TRAP (dostępną w handlu) poprzez wstępne podgrzanie do temperatury 37 °C.
5. Po 1 godzinie w paraformaldehydzie odessać paraformaldehyd i delikatnie zmyć 3 razy 1x PBS.
6. Dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej bejcy TRAP do każdego dołka płytki, która ma być zabarwiona.
7. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 godzinę, w osłonie przed światłem.
8. Po 1 godzinie odessać plamę TRAP.
9. Umyj studzienki 3 razy podgrzaną wodą dejonizowaną.
10. Przeciwbarwić studzienkę hematoksyliną Gilla (UWAGA) przez 1-2 minuty.
11. Obrazowanie osteoklastów za pomocą mikroskopii jasnego pola.
12. Myj studzienki wodą dejonizowaną, aż do uzyskania odpowiedniej intensywności koloru plamy, zwykle gdy jądra wydają się niebieskie.

8. Test resorpcji osteoklastów

1. Użyć dostępnego w handlu 24-dołkowego naczynia do hodowli polistyrenu, które jest wstępnie pokryte substratem kostnym lub nieorganiczną krystaliczną powłoką z fosforanu wapnia.
2. Umieścić 2 ml pożywki stymulującej makrofagi w każdym dołku.
3. Dodać 200 000 świeżo wyizolowanych komórek szpiku kostnego uzyskanych pod koniec kroku 2 do każdej studzienki.
4. Delikatnie wymieszać płytkę przed umieszczeniem jej w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 3 dni.
5. W dniu 3 zmień pożywkę na pożywkę różnicującą osteoklasty.
6. Wykonuj codzienne zmiany podłoża za pomocą pożywki różnicującej osteoklasty przez 5–7 dni.

9. Kwantyfikacja aktywności resorpcji osteoklastów

1. Po 5–7 dniach hodowli in vitro w pożywkach różnicujących osteoklasty na zmineralizowanym podłożu należy przeanalizować zmineralizowaną powierzchnię, jak opisano poniżej, aby ocenić zdolność osteoklastów do tworzenia dołów resorpcyjnych, wskaźnika aktywności osteoklastów.
2. Odessać pożywkę z płytki do testu resorpcyjnego i dodać 100 μl 10% roztworu wybielacza do każdej studzienki.
3. Inkubować komórki z 10% roztworem wybielacza przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
4. Umyj studzienki 3 razy wodą destylowaną.
5. Odessać pozostałą wodę, strząsnąć nadmiar wody z płytki i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu na 3–5 godzin.
6. Przeciwbarwić płytkę dostępnym w handlu zestawem do barwienia Von Kossa, aby umożliwić łatwiejszą wizualizację nieresorbowanego podłoża.
7. Użyj mikroskopii jasnego pola, aby wykonać zdjęcia reprezentatywnych części resorpowanej powierzchni.
8. Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, oblicz procent resorbowanej powierzchni, aby umożliwić ilościowe określenie aktywności resorpcyjnej osteoklastów.

Results

Celem tej metody było łatwe wyizolowanie dużej liczby osteoklastów in vitro, zazwyczaj w ciągu jednego tygodnia. Pomyślne wyizolowanie dużej liczby osteoklastów potwierdzono za pomocą barwienia kwaśną fosfatazą oporną na winian (ryc. 1A). Duże osteoklasty są wizualizowane jako duże fioletowe komórki z wieloma jądrami (zwykle ≥ 3 jądrami). Korzystając z tego protokołu, często izoluje się osteoklasty z nawet 30 jądrami na osteoklast (ryc. 1B).

Użycie zm...

Discussion

Zdolność do łatwego izolowania i hodowli dużej liczby osteoklastów in vitro przyczyniła się do pogłębienia wiedzy na temat biologii kości i chorób wywoływanych przez osteoklasty. Doprowadziło do tego zidentyfikowanie RANKL, który został niedawno zidentyfikowany jako główny regulator powstawania, różnicowania i przeżycia osteoklastów^16-18.

Z naszego doświadczenia wynika, że hodowla in vitro osteoklastów ze szpiku kostnego jest w dużej mierze zależna od gęstości wysi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowej	Gibco	51200-038
M-CSF, rekombinowana mysz	Gibco	PMC2044
Rekombinowana mysz TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli wyrażona)	R& D Systems	462-TEC-010
Prostaglandyna E2	Sigma-Aldrich
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Zestaw fosfatazy kwasowej, lekocytów (TRAP)	Sigma-Aldrich	387A
Płytki do resorpcji kości do testu kostnego, płytki 24-dołkowe	Corning Life Sciences	3987