Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

zwapnienie komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz obrazowanie zwapnień i stanów zapalnych aorty

20.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54017

⸱

31 maja 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Anesthesia Center for Critical Care Research of the Department of Anesthesia, Critical Care, and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Cardiovascular Research Center and Cardiology Division of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 3Cardiovascular Division, Brigham and Women's Hospital, 4Harvard Medical School, 5Department of Anesthesiology, Uniklinik RWTH Aachen, RWTH Aachen University, 6Center for Immunology and Inflammatory Diseases and the Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Zwapnienie naczyń krwionośnych jest ważnym czynnikiem predykcyjnym i przyczyniającym się do chorób sercowo-naczyniowych u ludzi. Protokół ten opisuje metody indukowania zwapnienia hodowanych pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz ilościowego określania zwapnienia i obciążenia makrofagami w aorcie zwierzęcej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni.

Streszczenie

Choroby układu krążenia są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na świecie. Blaszki miażdżycowe, składające się z makrofagów obciążonych lipidami i zwapnień, rozwijają się w tętnicach wieńcowych, zastawce aortalnej, aorcie i tętnicach obwodowych i są cechą charakterystyczną chorób sercowo-naczyniowych. U ludzi obrazowanie za pomocą tomografii komputerowej pozwala na ilościowe określenie zwapnienia naczyń krwionośnych; Obecność zwapnienia naczyń krwionośnych jest silnym predyktorem przyszłych zdarzeń sercowo-naczyniowych. Rozwój nowych terapii chorób sercowo-naczyniowych opiera się przede wszystkim na pogłębieniu wiedzy na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw miażdżycy. Pogłębienie naszej wiedzy na temat mechanizmów miażdżycowych opiera się na modelach mysich i komórkowych. W tym miejscu szczegółowo opisano metodę obrazowania zwapnienia aorty i infiltracji makrofagów przy użyciu dwóch spektralnie odrębnych sond do obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni. Obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni pozwala na ilościową ocenę ex vivo zwapnień i akumulacji makrofagów w całej aorcie i może być wykorzystane do pogłębienia naszego zrozumienia mechanistycznego związku między stanem zapalnym a zwapnieniem w miażdżycy. Dodatkowo opisano metodę izolacji i hodowli zwierzęcych komórek mięśni gładkich naczyń aorty oraz protokół wywoływania zwapnienia w hodowanych komórkach mięśni gładkich z mysich aort lub z ludzkich tętnic wieńcowych. Ta metoda modelowania zwapnienia naczyń krwionośnych in vitro może być wykorzystana do identyfikacji i scharakteryzowania szlaków sygnałowych, które mogą być ważne dla rozwoju choroby naczyniowej, w nadziei na odkrycie nowych celów terapii.

Wprowadzenie

Choroby układu krążenia są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na świecie, w tym w Stanach Zjednoczonych, gdzie odpowiadają za ponad 780 000 zgonów rocznie. 1 Zwapnienie tętnic wieńcowych i zwapnienie aorty są cechami charakterystycznymi choroby miażdżycowej i służą jako silne predyktory zdarzeń sercowo-naczyniowych. 2-4 U dorosłych zgłaszano dwa główne typy zwapnienia naczyń krwionośnych: zwapnienie błony wewnętrznej, związane z miażdżycą, oraz zwapnienie przyśrodkowe (znane również jako Mönckeberg), związane z przewlekłą chorobą nerek i cukrzycą. 5 Zwapnienie błony wewnętrznej występuje w otoczeniu akumulacji lipidów i infiltracji makrofagów do ściany naczynia. 5,6 Zwapnienie ścian przyśrodkowych zachodzi niezależnie od zwapnienia błony wewnętrznej, lokalizuje się we włóknach elastyny lub komórkach mięśni gładkich i nie jest związane z odkładaniem się lipidów ani infiltracją makrofagów. 5,7,8 Badania nad molekularnymi mechanizmami zwapnienia naczyń opierały się na systemach komórkowych i modelach zwierzęcych. Modele gryzoni w chorobie miażdżycowej obejmują myszy z niedoborem apolipoproteiny E (ApoE)9,10 lub receptora lipoprotein o niskiej gęstości (LDLR)11 karmione dietą wysokotłuszczową, podczas gdy modele zwapnienia przyśrodkowego obejmują myszy z niedoborem białka Gla macierzy (MGP)12 lub szczury, u których rozwija się mocznica przez prawie całkowitą nefrektomię (model nefrektomii 5/6) lub przez ekspozycję na dietę o wysokiej zawartości adeniny. 13

Tutaj skupia się na modelu zwapnienia naczyń przyśrodkowych związanych z niedoborem MGP. MGP jest białkiem zewnątrzkomórkowym, które hamuje zwapnienie tętnic. 12 Mutacje w genie MGP zostały zidentyfikowane w zespole Keutela, rzadkiej chorobie człowieka charakteryzującej się rozlanym zwapnieniem chrząstki, a także brachytelefalią, utratą słuchu i obwodowym zwężeniem płuc. 14-18 Chociaż nie jest to często obserwowane,19 koncentryczne zwapnienie wielu tętnic zostało opisane w zespole Keutela. 20 Powszechne polimorfizmy w ludzkim genie MGP są związane ze zwiększonym ryzykiem zwapnienia tętnic wieńcowych,21-23 podczas gdy wyższe poziomy krążącego niekarboksylowanego, biologicznie nieaktywnego MGP przewidują śmiertelność z przyczyn sercowo-naczyniowych. 24 W przeciwieństwie do ludzi z zespołem Keutela, myszy z niedoborem MGP rozwijają ciężki fenotyp naczyniowy składający się ze spontanicznego, rozległego zwapnienia tętnic rozpoczynającego się w wieku dwóch tygodni i umierają 6-8 tygodni po urodzeniu z powodu pęknięcia aorty. 12

W przeciwieństwie do myszy ApoE-/- i LDLR-/- karmionych dietą wysokotłuszczową, u których rozwija się zwapnienie naczyń wewnętrznych z towarzyszącym zapaleniem wywołanym przez makrofagi, myszy MGP-/- rozwijają zwapnienie naczyń przyśrodkowych przy braku infiltracji makrofagów. 11,25 Chociaż wyniki te sugerują różne bodźce leżące u podstaw zwapnienia błony wewnętrznej i przyśrodkowej, mechanizmy sygnalizacyjne, które pośredniczą w obu formach zwapnienia, nakładają się na siebie. 26 Zidentyfikowano wiele szlaków sygnałowych, które przyczyniają się do zwapnienia naczyń krwionośnych, w tym mediatory stanu zapalnego, takie jak czynnik martwicy nowotworu-α i IL-1 oraz czynniki proosteogenne, takie jak Notch, Wnt i sygnalizacja białka morfogenetycznego kości (BMP). 27,28 Te szlaki sygnałowe zwiększają ekspresję czynników transkrypcyjnych czynnika transkrypcyjnego związanego z runt 2 (Runx2) i osterix, które z kolei zwiększają ekspresję białek związanych z kośćmi (np. Osteokalcyny, sklerostyny i fosfatazy alkalicznej) w naczyniach krwionośnych, które pośredniczą w zwapnieniu. 28-30 My i inni wykazaliśmy, że zwapnienie naczyń krwionośnych obserwowane u myszy ApoE-/- i LDLR-/- karmionych dietą wysokotłuszczową oraz spontaniczne zwapnienie naczyń krwionośnych obserwowane u myszy MGP-/- zależą od sygnalizacji białka morfogenetycznego kości (BMP) i to właśnie na tym szlaku się tutaj skupiamy. 11,25,31 BMP są silnymi czynnikami osteogennymi wymaganymi do tworzenia kości i wiadomo, że wykazują zwiększoną ekspresję w ludzkiej miażdżycy. 32-34 Badania in vitro wykazały wpływ sygnalizacji BMP na regulację ekspresji czynników osteogennych, takich jak Runx2. 35-37 Nadekspresja liganda BMP, BMP-2, przyspiesza rozwój zwapnienia naczyń krwionośnych u myszy z niedoborem ApoE karmionych dietą wysokotłuszczową. 38 Ponadto stosowanie specyficznych inhibitorów sygnalizacji BMP, takich jak LDN-193189 (LDN)39,40 i / lub ALK3-Fc, zapobiega rozwojowi zwapnienia naczyń krwionośnych zarówno u myszy LDLR-/- karmionych dietą wysokotłuszczową, jak i myszy z niedoborem MGP. 11,25

TGL

Komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) odgrywają kluczową rolę w rozwoju zwapnienia naczyń krwionośnych. 30,41,42 Zwapnienie naczyń przyśrodkowych, które rozwija się u myszy z niedoborem MGP, charakteryzuje się transróżnicowaniem VSMC do fenotypu osteogennego. Utrata MGP powoduje zmniejszoną ekspresję markerów VSMC, w tym miokardyny i aktyny alfa mięśni gładkich, przy jednoczesnym wzroście markerów osteogennych, takich jak Runx2 i osteopontyna. Zmiany te zbiegają się z rozwojem zwapnienia naczyń krwionośnych. 25,43,44

Zwapnienie i stan zapalny aorty u myszy są zazwyczaj oceniane za pomocą technik histochemicznych, takich jak aktywność fosfatazy alkalicznej dla wczesnego zwapnienia i aktywności osteogennej, czerwone barwienie von Kossy i Alizaryny dla późnego zwapnienia oraz protokoły immunohistochemiczne, które celują w markery białek makrofagów (np. CD68, F4/80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). 9,45 Jednak te standardowe techniki obrazowania wymagają przetwarzania tkanek aorty na przekroje poprzeczne, co jest czasochłonne i niedoskonałe ze względu na błąd systematyczny w próbkowaniu, a także mają ograniczoną zdolność do ilościowego określania stanu zapalnego i zwapnienia w całej aorcie. Protokół ten opisuje metodę wizualizacji i ilościowego oznaczania zwapnień i akumulacji makrofagów całej aorty i średniej wielkości tętnic przy użyciu obrazowania molekularnego w bliskiej podczerwieni fluorescencyjnej (NIR) ex vivo. Podano również metodę zbierania i hodowli pierwotnych VSMC aorty od myszy oraz indukowania zwapnienia mysich i ludzkich VSMC in vitro w celu określenia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zwapnienia naczyń krwionośnych. Techniki te zapewniają badaczowi zarówno metody in vivo, jak i in vitro do badania choroby miażdżycowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Trzymanie i wszystkie procedury z udziałem myszy opisane w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szpitala Ogólnego w Massachusetts (Podkomitet ds. Opieki nad Zwierzętami Badawczymi). Wszystkie zabiegi zostały wykonane z dbałością o zminimalizowanie cierpienia.

1. Przygotowanie odczynników

  1. Obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni całych aort
    Uwaga: Sonda do obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni pochodząca z bisfosfonianów może być używana do oznaczania aktywności osteogennej w naczyniach krwionośnych poprzez wiązanie się z hydroksyapatytem. 46,47 Sonda do obrazowania fluorescencyjnego aktywowana katepsyną może służyć jako marker aktywności proteolitycznej i elastololitycznej makrofagów w układzie naczyniowym. 9 Aby umożliwić jednoczesne stosowanie obu sond fluorescencyjnych, ważne jest, aby używać sond, które są spektralnie różne. Notacja NIR wapnia zostanie użyta do wskazania specyficznej dla zwapnienia sondy fluorescencyjnej w bliskiej podczerwieni, a NIR katepsyny do wskazania specyficznej dla aktywności katepsyny sondy do obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni.
    1. Przygotować roztwory NIR wapnia i katepsy NIR. Zgodnie z protokołami producenta, dodać 1,2 ml 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) do fiolki zawierającej 24 nmol wapnia NIR lub katepsyny NIR i delikatnie wstrząsnąć.
      Uwaga: Według producenta, po rozpuszczeniu za pomocą PBS, roztwory NIR wapnia i katepsyny NIR pozostają stabilne przez 14 dni, jeśli są przechowywane w ciemności w temperaturze 2-8 °C.
  2. Izolacja i zwapnienie mysich aort VSMC
    1. Roztwór do trawienia aorty:
      1. Przygotuj świeży roztwór (~ 3-5 ml na zebraną aortę) z Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) zawierającym 175 U/ml kolagenazy typu 2 i 1,25 U/ml elastazy. Wysterylizuj roztwór za pomocą próżniowego systemu filtracji 0,22 μm i trzymaj roztwór na lodzie do czasu użycia.
    2. Nośniki komórkowe:
      1. Uzupełnij 500 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Przed użyciem podgrzej podłoże do 37 °C.
    3. Pożywki do zwapnienia:
      1. Pożywka do zwapnienia A (NaPhos; stosowana w liniach komórkowych myszy):
        1. Uzupełnij 100-500 ml DMEM (objętość w razie potrzeby) 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM fosforanu sodu, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Przed użyciem podgrzej podłoże do temperatury 37 °C.

          OR
           
      2. Pożywka do zwapnienia B (βGP/Asc/DEX; stosowana w liniach komórkowych myszy lub ludzi):
        1. Uzupełnij 100-500 ml DMEM (objętość w razie potrzeby) 10% płodową surowicą bydlęcą, 10 mM disodu β-glicerofosforanu, 50 μg/ml kwasu L-askorbinowego, 10 nM deksametazonu, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Przed użyciem podgrzej podłoże do 37 °C.

2. Iniekcja żyły ogonowej

  1. Przed wstrzyknięciem ogona należy ogrzać myszy pod łagodną lampą grzewczą przez 5 minut.
  2. Utrzymaj mysz w tubie uchwytu na gryzonie. Zdezynfekuj ogon wacikiem nasączonym alkoholem.
  3. Użyj igły 30 G do wstrzykiwania żyły ogonowej. Żyły ogonowe znajdują się bocznie.
    1. Delikatnie naciskać na strzykawkę do przodu, gdy igła jest wsunięta w ogonek. Dostęp do żyły uzyskuje się, gdy opór przed wstrzyknięciem nie jest już dostępny.
    2. Wstrzyknąć objętość 100 μl NIR wapnia i/lub 100 μl NIR katepsyny ze stałą szybkością. Pod koniec wstrzyknięcia, po 5-sekundowej przerwie, należy pobrać igłę.
  4. Pobrać aorty (patrz punkt 3) 3-24 godziny po wstrzyknięciu.

3. Sekcja myszy

  1. Poddaj mysz eutanazji za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia pentobarbitalu w dawce 200 mg/kg.
  2. Połóż zwierzę na wznak na desce do sekcji i ustabilizuj, przyklejając każdą łapę do deski. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego i małych nożyczek wykonaj nacięcie w linii środkowej rozciągające się od dolnej części brzucha do górnej części klatki piersiowej.
  3. Oderwij skórę kleszczami i usuń otrzewną, odsłaniając narządy jamy brzusznej. Usuń narządy żołądkowo-jelitowe, uważając, aby nie przeciąć aorty.
  4. Wykonaj boczne nacięcie w przedniej przeponie i kontynuuj nacięcie w poprzek brzucha. Za pomocą nożyczek preparacyjnych uwolnij klatkę piersiową, przecinając boki żeber i usuwając tkankę miękką przylegającą do górnej części mostka. Usuń klatkę piersiową, odsłaniając płuca.
  5. Początkowo pozostaw serce na miejscu (aby pomóc w identyfikacji i rozwarstwieniu bliższej aorty) i ostrożnie usuń płuca. Ostrożnie usuń grasicę, tchawicę i przełyk, upewniając się, że aorta pozostaje nienaruszona.
  6. Za pomocą prostych cienkich kleszczy i nożyczek do mikropreparowania usuń tkankę miękką otaczającą aortę od rozwidlenia biodrowego do łuku aorty, zwracając szczególną uwagę podczas usuwania tłuszczu okołoaortalnego (ryc. 1A). Usuń pozostały tłuszcz i tkankę miękką otaczającą duże gałęzie łuku aorty (tj. tętnice ramienno-głowowe, tętnice szyjne wspólne i podobojczykowe, ryc. 1B).
    Uwaga: Ważne jest, aby usunąć tłuszcz z aorty, ponieważ tłuszcz może zwiększyć sygnał tła podczas wykonywania obrazowania fluorescencyjnego.
  7. Usuń serce z jamy klatki piersiowej, ostrożnie odłączając je od bliższej aorty i wyrzuć. Przeciąć dystalną aortę w rozwidleniu biodrowym. Za pomocą igły insulinowej wstrzyknij zwykłą sól fizjologiczną do aorty z łuku aorty, aby wypłukać pozostałe krwinki. Odłącz aortę wraz z naczyniami łuku aorty, całkowicie usuwając ją z ciała.
  8. Umieść aortę w normalnym roztworze soli fizjologicznej na lodzie, aż będzie gotowa do obrazowania.

4. Obrazowanie aorty

  1. Obraz aorty ex vivo bezpośrednio po zbiorze za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni. 25
    1. Ustaw obrazowanie fluorescencyjne na odpowiednie wielokanałowe długości fal, aby określić ilościowo intensywność sygnału fluorescencji z aort myszy z wstrzyknięciem wapnia NIR i katepsyny NIR, jak opisano wcześniej. 25 Według producenta wapń NIR może być wzbudzany światłem o długości ~ 650-678 nm z maksymalną emisją w zakresie ~ 680-700 nm. Katepsyna NIR może być wzbudzana światłem o długości fali ~745-750 nm z maksymalną emisją przy ~770 nm.

5. Izolacja pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń aorty

mysiej
  1. Wykonaj kroki 3.1-3.7 zgodnie z powyższym opisem.
  2. Umieść aorty w zimnym HBSS, aż do zakończenia sekcji. Ostrożnie odetnij pozostały tłuszcz okołoaortalny i tkankę miękką, pozostawiając tylko aortę.
  3. Pod sterylnym kapturem do hodowli tkanek przenieś aorty do roztworu do trawienia aorty w szalkach do hodowli tkanek o wymiarach 35 mm x 10 mm. Umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut, delikatnie kołysząc z przerwami. Po strawieniu aorty mają rozciągnięty lub postrzępiony wygląd.
  4. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego i sterylnych kleszczy usuń zewnętrzną warstwę przybyszową aorty, zachowując nienaruszoną warstwę przyśrodkową. Jedną z technik usuwania przydanki jest oderwanie zewnętrznej warstwy aorty na jednym końcu i usunięcie jej z leżącej poniżej warstwy przyśrodkowej, tak jak skarpetę można odkleić i usunąć.
  5. Po usunięciu warstwy przybyszowej umieść pozostałą aortę w nowym naczyniu do hodowli tkankowych z pożywką do hodowli komórkowych i przechowuj w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2-4 godziny.
  6. Pod sterylnym kapturem i za pomocą sterylnych nożyczek do mikrorozwarstwienia o średnicy 3 mm przetnij aortę na pierścienie o szerokości 1-2 mm.
  7. Umieścić te pierścienie w nowym naczyniu do hodowli tkankowej z roztworem do trawienia aorty i inkubować w temperaturze 37 °C z delikatnym przerywanym kołysaniem przez 120 minut. Podczas tej inkubacji kilkakrotnie pipetować roztwór w górę i w dół, aby ponownie zawiesić komórki.
  8. Dodać 5 ml pożywki do hodowli komórek ciepłych do roztworu wytrawiającego i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  9. Wirować probówkę przez 5 minut przy 200 x g.
  10. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić komórki w żądanej objętości pożywki do hodowli komórkowych (np. 5 ml).
  11. Umieścić całą ilość wyizolowanych komórek z każdej aorty w kolbie do hodowli komórkowej o średnicy 25cm2 i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Rozmnażaj komórki przy użyciu standardowych technik, jak opisano wcześniej. 25,48 W ciągu pierwszych 7-10 dni inkubacji należy zmieniać pożywkę co 72-96 godzin. Gdy komórki zbliżają się do konfluencji, należy uzupełniać pożywkę częściej (co 48 godzin).
    Uwaga: Wyhodowanie wystarczającej ilości komórek może zająć wiele tygodni.
  12. Po zlaniu się, komórki przechodzą przez trypsynę, która jest podgrzewana do 37 °C.
    1. Dodać 0,5-1,0 ml trypsyny do każdej kolby hodowlanej i inkubować przez 3-5 minut; delikatnie postukać w bok kolby co 30-60 sekund, w razie potrzeby, aby oderwać komórki od powierzchni.
    2. Gdy komórki oderwą się od dna kolby, dodaj 10 ml pożywki komórkowej do komórek w trypszynie. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut. Odessać pożywkę i trypsynę z osadu komórkowego. Ponownie zawiesić komórki w żądanej ilości świeżej pożywki komórkowej (np. 5-10 ml) i przenieść do nowej kolby (z niektórymi komórkami przeniesionymi na szkiełko komorowe).
  13. Przy pierwszym pasażu komórek potwierdź linię komórek mięśni gładkich za pomocą standardowych technik immunocytochemicznych, jak opisano wcześniej,49 używając przeciwciała skierowanego przeciwko aktynie α mięśni gładkich.

6. Wywoływanie zwapnienia hodowanych komórek mięśni gładkich

  1. Komórki płytkowe otrzymane z 5,12 w formacie 6-dołkowym. Uwaga: Zaleca się rozpoczęcie od 1 x 105 komórek/studzienkę w całkowitej objętości 2,0 ml pożywki komórkowej na studzienkę.
  2. Pozwól komórkom rosnąć w podłożu do zwapnienia A lub B przez co najmniej 7 dni w formacie płytki 6-dołkowej. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  3. Zmieniaj nośnik komórkowy co 48 godzin.

7. Ocena zwapnienia VSMC za pomocą metody barwienia von Kossa

Uwaga: Metoda von Kossa do pomiaru zwapnienia macierzy zewnątrzkomórkowej tkanek lub hodowanych komórek opiera się na podstawianiu jonów wapnia związanych z fosforanami jonami srebra. 50 W obecności światła i związków organicznych jony srebra są redukowane i wizualizowane jako srebro metaliczne. Wszelkie nieprzereagowane srebro usuwa się przez traktowanie tiosiarczanem sodu. 50 Protokół barwienia von Kossy jest następujący:

  1. Odessać pożywkę z płytek do hodowli komórkowych.
  2. Utrwal komórki, umieszczając je w 1 ml 10% formaliny w temperaturze pokojowej na 20 minut.
  3. Usuń formalinę i umyj utrwalone komórki wodą destylowaną przez 5 minut.
  4. Inkubować komórki w 1 ml 5% roztworu azotanu srebra pod bańką o mocy 60-100 W przez 1-2 godziny.
  5. Zassać roztwór azotanu srebra i przemywać wodą destylowaną przez 5 minut.
  6. Usunąć nieprzereagowane srebro, umieszczając komórki w 1 ml 5% roztworu tiosiarczanu sodu (w/v) w wodzie destylowanej na 5 minut.
  7. Płucz komórki wodą destylowaną przez 5 min. Powtórz mycie 3x. Barwnik von Kossa jest gotowy do obrazowania za pomocą standardowej mikroskopii w świetle odwróconym.
  8. Opcjonalny krok: Przeciwbarwić 1 ml szybko czerwonego jądra przez 5 minut. Następnie wykonaj trzy płukania wodą destylowaną (każde po 5 minut).

OR

8. Ocena zwapnienia VSMC za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni

Uwaga: Podobnie jak w przypadku zdolności do rozpoznawania zwapnień w aortach myszy, NIR wapnia łatwo wiąże minerały wapienne zdeponowane przez hodowane komórki. Korzystając z tej techniki, mikroskopia fluorescencyjna i czytniki płytek z filtrami o dużej długości fali mogą odpowiednio obrazować i określać ilościowo zwapnienie in vitro. Emisja NIR wapnia o dużej długości fali pozwala na jednoczesne wykorzystanie fluoroforów emitujących dolną długość fali do wykrywania innych cech. Protokół barwienia NIR wapniowego jest następujący:

  1. Jak opisano w sekcji 1.1.1, dodać 1,2 ml 1x PBS do fiolki zawierającej 24 nmol NIR wapnia.
  2. Rozcieńczyć wapń NIR w stosunku 1:100 w odpowiednich pożywkach do zwapnienia lub kontroli.
  3. Odessać pożywkę komórkową z płytek hodowlanych i zastąpić pożywką hodowlaną zawierającą NIR wapnia.
  4. Inkubować płytki hodowlane z pożywką NIR wapnia przez noc w temperaturze 37 °C.
  5. Odessać pożywkę ze studzienek i raz umyć studzienki za pomocą PBS.
    Uwaga: W tym momencie oryginalne pożywki hodowlane można dodać do studzienek, a komórki można obrazować na żywo. W przeciwnym razie wykonaj poniższe czynności.
  6. Utrwal komórki, umieszczając je w 1 ml 10% formaliny w temperaturze pokojowej na 20 minut.
  7. Usuń formalinę i myj utrwalone komórki wodą destylowaną przez 5 min. Powtórz mycie 3x.
  8. Opcjonalny krok: Wykonaj barwienie immunofluorescencyjne lub inne barwienia przeciwstawne dla interesujących białek. 8,9
    9. pkt.
  9. Zobrazuj lub wykryj barwienie wapniowe NIR za pomocą odpowiednich długości fal wzbudzenia fluorescencji (np. NIR wapniowy może być wzbudzany przez światło o długości 650-678 nm) i filtrów emisyjnych (~ 680-700 nm).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zwapnienia aorty u myszy MGP-/- oraz myszy typu dzikiego zmierzono za pomocą obrazowania fluorescencji wapnia w bliskiej podczerwieni (NIR). W aortach myszy typu dzikiego nie wykryto sygnału wapnia NIR, co wskazuje na brak zwapnień (Rycina 2). W aortach myszy z niedoborem MGP wykryto silny sygnał wapnia NIR, co jest zgodne z zaawansowanym zwapnieniem naczyń. Przekroje tkanek aorty myszy typu dzikiego i MGP-/- barwiono Alizariną czerwoną25 ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zwapnienie tętnic jest ważnym czynnikiem ryzyka chorób sercowo-naczyniowych u ludzi i może bezpośrednio przyczyniać się do patogenezy zdarzeń sercowo-naczyniowych. 1,5,52 Zaproponowano, że odkładanie się wapnia w błonie wewnętrznej w cienkich włóknistych czapeczkach choroby miażdżycowej zwiększa miejscowy stres biomechaniczny i przyczynia się do pękania blaszki miażdżycowej. 53,54 Zwapnienie przyśrodkowe wpływa na wyniki kliniczne poprzez zwiększenie sztywności tętnic, co może wywołać przerost mięśn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Massachusetts General Hospital złożył wniosek o patenty związane z małocząsteczkowymi inhibitorami receptorów BMP typu I oraz zastosowaniem ALK3-Fc w leczeniu miażdżycy i zwapnienia naczyń krwionośnych, a MD, PBY, KDB i RM mogą być uprawnione do opłat licencyjnych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Sarnoff Cardiovascular Research Foundation (MFB i TET), Howard Hughes Medical Institute (TM), Ladue Memorial Fellowship Award od Harvard Medical School (DKR), START-Program Wydziału Lekarskiego RWTH Aachen (MD), Niemiecką Fundację Badawczą (DE 1685/1-1, MD), National Eye Institute (R01EY022746, ESB), Fundację Leducq (Multidyscyplinarny Program Wyjaśniający Rolę Morfogenetycznej Sygnalizacji Białkowej Kości w zakresie patogenezy płuc i układowych chorób naczyniowych, PBY, KDB i DBB), Narodowy Instytut Zapalenia Stawów oraz Chorób Układu Mięśniowo-Szkieletowego i Skóry (R01AR057374, PBY), Narodowy Instytut Cukrzycy i Chorób Układu Pokarmowego i Nerek (R01DK082971, KDB i DBB), Nagroda Amerykańskiego Towarzystwa Kardiologicznego #11FTF7290032 (RM) oraz Narodowy Instytut Serca, Płuc i Krwi (R01HL114805 i R01HL109506, EA; K08HL111210, RM).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
15 ml probówka stożkowaFalcon352096
Igła 30 GBD305106
Alfa przeciwciało aktynowe do mięśni gładkichSigmaSAB2500963
Szkiełko komoroweNunc Lab-Tek154461
Kolagenaza, Typ 2 WorthingtonLS004176
DeksametazonSigmaD4902
Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle Technologie ŚredniegoŻycia11965-084
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco, bez wapniaGibco14190-144
ElastazaSigmaE1250
Płodowa surowica bydlęcaGibco16000-044
Kleszcze drobnoziarnisteRobozRS-4972
Kleszcze, ząbkowane na całej krzywejRobozRS-5138
Formalina (10%)Mikroskopia elektronowa Nauki15740
Zrównoważony roztwór soli HankaGibco14025-092
Ludzkie komórki mięśni gładkich tętnic wieńcowychPromoCellC-12511
Strzykawka insulinowa z igłąTerumoSS30M2913
Kwas L-askorbinowySigmaA-7506
Nożyczki sprężynowe do mikropreparacji (13 mm)RobozRS-5676
Nożyczki sprężynowe do mikropreparacji (3 mm)RobozRS-5610
NIR, katepsyna (ProSense-750EX)Perkin ElmerNEV10001EX
NIR, osteogenne (OsteoSense-680EX)Perkin ElmerNEV10020EX
Normalna sólfizjologiczna Hospira0409-4888-10
Jądrowo szybki czerwonySigma-AldrichN3020
System obrazowania OdysseyLi-CorOdyssey 3.0
Penicylina/StreptomycynaCorning30-001-CI
Azotan srebra (5%)Ricca Chemical Company6828-16
Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodnySigma-AldrichS-9390
Tiosiarczan soduSigmaS-1648
ß-glicerofosforan sól disodowa hydrat SigmaG9422
Kolba do hodowli tkankowych, 25 cm2Falcon353108
Posiew tkankowy płytka (35 mm x 10 mm)Falcon353001
Płytka do hodowli tkankowej, sześciodołkowaFalcon353046
TrypsinCorning25-053-CI
Rurkowy uchwyt na gryzonieKent Scientific RSTR551
Próżniowy system filtracjiMilliporeSCGP00525

Bibliografia

  1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
  2. Wilson, P. W., et al. Abdominal aortic calcific deposits are an important predictor of vascular morbidity and mortality. Circulation. 103 (11), 1529-1534 (2001).
  3. Budoff, M. J., et al. Assessment of coronary artery disease by cardiac computed tomography: a scientific statement from the American Heart Association on Committee on Cardiovascular Imaging and Intervention, Council on Cardiovascular Radiology and Intervention, and Committee on Cardiac Imaging, Council on Clinical Cardiology. Circulation. 114 (16), 1761-1791 (2006).
  4. Greenland, P., LaBree, L., Azen, S. P., Doherty, T. M., Detrano, R. C. Coronary artery calcium score combined with Framingham score for risk prediction in asymptomatic individuals. Jama. 291 (2), 210-215 (2004).
  5. Otsuka, F., Sakakura, K., Yahagi, K., Joner, M., Virmani, R. Has our understanding of calcification in human coronary atherosclerosis progressed? Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 724-736 (2014).
  6. Virmani, R., Burke, A. P., Farb, A., Kolodgie, F. D. Pathology of the vulnerable plaque. J Am Coll Cardiol. 47 (8 Suppl), C13-C18 (2006).
  7. Amann, K. Media calcification and intima calcification are distinct entities in chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (6), 1599-1605 (2008).
  8. Aikawa, E., et al. Arterial and aortic valve calcification abolished by elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation. 119 (13), 1785-1794 (2009).
  9. Aikawa, E., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116 (24), 2841-2850 (2007).
  10. Qiao, J. H., et al. Pathology of atheromatous lesions in inbred and genetically engineered mice. Genetic determination of arterial calcification. Arterioscler Thromb. 14 (9), 1480-1497 (1994).
  11. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 613-622 (2012).
  12. Luo, G., et al. Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein. Nature. 386 (6620), 78-81 (1997).
  13. Shobeiri, N., Adams, M. A., Holden, R. M. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. Am J Nephrol. 31 (6), 471-481 (2010).
  14. Keutel, J., Jorgensen, G., Gabriel, P. [A new autosomal-recessive hereditary syndrome. Multiple peripheral pulmonary stenosis, brachytelephalangia, inner-ear deafness, ossification or calcification of cartilages]. Dtsch Med Wochenschr. 96 (43), 1676-1681 (1971).
  15. Munroe, P. B., et al. Mutations in the gene encoding the human matrix Gla protein cause Keutel syndrome. Nat Genet. 21 (1), 142-144 (1999).
  16. Cormode, E. J., Dawson, M., Lowry, R. B. Keutel syndrome: clinical report and literature review. Am J Med Genet. 24 (2), 289-294 (1986).
  17. Fryns, J. P., van Fleteren, A., Mattelaer, P., van den Berghe, H. Calcification of cartilages, brachytelephalangy and peripheral pulmonary stenosis. Confirmation of the Keutel syndrome. Eur J Pediatr. 142 (3), 201-203 (1984).
  18. Ozdemir, N., et al. Tracheobronchial calcification associated with Keutel syndrome. Turk J Pediatr. 48 (4), 357-361 (2006).
  19. Cranenburg, E. C., et al. Circulating matrix gamma-carboxyglutamate protein (MGP) species are refractory to vitamin K treatment in a new case of Keutel syndrome. J Thromb Haemost. 9 (6), 1225-1235 (2011).
  20. Meier, M., Weng, L. P., Alexandrakis, E., Ruschoff, J., Goeckenjan, G. Tracheobronchial stenosis in Keutel syndrome. Eur Respir J. 17 (3), 566-569 (2001).
  21. Wang, Y., et al. Common genetic variants of MGP are associated with calcification on the arterial wall but not with calcification present in the atherosclerotic plaques. Circ Cardiovasc Genet. 6 (3), 271-278 (2013).
  22. Cassidy-Bushrow, A. E., et al. Matrix gla protein gene polymorphism is associated with increased coronary artery calcification progression. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (3), 645-651 (2013).
  23. Crosier, M. D., et al. Matrix Gla protein polymorphisms are associated with coronary artery calcification in men. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 55 (1), 59-65 (2009).
  24. Liu, Y. P., et al. Inactive matrix Gla protein is causally related to adverse health outcomes: a Mendelian randomization study in a Flemish population. Hypertension. 65 (2), 463-470 (2015).
  25. Malhotra, R., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signal transduction prevents the medial vascular calcification associated with matrix Gla protein deficiency. PLoS One. 10 (1), e0117098(2015).
  26. Demer, L. L., Tintut, Y. Inflammatory, metabolic, and genetic mechanisms of vascular calcification. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 715-723 (2014).
  27. Rusanescu, G., Weissleder, R., Aikawa, E. Notch signaling in cardiovascular disease and calcification. Curr Cardiol Rev. 4 (3), 148-156 (2008).
  28. Leopold, J. A. Vascular calcification: Mechanisms of vascular smooth muscle cell calcification. Trends Cardiovasc Med. 25 (4), 267-274 (2015).
  29. Bostrom, K. I., Rajamannan, N. M., Towler, D. A. The regulation of valvular and vascular sclerosis by osteogenic morphogens. Circ Res. 109 (5), 564-577 (2011).
  30. Hruska, K. A., Mathew, S., Saab, G. Bone morphogenetic proteins in vascular calcification. Circ Res. 97 (2), 105-114 (2005).
  31. Yao, Y., et al. Inhibition of bone morphogenetic proteins protects against atherosclerosis and vascular calcification. Circ Res. 107 (4), 485-494 (2010).
  32. Bostrom, K., et al. Bone morphogenetic protein expression in human atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 91 (4), 1800-1809 (1993).
  33. Bragdon, B., et al. Bone morphogenetic proteins: a critical review. Cell Signal. 23 (4), 609-620 (2011).
  34. Cai, J., Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Lett. 586 (14), 1993-2002 (2012).
  35. Lee, K. S., et al. Runx2 is a common target of transforming growth factor beta1 and bone morphogenetic protein 2, and cooperation between Runx2 and Smad5 induces osteoblast-specific gene expression in the pluripotent mesenchymal precursor cell line C2C12. Mol Cell Biol. 20 (23), 8783-8792 (2000).
  36. Matsubara, T., et al. BMP2 regulates Osterix through Msx2 and Runx2 during osteoblast differentiation. J Biol Chem. 283 (43), 29119-29125 (2008).
  37. Li, X., Yang, H. Y., Giachelli, C. M. BMP-2 promotes phosphate uptake, phenotypic modulation, and calcification of human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 199 (2), 271-277 (2008).
  38. Nakagawa, Y., et al. Paracrine osteogenic signals via bone morphogenetic protein-2 accelerate the atherosclerotic intimal calcification in vivo. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30 (10), 1908-1915 (2010).
  39. Cuny, G. D., et al. Structure-activity relationship study of bone morphogenetic protein (BMP) signaling inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 18 (15), 4388-4392 (2008).
  40. Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic ossification. Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).
  41. Schurgers, L. J., Uitto, J., Reutelingsperger, C. P. Vitamin K-dependent carboxylation of matrix Gla-protein: a crucial switch to control ectopic mineralization. Trends Mol Med. 19 (4), 217-226 (2013).
  42. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circ Res. 104 (6), 733-741 (2009).
  43. Speer, M. Y., Li, X., Hiremath, P. G., Giachelli, C. M. Runx2/Cbfa1 but not loss of myocardin, is required for smooth muscle cell lineage reprogramming toward osteochondrogenesis. J Cell Biochem. 110 (4), 935-947 (2010).
  44. Steitz, S. A., et al. Smooth muscle cell phenotypic transition associated with calcification: upregulation of Cbfa1 and downregulation of smooth muscle lineage markers. Circ Res. 89 (12), 1147-1154 (2001).
  45. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney Int. 67 (6), 2488-2493 (2005).
  46. Zaheer, A., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of osteoblastic activity. Nat Biotechnol. 19 (12), 1148-1154 (2001).
  47. Aikawa, E., et al. Multimodality molecular imaging identifies proteolytic and osteogenic activities in early aortic valve disease. Circulation. 115 (3), 377-386 (2007).
  48. Lee, K. J., Czech, L., Waypa, G. B., Farrow, K. N. Isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice. J Vis Exp. (80), e50889(2013).
  49. Tang, Y., Herr, G., Johnson, W., Resnik, E., Aho, J. Induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition. J Vis Exp. (78), (2013).
  50. Puchtler, H., Meloan, S. N. Demonstration of phosphates in calcium deposits: a modification of von Kossa's reaction. Histochemistry. 56 (3-4), 177-185 (1978).
  51. Krahn, K. N., Bouten, C. V., van Tuijl, S., van Zandvoort, M. A., Merkx, M. Fluorescently labeled collagen binding proteins allow specific visualization of collagen in tissues and live cell culture. Anal Biochem. 350 (2), 177-185 (2006).
  52. Johnson, R. C., Leopold, J. A., Loscalzo, J. Vascular calcification: pathobiological mechanisms and clinical implications. Circ Res. 99 (10), 1044-1059 (2006).
  53. Vengrenyuk, Y., et al. A hypothesis for vulnerable plaque rupture due to stress-induced debonding around cellular microcalcifications in thin fibrous caps. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14678-14683 (2006).
  54. Maldonado, N., et al. A mechanistic analysis of the role of microcalcifications in atherosclerotic plaque stability: potential implications for plaque rupture. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303 (5), H619-H628 (2012).
  55. Toussaint, N. D., Kerr, P. G. Vascular calcification and arterial stiffness in chronic kidney disease: implications and management. Nephrology (Carlton). 12 (5), 500-509 (2007).
  56. Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans. J Nucl Med Technol. 39 (4), 264-270 (2011).
  57. Smith, J. G., et al. Association of low-density lipoprotein cholesterol-related genetic variants with aortic valve calcium and incident aortic stenosis. Jama. 312 (17), 1764-1771 (2014).
  58. Thanassoulis, G., et al. Genetic associations with valvular calcification and aortic stenosis. N Engl J Med. 368 (6), 503-512 (2013).
  59. Otto, C. M., Kuusisto, J., Reichenbach, D. D., Gown, A. M., O'Brien, K. D. Characterization of the early lesion of 'degenerative' valvular aortic stenosis. Histological and immunohistochemical studies. Circulation. 90 (2), 844-853 (1994).
  60. New, S. E., Aikawa, E. Molecular imaging insights into early inflammatory stages of arterial and aortic valve calcification. Circ Res. 108 (11), 1381-1391 (2011).
  61. Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (7), 1017-1024 (2009).
  62. Stern, P. H. Antiresorptive agents and osteoclast apoptosis. J Cell Biochem. 101 (5), 1087-1096 (2007).
  63. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23 (4), 185-188 (2001).
  64. Chamley-Campbell, J., Campbell, G. R., Ross, R. The smooth muscle cell in culture. Physiol Rev. 59 (1), 1-61 (1979).
  65. Trion, A., Schutte-Bart, C., Bax, W. H., Jukema, J. W., van der Laarse, A. Modulation of calcification of vascular smooth muscle cells in culture by calcium antagonists, statins, and their combination. Mol Cell Biochem. 308 (1-2), 25-33 (2008).
  66. Mori, K., Shioi, A., Jono, S., Nishizawa, Y., Morii, H. Dexamethasone enhances In vitro vascular calcification by promoting osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19 (9), 2112-2118 (1999).
  67. Thyberg, J. Differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells in culture. Int Rev Cytol. 169, 183-265 (1996).
  68. Dinardo, C. L., et al. Vascular smooth muscle cells exhibit a progressive loss of rigidity with serial culture passaging. Biorheology. 49 (5-6), 365-373 (2012).
  69. Metz, R. P., Patterson, J. L., Wilson, E. Vascular smooth muscle cells: isolation, culture, and characterization. Methods Mol Biol. 843, 169-176 (2012).
  70. Proudfoot, D., Shanahan, C. Human vascular smooth muscle cell culture. Methods Mol Biol. 806, 251-263 (2012).
  71. Hruska, K. A. Vascular smooth muscle cells in the pathogenesis of vascular calcification. Circ Res. 104 (6), 710-711 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie zwapnienia aortyobrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwienimysie komórki mięśni gładkich aortyindukcja w pożywce do zwapnianiabarwienie metodą Von Kossawstrzyknięcie do żyły ogonowejroztwór do trawienia aortyocena infiltracji makrofagówkwantyfikacja w programie ImageJ
zwapnienie komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz obrazowanie zwapnień i stanów zapalnych aorty
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.