Artykuł metodologiczny
* These authors contributed equally
Zwapnienie naczyń krwionośnych jest ważnym czynnikiem predykcyjnym i przyczyniającym się do chorób sercowo-naczyniowych u ludzi. Protokół ten opisuje metody indukowania zwapnienia hodowanych pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz ilościowego określania zwapnienia i obciążenia makrofagami w aorcie zwierzęcej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni.
Choroby układu krążenia są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na świecie. Blaszki miażdżycowe, składające się z makrofagów obciążonych lipidami i zwapnień, rozwijają się w tętnicach wieńcowych, zastawce aortalnej, aorcie i tętnicach obwodowych i są cechą charakterystyczną chorób sercowo-naczyniowych. U ludzi obrazowanie za pomocą tomografii komputerowej pozwala na ilościowe określenie zwapnienia naczyń krwionośnych; Obecność zwapnienia naczyń krwionośnych jest silnym predyktorem przyszłych zdarzeń sercowo-naczyniowych. Rozwój nowych terapii chorób sercowo-naczyniowych opiera się przede wszystkim na pogłębieniu wiedzy na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw miażdżycy. Pogłębienie naszej wiedzy na temat mechanizmów miażdżycowych opiera się na modelach mysich i komórkowych. W tym miejscu szczegółowo opisano metodę obrazowania zwapnienia aorty i infiltracji makrofagów przy użyciu dwóch spektralnie odrębnych sond do obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni. Obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni pozwala na ilościową ocenę ex vivo zwapnień i akumulacji makrofagów w całej aorcie i może być wykorzystane do pogłębienia naszego zrozumienia mechanistycznego związku między stanem zapalnym a zwapnieniem w miażdżycy. Dodatkowo opisano metodę izolacji i hodowli zwierzęcych komórek mięśni gładkich naczyń aorty oraz protokół wywoływania zwapnienia w hodowanych komórkach mięśni gładkich z mysich aort lub z ludzkich tętnic wieńcowych. Ta metoda modelowania zwapnienia naczyń krwionośnych in vitro może być wykorzystana do identyfikacji i scharakteryzowania szlaków sygnałowych, które mogą być ważne dla rozwoju choroby naczyniowej, w nadziei na odkrycie nowych celów terapii.
Choroby układu krążenia są główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na świecie, w tym w Stanach Zjednoczonych, gdzie odpowiadają za ponad 780 000 zgonów rocznie. 1 Zwapnienie tętnic wieńcowych i zwapnienie aorty są cechami charakterystycznymi choroby miażdżycowej i służą jako silne predyktory zdarzeń sercowo-naczyniowych. 2-4 U dorosłych zgłaszano dwa główne typy zwapnienia naczyń krwionośnych: zwapnienie błony wewnętrznej, związane z miażdżycą, oraz zwapnienie przyśrodkowe (znane również jako Mönckeberg), związane z przewlekłą chorobą nerek i cukrzycą. 5 Zwapnienie błony wewnętrznej występuje w otoczeniu akumulacji lipidów i i....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie badania na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Trzymanie i wszystkie procedury z udziałem myszy opisane w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szpitala Ogólnego w Massachusetts (Podkomitet ds. Opieki nad Zwierzętami Badawczymi). Wszystkie zabiegi zostały wykonane z dbałością o zminimalizowanie cierpienia.
1. Przygotowanie odczynników
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Zwapnienia aorty u myszy MGP-/- oraz myszy typu dzikiego zmierzono za pomocą obrazowania fluorescencji wapnia w bliskiej podczerwieni (NIR). W aortach myszy typu dzikiego nie wykryto sygnału wapnia NIR, co wskazuje na brak zwapnień (Rycina 2). W aortach myszy z niedoborem MGP wykryto silny sygnał wapnia NIR, co jest zgodne z zaawansowanym zwapnieniem naczyń. Przekroje tkanek aorty myszy typu dzikiego i MGP-/- barwiono Alizariną czerwoną25 .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Zwapnienie tętnic jest ważnym czynnikiem ryzyka chorób sercowo-naczyniowych u ludzi i może bezpośrednio przyczyniać się do patogenezy zdarzeń sercowo-naczyniowych. 1,5,52 Zaproponowano, że odkładanie się wapnia w błonie wewnętrznej w cienkich włóknistych czapeczkach choroby miażdżycowej zwiększa miejscowy stres biomechaniczny i przyczynia się do pękania blaszki miażdżycowej. 53,54 Zwapnienie przyśrodkowe wpływa na wyniki kliniczne poprzez zwiększenie sztywności tętnic, co może wywołać przerost mięśn.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Massachusetts General Hospital złożył wniosek o patenty związane z małocząsteczkowymi inhibitorami receptorów BMP typu I oraz zastosowaniem ALK3-Fc w leczeniu miażdżycy i zwapnienia naczyń krwionośnych, a MD, PBY, KDB i RM mogą być uprawnione do opłat licencyjnych.
Ta praca była wspierana przez Sarnoff Cardiovascular Research Foundation (MFB i TET), Howard Hughes Medical Institute (TM), Ladue Memorial Fellowship Award od Harvard Medical School (DKR), START-Program Wydziału Lekarskiego RWTH Aachen (MD), Niemiecką Fundację Badawczą (DE 1685/1-1, MD), National Eye Institute (R01EY022746, ESB), Fundację Leducq (Multidyscyplinarny Program Wyjaśniający Rolę Morfogenetycznej Sygnalizacji Białkowej Kości w zakresie patogenezy płuc i układowych chorób naczyniowych, PBY, KDB i DBB), Narodowy Instytut Zapalenia Stawów oraz Chorób Układu Mięśniowo-Szkieletowego i Skóry (R01AR057374, PBY), Narodowy Instytut Cukrzycy i Chorób Układu Pokarmowe....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 15 ml probówka stożkowa | Falcon | 352096 | |
| Igła 30 G | BD | 305106 | |
| Alfa przeciwciało aktynowe do mięśni gładkich | Sigma | SAB2500963 | |
| Szkiełko komorowe | Nunc Lab-Tek | 154461 | |
| Kolagenaza, Typ 2 | Worthington | LS004176 | |
| Deksametazon | Sigma | D4902 | |
| Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle Technologie Średniego | Życia | 11965-084 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco, bez wapnia | Gibco | 14190-144 | |
| Elastaza | Sigma | E1250 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Gibco | 16000-044 | |
| Kleszcze drobnoziarniste | Roboz | RS-4972 | |
| Kleszcze, ząbkowane na całej krzywej | Roboz | RS-5138 | |
| Formalina (10%) | Mikroskopia elektronowa Nauki | 15740 | |
| Zrównoważony roztwór soli Hanka | Gibco | 14025-092 | |
| Ludzkie komórki mięśni gładkich tętnic wieńcowych | PromoCell | C-12511 | |
| Strzykawka insulinowa z igłą | Terumo | SS30M2913 | |
| Kwas L-askorbinowy | Sigma | A-7506 | |
| Nożyczki sprężynowe do mikropreparacji (13 mm) | Roboz | RS-5676 | |
| Nożyczki sprężynowe do mikropreparacji (3 mm) | Roboz | RS-5610 | |
| NIR, katepsyna (ProSense-750EX) | Perkin Elmer | NEV10001EX | |
| NIR, osteogenne (OsteoSense-680EX) | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
| Normalna sól | fizjologiczna Hospira | 0409-4888-10 | |
| Jądrowo szybki czerwony | Sigma-Aldrich | N3020 | |
| System obrazowania Odyssey | Li-Cor | Odyssey 3.0 | |
| Penicylina/Streptomycyna | Corning | 30-001-CI | |
| Azotan srebra (5%) | Ricca Chemical Company | 6828-16 | |
| Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| Tiosiarczan sodu | Sigma | S-1648 | |
| ß-glicerofosforan sól disodowa hydrat Sigma | G9422 | ||
| Kolba do hodowli tkankowych, 25 cm2 | Falcon | 353108 | |
| Posiew tkankowy płytka (35 mm x 10 mm) | Falcon | 353001 | |
| Płytka do hodowli tkankowej, sześciodołkowa | Falcon | 353046 | |
| Trypsin | Corning | 25-053-CI | |
| Rurkowy uchwyt na gryzonie | Kent Scientific RSTR551 | ||
| Próżniowy system filtracji | Millipore | SCGP00525 |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie