Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowana analiza behawioralna dużych populacji C. elegans przy użyciu platformy śledzenia o szerokim polu widzenia

DOI:

10.3791/58643

⸱

28 listopada 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Misfolding Diseases, Department of Chemistry, University of Cambridge, 2European Research Institute for the Biology of Aging, University Medical Centre Groningen

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokoły korzystania z platformy śledzenia nicieni o szerokim polu widzenia (WF-NTP), która umożliwia wysokoprzepustową charakterystykę fenotypową dużych populacji Caenorhabditis elegans. Protokoły te mogą być wykorzystywane do charakteryzowania subtelnych zmian behawioralnych w zmutowanych szczepach lub w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne w wysoce skalowalny sposób.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans to dobrze znany model zwierzęcy w badaniach biomedycznych, szeroko stosowany w genomice funkcjonalnej i badaniach starzenia. Aby ocenić zdrowie i kondycję badanych zwierząt, zazwyczaj opiera się na odczytach ruchliwości, takich jak pomiar liczby zgięć ciała lub prędkości ruchu. Pomiary te zwykle obejmują ręczne liczenie, co utrudnia uzyskanie dobrej istotności statystycznej, ponieważ ograniczenia czasowe i pracochłonne często ograniczają liczbę zwierząt w każdym eksperymencie do 25 lub mniej. Ponieważ wysoka moc statystyczna jest niezbędna do uzyskania powtarzalnych wyników i ograniczenia wyników fałszywie dodatnich i ujemnych w przypadku badania słabych efektów fenotypowych, ostatnio podjęto wysiłki w celu opracowania zautomatyzowanych protokołów skoncentrowanych na zwiększeniu czułości wykrywania ruchliwości i wieloparametrycznego profilowania behawioralnego. W celu rozszerzenia granicy wykrywalności do poziomu potrzebnego do uchwycenia małych zmian fenotypowych, które często są kluczowe w badaniach genetycznych i odkrywaniu leków, opisujemy tutaj rozwój technologiczny, który umożliwia badanie do 5000 pojedynczych zwierząt jednocześnie, zwiększając moc statystyczną pomiarów o około 1000-krotnie w porównaniu z testami ręcznymi i około 100-krotnie w porównaniu z innymi dostępnymi metodami automatycznymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Około pół wieku temu, Sydney Brenner wprowadził Caenorhabditis elegans (C. elegans) jako modelowy system do badań nad rozwojem i neurobiologią, ponieważ ten mały (1 mm długości), przezroczysty robak nicieni jest łatwy do genetycznego manipulowania i utrzymywania w laboratorium1. Obecnie C. elegans jest używany do badania szerokiej gamy procesów biologicznych, w tym apoptozy, sygnalizacji komórkowej, natury cyklu komórkowego, regulacji genów, metabolizmu i starzenia się2. Co więcej, złożoność komórkowa i tkankowa, wzorce ekspresji białek i zachowanie szlaków chorobowych między C. elegans a organizmami wyższymi (80% genów robaków ma ludzki ortolog), w połączeniu z prostotą i opłacalnością uprawy, sprawiają, że jest to skuteczny organizm modelowy in vivo, podatny na wysokoprzepustowość genetyczną3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 i drug14,15,16 pokazów. Z tych wszystkich powodów C. elegans został wykorzystany do scharakteryzowania normalnych i związanych z chorobą szlaków molekularnych; Na przykład w dziedzinie neurodegeneracji umożliwiło to zbadanie wpływu starzenia się na agregację białek3,4,7,15,17,18, oraz charakterystyka promotorów i inhibitorów agregacji białek3,4,5,6,7,14,18.

Ogólna sprawność robaków, która jest ważnym parametrem behawioralnym do zdefiniowania w tego typu badaniu, może być mierzona ręcznie na różne sposoby, np. poprzez liczenie liczby zgięć ciała na minutę (BPM)4,6,19, lub mierząc prędkość ruchu20,21,22, a także poprzez pomiar średniej długości życia i wskaźników paraliżu. Chociaż ręczne pomiary zgięć ciała i prędkości ruchu doprowadziły do wielu ważnych spostrzeżeń na temat różnych ścieżek i mechanizmów molekularnych3,4,14,19,20,23, testy ręczne są obecnie niskoprzepustowe, wysoce pracochłonne i czasochłonne, a jednocześnie podatne na błędy i stronniczość człowieka. Kwestie te stanowią poważne wyzwanie w gromadzeniu danych o wystarczającej mocy statystycznej, aby rozróżnić subtelne zmiany w zachowaniu. To ograniczenie jest szczególnie istotne w przypadku badań przesiewowych leków, ponieważ leczenie potencjalnymi cząsteczkami leku często prowadzi do niewielkich zmian fenotypowych24, co wymaga badania dużej liczby zwierząt w celu uzyskania powtarzalnych wyników. Aby zilustrować tę kwestię, ostatnie badania wykazały, że wysoka moc wykrywania (POD) jest niezbędna do zdefiniowania z pewnością wszelkich znaczących zmian w zachowaniu i ograniczenia wyników fałszywie dodatnich25. Zaowocowało to silną motywacją w społeczności C. elegans do zastąpienia ręcznego liczenia powtarzalnymi, zautomatyzowanymi, oszczędzającymi czas i koszty pomiarami. Aby sprostać temu zapotrzebowaniu, kilka laboratoriów opracowało ostatnio metody pomiarów o wysokiej czułości i dokładnego śledzenia większej liczby robaków22,26,27,28,29,30,31,32,33.

Aby jeszcze bardziej rozszerzyć proces automatyzacji na duże kohorty zwierząt potrzebnych do statystycznie istotnych pomiarów, niedawno opracowaliśmy platformę śledzenia nicieni o szerokim polu widzenia (WF-NTP)15,34,35,36, co umożliwia jednoczesne badanie wielu odczytów fenotypowych w bardzo dużych populacjach robaków, co jest kluczowym czynnikiem w statystycznie istotnym wykrywaniu fenotypów25. WF-NTP nie tylko może obecnie monitorować do 5000 zwierząt równolegle, ale odczyty fenotypowe obejmują również wiele parametrów, w tym szybkość i amplitudę zgięć ciała, prędkość ruchu, część populacji, która jest sparaliżowana i wielkość zwierząt. W związku z tym możliwe jest równoległe przesiewanie tysięcy robaków i łączenie różnych odczytów w mapę behawioralną w celu stworzenia wielowymiarowego odcisku palca36. Powiązane oprogramowanie typu open source jest napisane w języku Python, który jest również wymagany do jego obsługi i jest w pełni konfigurowalne. Dostępny jest również graficzny interfejs użytkownika (GUI), który umożliwia użytkownikom przyjęcie tej technologii.

Tutaj prezentujemy szereg protokołów, które ilustrują niektóre z potencjalnych zastosowań WF-NTP. W szczególności omawiamy podawanie związków, od małych cząsteczek po terapie białkowe, i opisujemy, jak bezpośrednio badać ich działanie na dużych populacjach robaków, skutecznie eliminując w ten sposób potrzebę pobierania próbek od małych subpopulacji. Wykorzystanie WF-NTP do tego celu przyniosło już znaczące korzyści w procedurach mających na celu projektowanie programów odkrywania leków na chorobę Alzheimera (AD)15,34,35 i chorobie Parkinsona (PD)18 wykorzystując dane in vivo do oceny kandydatów terapeutycznych35,37.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie materiałów do protokołów C. elegans

  1. Aby przygotować 10 x roztwór buforowy M9, dodaj 30 g jednozasadowego fosforanu potasu, 60 g dwuzasadowego fosforanu sodu i 50 g chlorku sodu do butelki o pojemności 1 l.
    1. Dodać 1 l oczyszczonej wody i sterylizować w autoklawie w temperaturze ok. 121 °C przez 15 min.
    2. Rozcieńczyć 10 razy w oczyszczonej wodzie i sterylizować w autoklawie w temperaturze ok. 121 °C przez 15 min.
    3. Po schłodzeniu dodać 1 ml roztworu 1 M siarczanu magnezu.
      UWAGA: W poniższych krokach należy używać tylko 1x M9 (M9) do obsługi ślimaków.
  2. Aby przygotować pożywkę hodowlaną nicieni (Rich-NGM), wymieszaj 2,7 g chlorku sodu, 15,75 g agaru, 5,75 g kazeiny, 900 ml oczyszczonej wody i autoklaw w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
    1. Przenieść pożywkę Rich-NGM do pieca grzewczego (ok. 70 °C), jeśli nie zostanie natychmiast użyta; pożywkę Rich-NGM można utrzymywać w stanie stopionym w temperaturze ok. 70 °C przez maksymalnie 12 godzin, zanim stanie się bezużyteczna.
    2. Do mieszaniny Rich-NGM dodać 900 μl roztworu 1 M chlorku wapnia, 900 μl roztworu 1 M siarczanu magnezu i 900 μl roztworu 5 mg/ml cholesterolu w absolutnym etanolu.
      nuta: Cholesterol nie wymaga autoklawowania przed użyciem.
    3. Aby przygotować płytki doświadczalne, które utrzymują populację synchroniczną pod względem wieku, dodaj 92 μl 5-fluoro-2'-deoksyurydyny (FUDR) w 812 μM do 900 ml Rich-NGM.
      nuta: FUDR jest zarówno toksyczny, jak i rakotwórczy, dlatego oprócz fartuchów laboratoryjnych i okularów ochronnych konieczne jest noszenie rękawic nitrylowych. Nie pozwól, aby odpady dostały się do ogólnego strumienia odpadów i zostały usunięte przez spalenie z.
    4. Wlej 20 ml autoklawizowanego Rich-NGM do sterylnej szalki Petriego o średnicy 9 cm, aby uzyskać płytkę wzrostową (płytkę Rich-NGM). Wlać 15 ml autoklawizowanego Rich-NGM do sterylnej szalki Petriego o średnicy 9 cm, aby uzyskać płytkę do pomiaru ruchliwości (płytkę Mot ). Wlej 20 ml Rich-NGM z FUDR do sterylnej szalki Petriego o średnicy 9 cm, aby uzyskać płytkę FUDR.
      nuta: Mała objętość agaru na płytce Mot ułatwia ustawianie ostrości przez kamerę i śledzenie robaków (patrz krok 3.2.5).
  3. Przygotować szczep OP50 Escherichia coli, autoklawizując 1 l bulionu LB w temperaturze 121 °C przez 15 minut, a po schłodzeniu zaszczepić kulturą starterową.
    1. Pozostawić kulturę bakteryjną do wzrostu przez noc w temperaturze 37 °C i wysterylizować probówkę, która ma być użyta do odwirowania.
    2. Przenieść bakterie do sterylnych probówek i odwirować przy 4 600 x g przez 15 minut.
    3. Zdekantować supernatant i za pomocą sterylnej wody zawiesić w 10% pierwotnej objętości, aby uzyskać 10-krotny (10-krotny koncentrat) zapas OP50.
    4. Rozcieńczyć 15 ml 10x OP50 do 150 mL, aby wytworzyć 1x OP50, używając sterylnej wody, przed użyciem do wysiewu płytek Rich-NGM. Użyj pozostałego 10x roztworu do wysiewu płytek FUDR.
      nuta: Płytki Mot pozostaną niezasiewane i będą używane tylko na etapie pozyskiwania obrazu.
  4. Aby wysiać płytki z bakteriami, należy posegregować płytki Rich-NGM i FUDR.
    1. W sterylnych warunkach dodaj 350 μL 1x OP50 do płytek Rich-NGM i równomiernie rozprowadź.
      nuta: Nie rozprzestrzeniaj się na krawędź talerza, ponieważ robaki będą pełzać po bokach talerza i umierać.
    2. W sterylnych warunkach dodać 350 μL 10x OP50 do płytek FUDR i równomiernie rozprowadzić.
    3. Pozostawić płytki do wyschnięcia i inkubować w temperaturze 20 °C przez 2 dni przed użyciem.

2. Przygotowanie C. elegans do użycia z WF-NTP

  1. Utrzymuj C. elegans na płytkach Rich-NGM lub przenosząc niewielką ilość robaków zawierających agar twarzą w dół na świeżą warstwę bakteryjną. Utrzymuj szczepy C. elegans w ten sposób przed rozpoczęciem protokołów eksperymentalnych.
  2. Stosując technikę przenoszenia (patrz krok 2.1), wysiać 20 płytek każdego szczepu za pomocą dobrze odżywionych, mieszanych robaków i pozostawić je do wzrostu przez 2 dni w temperaturze 20 °C.
  3. Zmyć 5 płytek zawierających robaki za pomocą 15 ml M9 i zebrać w jednej probówce o pojemności 15 ml. Powtórz te czynności dla wszystkich 20 płytek każdego szczepu.
  4. Odwirować robaki przy 2 000 x g przez 2 minuty, usunąć supernatant i zawiesić w 2 ml roztworu M9.
  5. Przygotować 10 ml roztworu wybielającego, mieszając 13% podchlorynu sodu i 4 M wodorotlenku sodu w stosunku 3:2 obj./obj.
    nuta: To rozwiązanie nie wymaga autoklawowania. Zarówno składniki, jak i powstały roztwór są i należy obchodzić się z nimi ostrożnie w rękawicach nitrylowych. Wodorotlenek sodu jest lekko dla szkła i powinien być przechowywany w plastikowych pojemnikach.
  6. Dodać 1 ml roztworu wybielającego do każdej probówki wirówkowej i energicznie wstrząsać przez około 3,5 minuty lub do całkowitego rozpuszczenia naskórka.
  7. W sterylnych warunkach rozcieńczyć próbki do 15 ml M9 i odwirować przy 2 000 x g przez 2 min. Usunąć supernatant i zawiesić w 15 ml roztworu M9.
  8. Powtórz krok 2.7 6 razy, aż pozostaną tylko jaja robaków, a roztwór nie będzie miał już zapachu chloru.
  9. Odwirować próbki o masie 2 000 x g przez 2 minuty, usunąć supernatant i zawiesić w 2 ml roztworu M9.
  10. W sterylnych warunkach za pomocą sterylnej szklanej pipety przenieść 2 ml jaj zawierających M9 do każdego dołka 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i inkubować w temperaturze 20 °C przez co najmniej 16 godzin
    nuta: Używaj oddzielnych płytek dla każdego szczepu, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Etap przenoszenia z probówek wirówkowych do wielu dołków pomaga uniknąć uduszenia się robaków.
  11. Przenieść robaki wyklute w nocy z płytek 12-dołkowych do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. Weź 3 krople po 5 μl roztworu robaka i policz liczbę robaków obecnych w pierwszym stadium larwalnym (L1).
  12. Oblicz liczbę robaków na μl roztworu.
  13. Wysiewać robaki L1 na płytki Rich-NGM w ilości 3 000 robaków na płytkę i pozostawić im wzrost przez 2 dni w temperaturze 20 °C, aż osiągną ostatnie stadium larwalne (L4).

3. Ogólny protokół WF-NTP

  1. Dodaj 2,2 ml każdego związku leczniczego o odpowiednim stężeniu (takim jak 25 lub 10 μM dla leków takich jak skwalanamina18 i bexarotene15, odpowiednio) do 6 płytek FUDR i pozostaw do wyschnięcia w sterylnych warunkach dla każdego pożądanego szczepu robaka.
    nuta: Etap ten powtarza się dla każdego badanego związku, dla każdego stężenia i każdego użytego rozpuszczalnika.
    1. Zmyć robaki z 5 płytek Rich-NGM przygotowanych w kroku 2.13 przy użyciu 15 ml buforu M9 i przenieść robaki do probówki wirówkowej.
    2. Wirować przy 2 000 x g przez 2 minuty, usunąć supernatant i zawiesić w 3 ml M9. Pobrać 3 krople po 5 μl roztworu M9 zawierającego robaki i policzyć liczbę robaków obecnych w ostatnim stadium larwalnym L4.
    3. Oblicz liczbę robaków na μl buforu M9.
  2. Wysiewać 700 larw L4 na 6 suchych płytek FUDR zawierających dany związek, powtórzyć dla każdego stężenia każdego związku i pozostawić do wyschnięcia w sterylnych warunkach.
    1. Inkubuj robaki w temperaturze 24 °C od L4 dla tych szczepów, w których paraliż robaków jest wywoływany tylko przez podniesienie temperatury, takich jak szczep AD38. Policz dzień następujący po stadium larwalnym L4 jako D0 wieku dorosłego.
  3. Włącz światła sceniczne dla trackera.
    1. Wyczyść szklaną scenę 70% etanolem i upewnij się, że nie pozostały żadne widoczne pozostałości, a następnie zdejmij pokrywę obiektywu. Wyczyść soczewkę obrazową za pomocą miotełki do kurzu. Upewnij się, że aparat jest prawidłowo podłączony i zainstalowany, a następnie rozpocznij nagrywanie za pomocą oprogramowania do przechwytywania obrazu.
    2. Dostosuj ustawienia kamery, aby nagrywać 20 klatek/s, z ustawieniem parametrów nagrywania mono 16; nagrywaj 1,200 klatek, zapisując w formacie MJPEG ze współczynnikiem kompresji 95%. Użyj pustej szalki Petriego o średnicy 9 cm, aby upewnić się, że stolik jest ustawiony na odpowiednią wysokość i wyreguluj go w razie potrzeby.
      nuta: Upewnij się, że krawędzie płytki są widoczne na nagraniu, ponieważ pozwoli to na poprawne działanie algorytmu "keep-dead" (Rysunek 1a).
    3. W sterylnych warunkach należy pobrać 2 płytki przygotowane wcześniej w kroku 3.2 w tych samych warunkach i 1 płytkę przesiewową Mot przygotowaną w kroku 1.2.4. Dodać 3 ml roztworu M9 do płytki Mot . Użyć innych 2 ml M9, aby umyć 1/3 powierzchni 2 płytek przygotowanych w kroku 3.2 na płytce Mot .
    4. Umieść płytkę Mot zawierającą około 5 ml roztworu M9 i około 600 robaków na stoliku śledzącym. Ustaw ostrość kamery za pomocą pojedynczego robaka i rozpocznij nagrywanie.
    5. Po zakończeniu zapisu wyrzuć płytkę Mot z robakami; oznacz płytki FUDR jako użyte raz i włóż je z powrotem do inkubatora.
    6. Powtórzyć kroki 3.3.3-3.3.5 dla każdego warunku doświadczalnego.
    7. Powtórz kroki od 3.3.3 do 3.3.6 dla każdego punktu czasowego w dorosłym życiu.
      UWAGA: Zabiegi przesiewowe można przeprowadzić w dowolnym momencie dorosłego życia robaka (ok. 3 tygodnie). Protokoły te ułatwiają badania przesiewowe do 9 punktów czasowych; Autorzy zalecają badania przesiewowe co 2 dni, począwszy od 1. dnia dorosłości.

4. Optymalizacja dla badań nad dawką dyskretną

  1. Przygotuj robaki, powtarzając kroki od 3.1.1 do 3.1.3.
    1. Wysiew ok. 1000 robaków L4 na 5 płytek FUDR. Inkubować płytki w temperaturze 24 °C do D3 wieku dorosłego, do eksperymentów z udziałem robaków AD38.
  2. Za pomocą sterylnej szklanej pipety przenieść przygotowane w sterylnych warunkach robaki z płytki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, odwirować przy 2 000 x g przez 2 minuty i usunąć sklarowany nad osadem.
    1. Zawiesić roztwór robaków w 1 ml buforu M9. Przenieść robaki do probówki do mikrowirówki, odwirować przy 300 x g przez 2 minuty i usunąć supernatant.
  3. W przypadku transdukcji białek dodać 40 μl odczynnika do transfekcji i 20 μl białka natywnego o pożądanym stężeniu (zwykle 40 μM) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    1. W sterylnych warunkach za pomocą sterylnej szklanej pipety przenieść robaki z kroku 4.2.1 do probówki mikrowirówki zawierającej kapsułkowane białko, aby uzyskać całkowitą objętość 1060 μl. Umieścić probówki poziomo i wstrząsać z prędkością 60 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 24 °C przez 8 godzin.
  4. W sterylnych warunkach dodać 4 ml roztworu M9 do płytki Mot i przenieść jedną probówkę mikrowirówki z robakami i lekiem na płytkę Mot.
    1. Skonfiguruj tracker, powtarzając kroki od 3.3 do 3.3.2.
    2. W sterylnych warunkach dodać 4 ml roztworu M9 do płytki Mot i przenieść jedną probówkę mikrowirówki z robakami i lekiem na płytkę Mot.
    3. Umieść płytkę Mot na stoliku śledzącym, ustaw ostrość kamerę na pojedynczym robaku i rozpocznij nagrywanie. Po zakończeniu oznacz blachę Mot i odłóż na bok.
    4. Powtórzyć kroki 4.4.1 i 4.4.3 dla wszystkich próbek.
    5. Za pomocą szklanej pipety przenieś robaki w sterylnych warunkach z płytki Mot do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwiruj przy 2 000 x g przez 2 minuty. Usuń supernatant, przenieś osad na płytkę FUDR i pozostaw do wyschnięcia w sterylnych warunkach.
    6. Powtórzyć krok 4.4.5 dla wszystkich próbek.
  5. Inkubować robaki w temperaturze 24 °C do D6 wieku dorosłego.
    nuta: Możliwe są również wielokrotne inkubacje przeciwciał.
  6. Dodać 3 ml buforu M9 do płytki Mot i użyć 2 ml roztworu M9 do wypłukania wszystkich robaków z płytki FUDR na płytkę Mot .
    1. Skonfiguruj tracker, powtarzając kroki od 3.3 do 3.3.2.
    2. Umieść płytkę Mot na stoliku śledzącym, ustaw ostrość kamerę w razie potrzeby i rozpocznij nagrywanie. Po zakończeniu nagrywania wyrzuć płytkę Mot lub odzyskaj ją w celu dalszego badania, jeśli chcesz.
    3. Powtórzyć kroki od 4.6 do 4.6.2 dla wszystkich próbek.

5. Analiza danych wideo

  1. Po pobraniu filmów wybierz odpowiednie parametry w graficznym interfejsie użytkownika oprogramowania (Rysunek 2) do analizy danych.
    1. Załaduj jeden lub wiele filmów za pomocą funkcji przeglądania. Wybierz wyjściowy folder docelowy. Upewnij się, że do analizy 30 s używanych jest od 600 do 1 200 klatek.
      UWAGA: Można analizować dowolny zakres klatek.
    2. Wstaw współczynnik konwersji pikseli na mm, który będzie wynosił 0,029 dla obrazowania 9-centymetrowej szalki Petriego w pełnej rozdzielczości. Wybierz algorytm śledzenia 'keep dead'.
      nuta: Współczynnik konwersji będzie zależał od użytego pola widzenia. Algorytm transformacji Z może być również używany jako alternatywa.
    3. Wypełnij parametry w sekcji Lokalizacja (Rysunek 2): Z użyj obrazów = 100, Dopełnienie Z = 3, Standardowe piksele = 54, Próg = 9, Otwarcie = 1, Zamknięcie = 2. Dostosuj parametry filtrowania do Minimalny rozmiar = 20, Maksymalny rozmiar = 180, Robak = 0,94.
    4. Dostosuj parametry trajektorii formowania: Maksymalny ruch na odległość = 10; Minimalna długość = 150, pamięć = 10.
    5. Ustaw parametry zagięć i prędkości. Użyj 1.8 dla progu zgięcia, 0 dla minimalnych zgięć i 150 dla ramek, aby oszacować prędkość.
    6. Dostrajanie statystyk martwych robaków. Użyj 5.0 dla maksymalnej liczby uderzeń na minutę i 1.0 dla maksymalnej prędkości.
    7. Wybierz folder wyjściowy. Ustaw liczbę ramek wyjściowych na 50. Ustaw rozmiar czcionki na 10.
      nuta: Opcjonalnie wybierz co najmniej jeden obszar zainteresowania (ROI).
  2. Przetestuj parametry przy użyciu funkcji Example. Wyświetl przykładowe obrazy i sprawdź, czy robaki są widoczne w 8 krokach progowania (Rysunek 1).
  3. Użyj funkcji Rozpocznij zadanie.
  4. Analizuj pliki wyników tekstowych, łącząc poszczególne wyniki dla całego zestawu danych. Użyj funkcji Eksportuj do tsv w graficznym interfejsie użytkownika.
    nuta: Opcjonalnie poszczególne wskaźniki robaków mogą być również brane pod uwagę w badaniach populacyjnych.
    1. Analizuj dane za pomocą pakietu oprogramowania statystycznego.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Łatwość obsługi, analiza wieloparametryczna i wysoka przepustowość zilustrowanego protokołu WF-NTP (Rysunki 1 i 2) umożliwiają bardzo dokładne określenie bardzo małych zmian w zachowaniu robaka. Platforma obrazowania oparta jest na specjalnie wykonanej optomechanice i może być montowana za pomocą monochromatycznego aparatu 6 MP w połączeniu z obiektywem o ogniskowej 16 mm o wysokiej rozdzielczości dla czujnika 1'', oświetlonego białym podświetleniem 8'' na 8'' (więcej szczegółów w Tabeli materiałów, a także reference36). Powiązane oprogramowanie WF-NTP jest napisane w języku Python i zostało opracowane do działania na platformach Windows. Działa na niestandardowo zmontowanym komputerze z ośmiordzeniowym procesorem 3,00 GHz i 64 GB pamięci o dostępie swobodnym (RAM). Oprogramowanie zostało również zaprojektowane tak, aby zrównoleglić pracę i analizę wideo w oparciu o pamięć RAM i procesor komputera; Oznacza to, że maszyna o mniejszej mocy obliczeniowej spowoduje, że mniej filmów będzie uruchamianych równolegle. Konfiguracja, z której obecnie korzystamy, jest zoptymalizowana do uruchamiania do ok. 16 filmów równolegle i może zakończyć analizę ok. 100 filmów w ciągu jednej nocy. Co więcej, wysoki poziom szczegółowości personalizacji zapewniony w graficznym interfejsie użytkownika WF-NTP pozwala na doskonałą kontrolę jakości analizy obrazowej. Graficzny interfejs użytkownika może być używany do bezpośredniego przesyłania dużych zestawów danych równolegle lub pojedynczych filmów; Można również wybrać określone klatki do szczegółowej analizy cząstkowej wraz ze współczynnikiem konwersji piksela, który można wykorzystać do oszacowania wskaźników behawioralnych. Jeden z dwóch różnych algorytmów śledzenia (keep dead i Z-transform) można wybrać w zależności od tego, czy użytkownik chciałby uwzględnić w analizie sparaliżowane zwierzęta, czy nie. Parametr progowania można dostroić odpowiednio do jakości wideo i eksperymentu. Parametry otwierania i zamykania pozwalają użytkownikowi usunąć szum i dalej zaimplementować funkcję progowania. Algorytm szkieletyzacji oferuje alternatywną metodę analizy. Odcięcia rozmiaru obiektu (filtrowanie) zapewniają dodatkowy filtr dla szumu tła, a parametr podobny do robaka pozwala użytkownikowi brać pod uwagę tylko robaki obiekty o kształcie elipsoidalnym, odróżniając się w ten sposób od innych obiektów, które mogą mieć ten sam rozmiar piksela co robaki. Po tych operacjach progowania, wszystkie wynikowe oznaczone regiony mogą zostać zidentyfikowane jako pojedyncze robaki, a pozycje tych regionów są następnie przechowywane dla każdej klatki w celu późniejszej analizy i śledzenia. Mimośród każdego śledzonego robaka jest używany do oszacowania wskaźników robaka, takich jak zakres wygięcia ślimaka (BPM) w funkcji czasu. Użytkownicy mogą również wybrać liczbę klatek używanych do przechowywania robaka w pamięci oprogramowania po kolizjach, a liczba pikseli, które robak może przemieszczać się między klatkami, może być również dostrojona w celu odróżnienia zwierząt od hałasu. Opcja minimalnej długości ścieżki pozwala użytkownikowi na odrzucenie robaków, które były śledzone tylko przez kilka klatek. Inne kluczowe parametry, takie jak zgięcia i prędkość, pozwalają użytkownikowi wybrać stopień zgięcia niezbędny do zaliczenia jako zgięcie ciała oraz liczbę klatek uważanych za potrzebne do oszacowania prędkości zwierząt. Parametry odcięcia mogą być dodatkowo dostrojone pod kątem włączenia sparaliżowanych zwierząt. Dane wyjściowe są automatycznie wyświetlane w plikach wynikowych. Wartości te są uważane za górne granice oceny frakcji zwierząt sparaliżowanych. Użytkownik może również wybrać jeden lub więcej obszarów zainteresowania. Ta funkcja jest szczególnie przydatna do analizowania subpopulacji robaków, a dane wyjściowe są automatycznie sortowane w plikach wyników. Opcja wyjściowa pozwala użytkownikowi wybrać folder wyjściowy i liczbę ramek śledzenia, które zostaną dla niego wyprodukowane. Do dalszej analizy danych można również wykorzystać różne zestawy narzędzi, takie jak narzędzie do kreślenia ścieżki, które pokazuje poszczególne ślady robaków oraz narzędzie do pobierania odcisków palców, które umożliwia użytkownikowi tworzenie map odcisków palców.

Ta metodologia umożliwia przyjęcie nowych podejść, nie tylko do badań biologicznych C. elegans, ale także do celów badań farmakologicznych i medycznych, takich jak wysokoprzepustowe badania przesiewowe modyfikacji genetycznych i leczenia farmakologicznego. Zilustrowaliśmy ten potencjał, opisując charakterystykę fenotypów dla dużych badań populacyjnych (N > 1000) różnych modeli robaków choroby neurodegeneracyjnej (otępienie czołowo-skroniowe (FTD)39, choroba Parkinsona (PD)7, choroba Alzheimera (AD)16,40, oraz stwardnienie zanikowe boczne (ALS)19 (Rysunek 3a) oraz scharakteryzowanie efektów działania potencjalnych cząsteczek terapeutycznych za pomocą modeli robaków PD18 i AD15,12 (Rysunek 3b). Dwie małe cząsteczki, skwaloamina18 i bexarotene15, podawano w stężeniach do 25 μM odpowiednio robakom PD (Rysunek 3b) i 10 μM do ADxref"38 (Rysunek 3b). Oba związki wykazały wyraźne działanie zależne od dawki w badanym zakresie stężeń. Wykazaliśmy, że ta wysoka dokładność pomiarów jest osiągana poprzez zwiększenie liczby robaków, które mogą być analizowane w porównaniu z tradycyjnymi metodami (Rysunek 3c). Zilustrowaliśmy znaczenie wielkości próby (Rysunek 3c) w molekularnych badaniach przesiewowych, a także w charakterystyce zmutowanych szczepów. Wzrost temperatury od 20 °C prowadzi do tego, że około połowa robaków AD zostaje sparaliżowana po 3 dniach dorosłości. Populacje robaków badano w różnych warunkach, np. gdy robaki z nadmierną ekspresją 42-resztowej formy peptydu β amyloidu (Aβ1-42) (robaki AD) były narażone na subtelne wahania temperatury (Rysunek 3c, lewy panel), gdy Aβ1-42 był wyrażany we wszystkich neuronach (Rysunek 3c, panel centralny) lub gdy robaki AD były wystawione na działanie beksarotenu (Rysunek 3c, prawy panel). Robaki analizowano również na podstawie małych ROI losowo wybranych z pełnego pola widzenia filmów uzyskanych za pomocą WF-NTP (N < 50, żółte paski), podkreślając porównanie ruchliwości tych robaków ze średnią ruchliwością całej populacji robaków (N < 1000). We wszystkich panelach różnica mierzona w całej populacji robaków wydaje się być statystycznie istotna i wynosi p ≤ 0,0001 (****).

Opisany tutaj protokół WF-NTP pozwala również na jednoczesne rejestrowanie wielu parametrów (Rysunek 1b) w celu wspierania, w optymalny sposób, zarówno wewnętrznej walidacji, jak i opracowania kompleksowego odcisku palca szerokiego zakresu warunków w odniesieniu do próbki kontrolnej, co pozwala na znaczące porównania między wieloma badaniami. To wieloparametryczne podejście obejmuje jednoczesną analizę wielu cech behawioralnych, w tym częstotliwości zginania, prędkości, szybkości paraliżu, rozmiaru, amplitudy zgięcia i przemieszczenia zgięcia36. Pozwala to na bardzo szczegółowe monitorowanie tysięcy zwierząt z bardzo wysoką czułością i istotnością statystyczną, a także stwarza możliwości badań na dużych populacjach. Ta procedura śledzenia ma również tę zaletę, że umożliwia przeprowadzanie badań paraliżu równolegle z innymi pomiarami behawioralnymi, co jest kluczową cechą molekularnych badań przesiewowych.

Wyniki, które do tej pory osiągnięto w AD15,34,35 i PD18 odkrywanie leków pokazują znaczenie pozyskiwania danych o szerokim polu widzenia dla znacznego zwiększenia liczby zwierząt, które można monitorować w jednym eksperymencie, znacznie zmniejszając błędy eksperymentalne i znacznie poprawiając statystyczną ważność badań. Opierając się na tych wynikach, przewidujemy, że protokół WF-NTP, który udostępniliśmy dla community36, znacznie rozszerzy zastosowanie C. elegans.

figure-results-1
Rysunek 1: Etapy analizy WF-NTP i przykład odcisku palca. a) 1. Oryginalny film. 2. Obraz tła. 3. Obraz odjęty od tła. 4-6. Stopnie progowe. 7-9. Pojedyncze etykietowanie robaków. (b) Wiele fenotypów jest zgłaszanych za pomocą odcisku palca dla robaków typu dzikiego i modeli robaków PD i AD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Graficzny interfejs użytkownika (GUI) WF-NTP. W graficznym interfejsie użytkownika można wybrać konkretne filmy i wybrane klatki do analizy, a także wprowadzić współczynnik konwersji pikseli, po czym analiza jest przeprowadzana za pomocą jednego z dwóch podanych algorytmów śledzenia. Możliwe jest wybranie stopnia zgięcia niezbędnego do zaliczenia jako zgięcie ciała, a także liczby klatek potrzebnych do oszacowania prędkości zwierząt. Zgięcia ciała i progi prędkości mogą decydować o statystykach sparaliżowanych robaków. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Przykłady aplikacji obsługiwanych przez metodę WF-NTP. (a) Zastosowanie WF-NTP w dużych badaniach populacyjnych (N > 1,000) pomiarów BPM dla modeli C. elegans szeregu chorób neurodegeneracyjnych, w tym FTD, PD, AD i ALS. (b) Zastosowanie WF-NTP w odkrywaniu leków. (c) Znaczenie badań populacyjnych w zakresie wrażliwości na temperaturę, skuteczności leków i charakterystyki zmutowanych szczepów. Fenotypy subpopulacji N < 50 (żółte paski) są porównywane z fenotypami całej populacji robaków (N < 1,000). Słupki błędów wskazują błąd standardowy średniej (SEM). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ze względu na szybki rozwój technik w dziedzinie nauk optycznych, możliwe jest obecnie zaspokojenie zapotrzebowania na zautomatyzowane metody w badaniach C. elegans w zasadniczo nowy sposób. W rezultacie, w ciągu ostatnich kilku lat zaprojektowano i udostępniono szereg cyfrowych platform śledzących 20,41,42,43,44,45,46 w celu zastąpienia ręcznego liczenia parametrów takich jak prędkość ruchu, częstotliwość zginania, szybkość paraliżu, a także bardziej złożonych form zachowań, takich jak skręty omega, i pomiary żywotności. Najnowsze zautomatyzowane platformy znacznie poprawiły odtwarzalność i czułość badań nad C. elegans 41 i dostarczyły wysokiej jakości danych na temat małych kohort, a nawet pojedynczych zwierząt. Zdecydowaliśmy się rozszerzyć automatyzację analizy zachowań robaków, aby umożliwić również równoległą ocenę fenotypów kohort tysięcy zwierząt. Główną zaletą podejścia polegającego na badaniu kohort robaków jest to, że pozwala ono na uwzględnienie wysokiej wewnętrznej zmienności zachowania robaków24 oraz faktu, że badania nad leczeniem farmakologicznym często prowadzą do subtelnych zmian fenotypowych, które są trudne do wykrycia z wystarczającą istotnością statystyczną przy użyciu małej grupy zwierząt. Wysoka moc wykrywania (POD) jest rzeczywiście niezbędna, aby z pewnością wykryć wszelkie znaczące zmiany w zachowaniu i ograniczyć wyniki fałszywie dodatnie25.

W tym miejscu opisaliśmy szereg protokołów opartych na niedawno zgłoszonej metodzie automatycznego badania przesiewowego dla C. elegans, platformy śledzenia nicieni o szerokim polu widzenia (WF-NTP)36. Opisany tutaj protokół podzielony jest na 5 części. Części 1 i 2 opisują przygotowanie dużych populacji robaków. Krytycznymi etapami są sterylność warunków pracy oraz przygotowanie odczynników i płytek niezbędnych do przeprowadzenia eksperymentów. Trybunał zauważa, że ze względu na zwiększoną przepustowość zapewnianą przez ten protokół w porównaniu z innymi metodologiami badań przesiewowych36 wymaga on również zwiększonych ilości odczynników; Czynnik ten należy dokładnie rozważyć w projekcie eksperymentalnym. Zwracamy również uwagę, że etap bielenia ma kluczowe znaczenie i musi zostać przetestowany z wyprzedzeniem, ponieważ do przeprowadzenia tych eksperymentów niezbędna jest duża liczba jaj i zdrowych larw. Część 3 tego protokołu szczegółowo opisuje, w jaki sposób dostarczać leki w pożywkach stałych i populacjach robaków przesiewowych. Zwracamy uwagę, że ta część protokołu jest silnie uzależniona od liczby leków i stężeń leków, które mają być testowane przez użytkownika równolegle. Pełna automatyzacja procedury przesiewowej i szybkie pozyskiwanie danych przesuwają etap graniczny z obserwacji behawioralnej na przygotowanie odczynników oraz wzrost i synchronizację dużych populacji robaków. Kluczowymi krokami podczas behawioralnej kontroli są czas nagrywania i wszelkie kroki związane z obsługą robaków (np. przeniesienie robaków z płytek NGM na platformę śledzącą). Opisany tutaj protokół jest przykładem zaprojektowanym do badania przesiewowego robaków przez okres do 9 dni w dorosłym życiu; Protokół ten można jednak łatwo dostosować do wyświetlania dowolnej liczby punktów czasowych, np. 18 kolejnych dni36. Część 4 ilustruje następnie zastosowanie protokołu do dostarczania cząsteczek białka (np. przeciwciał i molekularnych białek opiekuńczych) do C. elegans i pokazuje, w jaki sposób protokół zilustrowany w częściach 1-3 można łatwo dostosować, w zależności od pożądanego zastosowania. Pokazujemy, w jaki sposób procedura ta może być rozszerzona nie tylko na dostarczanie cząsteczek podobnych do leków, ale także na podawanie molekularnych białek opiekuńczych lub przeciwciał37. Pierwsze cztery etapy (części) przeprowadza się w sterylnych warunkach, chyba że zaznaczono inaczej. Wszystkie płynne składniki należy przed użyciem przelać w autoklawie, a etapy inkubacji należy przeprowadzić przy wilgotności względnej 70%. W części 5 opisujemy, jak korzystać z pakietu oprogramowania dostarczanego w połączeniu z etapem śledzenia. To oprogramowanie zostało zaprojektowane specjalnie do analizy danych WF-NTP związanych z zachowaniem dużych populacji robaków. Sugerujemy, aby użytkownik postępował zgodnie ze wskazówkami zawartymi w części 5 dotyczącej analizy danych; Parametry te są jednak zależne od specyficznych cech nagrywanych filmów (tj. FPS, pole widzenia, rozdzielczość wideo, liczba pozyskanych klatek). Przykładowa funkcja dostępna w graficznym interfejsie użytkownika została zaprojektowana tak, aby ułatwić ocenę prawidłowych parametrów przed analizą.

Te serie protokołów umożliwiają skuteczną analizę fenotypów dużych populacji C. elegans (obecnie do 5000 pojedynczych robaków równolegle), redukując artefakty ze względu na wewnętrzną zmienność zachowania zwierząt, zgodnie ze wstępnymi badaniami nad siłą wykrywania niezbędną do osiągnięcia istotności statystycznej dla badań C. elegans25. Platforma wykorzystuje system kamer o wysokiej rozdzielczości, zdolnych do rejestrowania obrazów dużej liczby zwierząt z dużą prędkością, przy jednoczesnym rejestrowaniu wielu dużych kohort. Wysoka wydajność i wysoka przepustowość protokołu WF-NTP umożliwia bardzo dokładne określenie bardzo małych zmian w zachowaniu robaków. W związku z tym metodologia ta umożliwia rozważenie nowych podejść nie tylko do badania biologii C. elegans, ale także do badań farmakologicznych i medycznych, takich jak wysokoprzepustowe badania przesiewowe modyfikacji genetycznych i leczenia farmakologicznego. Procedura ta ma również tę zaletę, że umożliwia przeprowadzanie badań paraliżu równolegle z innymi pomiarami behawioralnymi, co jest kluczową cechą molekularnych badań przesiewowych.

Wyniki, które zostały osiągnięte do tej pory w programach odkrywania leków AD 15,34,35 i PD 18, pokazują znaczenie pozyskiwania danych o szerokim polu widzenia w znacznym zwiększeniu liczby zwierząt, które mogą być monitorowane w jednym eksperymencie, co znacznie zmniejsza błędy eksperymentalne i znacznie poprawia trafność statystyczną badań. Chociaż obecne podejście opisane w tym protokole koncentruje się na rozwiązywaniu problemów w dziedzinie odkrywania leków, mamy nadzieję, że metodologia zostanie szeroko przyjęta w społeczności, a jej zastosowanie zostanie rozszerzone na złożone badania genetyczne i behawioralne oraz rozszerzy liczbę fenotypów, które są obecnie wykrywalne.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Centrum Chorób Nieprawidłowego Fałdowania (CMD). FAA jest wspierana przez stypendium Senior Research Fellowship przyznawane przez Alzheimer's Society w Wielkiej Brytanii (grant numer 317, AS-SF-16-003). Szczepy C. elegans uzyskano z Centrum Genetycznego Caenorhabditis elegans (CGC).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynniki eksploatacyjne
monobasic fosforan potasuSigma AldrichP0662
dwuzasadowy fosforan soduSigma AldrichS3264
chlorek soduSigma Aldrich13422
siarczan magnezuSigma AldrichM7506
AgarSigma AldrichA1296
Difco kazeina digestNaukowe zaopatrzenie laboratoryjne211610
dwuwodny chlorek wapniaSigma AldrichC3881
cholesterolAcros110190250
absolutny etanolVwr20821.33
5-fluoro-2'-deoksyurydyna 98%Alfa Aesar
LB średnie kapsułkiMP biomedicals3002-031
13% podchloryn soduAcros OrganicsAC219255000
Wodorotlenek soduFisher ChemicalS/4880/53
NazwaFirmaNumer katalogowy Uwagi
szczepy
E. coli szczep OP50Dostarczane przez CGCOp50Szczep E coli
C. elegans szczep dziki Dostarczaneprzez CGCN2C. elegans
szczepC. elegans szczep ADDostarczony przez CGCGMC101C. elegans szczep
C. elegans szczep PDDostarczony przez CGCNL5901C. elegans szczep
>C. elegans szczep ALSDostarczony przez CGCAM725C. elegans szczep
C. elegans szczep TauDostarczony przez CGCBR5485C. elegans szczep
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipment
Tactrol 2 AutoklawPriorclave
9 cm sterylne szalki PetriegoFisher Scientific11309283
Kolby Erlenmeyera 2 LMateriały laboratoryjneFLA4036
Nalgene 1 L WirówkaFisher Scientific3120-1000
RC5C plusSorvall9900884
15 mL probówki wirówkoweFisher Scientific05-539-12
Heraeus Multifuge X3RThermofisher scientific
Rozsiewacze do zaszczepianiaFisher Scientific11821741
MultipettePipeta Eppendorf4982000012
P1000Pipeta Eppendorf Research Plus
P200Pipeta Eppendorf Research Plus3123000055
P10Eppendorf Research Plus3123000020
1,000 μ L końcówki o niskiej retencjiSarstedt
300 μ L końcówki o niskiej retencjiSarstedt70.765.105
10 μ L końcówki o niskiej retencjiPipeta serologiczna Sarstedt70.1130.105
VWR612-0927
Pipeta serologiczna 50 mlAppleton WoodsCC117
Pipeta serologiczna 25 mlAppleton WoodsCC216
Pipeta serologiczna 10 ml Pipeta szklanaAppleton Woods CC214
270 mmFisherbrandFB50255Kamera do nagrywania filmów
pulsinPolyplus Transfekcja501-04Odczynnik do transdukcji
Multitron Standardowy inkubator wytrząsającyInfors HTINFO28573
powietrze miotełkapowietrza Office Depot1511631
NazwaFirmaNumer katalogowy Komentarze
>Komponenty śledzące WF-NTP i oprogramowanie do przechwytywania obrazu
8'' na 8'' PodświetlenieEdmond Optics88-508Element śledzący
Obiektyw o wysokiej rozdzielczości 16 mm FL do czujnika 1''Edmond Optics86-571Komponent śledzący
Kamera 6 MpxEdmond Optyka33540Komponent Tracker
Oprogramowanie FlyCapture PointGreySDK v2.12Oprogramowanie do przechwytywania obrazu
Oprogramowanie WF-NTPEnterprisev1.0Oprogramowanie do analizy obrazu
Pakiet OfficeOffice 365Oprogramowanie do analizy statystycznej
L16497.ME wirówka podłogowa 75004515 2 Cambridge Microsoft

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  2. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (5), 387-399 (2006).
  3. Nollen, E. A. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  4. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  5. Van der Goot, A. T., et al. Delaying aging and the aging-associated decline in protein homeostasis by inhibition of tryptophan degradation. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the USA. 109 (37), 14912-14917 (2012).
  6. Van Ham, T. J., et al. Identification of MOAG-4/SERF as a regulator of age-related proteotoxicity. Cell. 142 (4), 601-612 (2010).
  7. Van Ham, T. J., et al. C. elegans model identifies genetic modifiers of α-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genetics. 4 (3), e1000027(2008).
  8. Hamilton, B., et al. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes & Development. 19 (13), 1544-1555 (2005).
  9. Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing. Nature Methods. 5 (10), 865-867 (2008).
  10. Kim, Y., Sun, H. Functional genomic approach to identify novel genes involved in the regulation of oxidative stress resistance and animal lifespan. Aging Cell. 6 (4), 489-503 (2007).
  11. Dillin, A., et al. Rates of Behavior and Aging Specified by Mitochondrial Function During Development. Science. 298 (5602), 2398-2401 (2002).
  12. Lee, S. S., Kennedy, S., Tolonen, A. C., Ruvkun, G. DAF-16 target genes that control C. elegans life-span and metabolism. Science. 300 (5619), 644-647 (2003).
  13. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews. Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  14. Alavez, S., Vantipalli, M. C., Zucker, D. J. S., Klang, I. M., Lithgow, G. J. Amyloid-binding compounds maintain protein homeostasis during ageing and extend lifespan. Nature. 472 (7342), 226-229 (2012).
  15. Habchi, J., et al. An anticancer drug suppresses the primary nucleation reaction that initiates the production of the toxic A 42 aggregates linked with Alzheimers disease. Science Advances. 2 (2), e1501244(2016).
  16. Wu, Y., et al. Amyloid- -Induced pathological behaviors are suppressed by ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 26 (50), 13102-13113 (2006).
  17. Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 92 (20), 9368-9372 (1995).
  18. Perni, M., et al. A natural product inhibits the initiation of a-synuclein aggregation and suppresses its toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the USA. 114 (6), E1009-E1017 (2017).
  19. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genetics. 5 (3), e1000399(2009).
  20. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journal of visualized experiments. (95), 52321(2015).
  21. Machino, K., Link, C. D., Wang, S., Murakami, H., Murakami, S. A semi-automated motion-tracking analysis of locomotion speed in the C. elegans transgenics overexpressing beta-amyloid in neurons. Frontiers in Genetics. 5, 202(2014).
  22. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  23. Van der Goot, A. T., Nollen, E. A. A. Tryptophan metabolism: entering the field of aging and age-related pathologies. Trends in Molecular Medicine. 19 (6), 336-344 (2013).
  24. Lublin, A. L., Link, C. D. Alzheimer's disease drug discovery: in vivo screening using Caenorhabditis elegans as a model for β-amyloid peptide-induced toxicity. Drug Discovery Today: Technologies. 10 (1), e115-e119 (2013).
  25. Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational analysis of lifespan experiment reproducibility. Frontiers in genetics. 8 (JUN), 92(2017).
  26. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
  27. Wang, S. J., Wang, Z. -W. Track-a-worm, an open-source system for quantitative assessment of C. elegans locomotory and bending behavior. PLoS ONE. 8 (7), e69653(2013).
  28. Faumont, S., et al. An image-free opto-mechanical system for creating virtual environments and imaging neuronal activity in freely moving Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 6 (9), e24666(2011).
  29. Tsibidis, G. D., Tavernarakis, N. Nemo: a computational tool for analyzing nematode locomotion. BMC Neuroscience. 8, 86(2007).
  30. Stirman, J. N., et al. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
  31. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
  32. Restif, C., et al. CeleST: computer vision software for quantitative analysis of C. elegans swim behavior reveals novel features of locomotion. PLoS Computational Biology. 10 (7), e1003702(2014).
  33. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes. PLoS ONE. 3 (5), e2208(2008).
  34. Habchi, J., et al. Systematic development of small molecules to inhibit specific microscopic steps of Aβ42 aggregation in Alzheimer's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (2), E200-E208 (2017).
  35. Aprile, F. A., et al. Selective targeting of primary and secondary nucleation pathways in Aβ42 aggregation using a rational antibody scanning method. Science Advances. 3 (6), e1700488(2017).
  36. Perni, M., et al. Massively parallel C. elegans tracking provides multi-dimensional fingerprints for phenotypic discovery. Journal of neuroscience. 306, 57-67 (2018).
  37. Perni, M., et al. Delivery of Native Proteins into C. elegans Using a Transduction Protocol Based on Lipid Vesicles. Scientific Reports. 7 (1), 7380(2017).
  38. McColl, G., et al. Utility of an improved model of amyloid-beta (Aβ₋) toxicity in Caenorhabditis elegans for drug screening for Alzheimer's disease. Molecular Neurodegeneration. 7 (1), 7380(2012).
  39. Fatouros, C., et al. Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
  40. Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. In vivo aggregation of β-Amyloid peptide variants. Journal of Neurochemistry. 71 (4), 1616-1625 (1998).
  41. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-17 (2012).
  42. Hardaker, L. A., Singer, E., Kerr, R., Zhou, G. T., Schafer, W. R. Serotonin modulates locomotory behavior and coordinates egg-laying and movement in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurobiology. 49 (4), 303-313 (2001).
  43. Tsechpenakis, G., Bianchi, L., Metaxas, D., Driscoll, M. A novel computational approach for simultaneous tracking and feature extraction of C. elegans populations in fluid environments. IEEE Transactions on Bio-medical Engineering. 55 (5), 1539-1549 (2008).
  44. Buckingham, S. D., Sattelle, D. B. Fast, automated measurement of nematode swimming (thrashing) without morphometry. BMC Neuroscience. 10, 84(2009).
  45. Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H., Sternberg, P. W., Schafer, W. R. An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior. BMC Bioinformatics. 5, 115(2004).
  46. Stroustrup, N., et al. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

C elegans TrackingAutomated Behavioral AnalysisWide Field of view TrackingParallel Worm TrackerMotility Screening PlateM9 Buffer WashFUDR Plate PreparationL4 Larval SeedingVideo Data AnalysisNeurodegenerative Disease Models

Powiązane artykuły