Artykuł metodologiczny

Badanie wzajemnych oddziaływań komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej i adipocytów w ludzkiej podskórnej tkance tłuszczowej

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66608

⸱

5 kwietnia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Leeds Institute of Cardiovascular and Metabolic Medicine, University of Leeds

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół izolacji, hodowli i fenotypowania mikronaczyniowych komórek śródbłonka z ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej (hSATMVECs). Dodatkowo opisujemy eksperymentalny model wzajemnego przenikania się hSATMVEC-adipocytów.

Streszczenie

Komórki śródbłonka mikronaczyniowego (MVEC) pełnią wiele kluczowych ról, w tym kontrolę napięcia naczyniowego, regulację zakrzepicy i angiogenezę. Znaczna heterogeniczność genotypu i fenotypu komórek śródbłonka (EC) zależy od ich łożyska naczyniowego i stanu choroby gospodarza. Możliwość izolowania MVEC z łożysk naczyniowych specyficznych tkankowo i poszczególnych grup pacjentów daje możliwość bezpośredniego porównania funkcji MVEC w różnych stanach chorobowych. Tutaj, za pomocą podskórnej tkanki tłuszczowej (SAT) pobranej w momencie wprowadzania wszczepialnych urządzeń elektronicznych do implantacji serca (CIED), opisujemy metodę izolacji czystej populacji funkcjonalnej ludzkiej podskórnej tkanki tłuszczowej MVEC (hSATMVEC) oraz eksperymentalny model przesłuchu hSATMVEC-adipocyty.

hSATMVEC zostały wyizolowane po enzymatycznym trawieniu SAT przez inkubację z kulkami magnetycznymi pokrytymi przeciwciałem anty-CD31 i przejście przez kolumny magnetyczne. hSATMVEC były hodowane i pasażowane na płytkach pokrytych żelatyną. W eksperymentach wykorzystano komórki w przejściach 2-4. Komórki zachowały klasyczne cechy morfologii EC co najmniej do pasażu 5. Ocena cytometrii przepływowej wykazała 99,5% czystości izolowanego hSATMVEC, zdefiniowanego jako CD31+/CD144+/CD45-. Wyizolowany hSATMVEC z grupy kontrolnej miał czas podwojenia populacji wynoszący około 57 godzin, a aktywną proliferację potwierdzono za pomocą zestawu do obrazowania proliferacji komórek. Izolowaną funkcję hSATMVEC oceniano na podstawie ich odpowiedzi na stymulację insuliną i potencjału tworzenia cewek angiogennych. Następnie ustaliliśmy model kohodowli adipocytów hSATMVEC i podskórnie w celu zbadania przesłuchów komórkowych i wykazaliśmy dalszy wpływ hSATMVEC na funkcję adipocytów.

hSATMVEC może być wyizolowany z SAT pobranego w czasie insercji CIED i ma wystarczającą czystość, aby zarówno eksperymentalnie fenotypować, jak i badać przesłuch hSATMVEC-adipocyty.

Wprowadzenie

Komórki śródbłonka (ECs) to komórki płaskonabłonkowe, które wyściełają wewnętrzną powierzchnię ściany naczynia krwionośnego jako monowarstwę. Pełnią one wiele istotnych ról, w tym kontrolę napięcia naczyniowego, regulację zakrzepicy, modulowanie odpowiedzi zapalnej i przyczynianie się do angiogenezy1. Biorąc pod uwagę znaczenie komórek śródbłonka w fizjologii kardiometabolicznej, są one często wykorzystywane eksperymentalnie w celu lepszego zrozumienia patofizjologii i zbadania nowych metod leczenia farmakologicznego chorób kardiometabolicznych.

Istnieje jednak ogromna niejednorodność w morfologii komórek śródbłonka, funkcji, ekspresji genów i składzie antygenu, w zależności od pochodzenia ich łożyska naczyniowego2. Podczas gdy komórki śródbłonka z dużych tętnic najlepiej nadają się do badań miażdżycy, komórki śródbłonka z małych naczyń, znane jako komórki śródbłonka mikronaczyniowego (MVEC), są bardziej odpowiednie do badań angiogenezy2. Zrozumienie molekularnych podstaw heterogeniczności śródbłonka może dostarczyć cennych informacji na temat terapii specyficznych dla łóżka naczyniowego. Funkcja śródbłonka mikronaczyniowego również znacznie różni się w wielu chorobach, w tym cukrzycy, chorobach układu krążenia i infekcjach ogólnoustrojowych3,4. W związku z tym możliwość izolowania komórek śródbłonka ze zdefiniowanych grup pacjentów pozwala na bezpośrednie porównanie funkcji ich komórek śródbłonka i przesłuchu komórkowego5.

W tym artykule opisujemy nowatorską metodę izolowania ludzkich MVEC z podskórnej tkanki tłuszczowej (hSATMVEC) pobranej podczas wprowadzania wszczepialnego elektronicznego urządzenia do implantacji serca (CIED). hSATMVEC wyizolowany po enzymatycznym trawieniu podskórnej tkanki tłuszczowej (SAT) był hodowany i pasażowany na płytkach pokrytych żelatyną. Następnie opisujemy szereg testów fenotypowania, które zostały z powodzeniem zastosowane do hSATMVEC w celu walidacji ich fenotypu i wykazania zastosowania w rutynowych testach komórek śródbłonka. Na koniec opisujemy zastosowanie hSATMVECs w eksperymentalnym modelu wzajemnego oddziaływania hSATMVECs i adipocytów.

Protokół

Próbki tkanek ludzkich użyte w opisanej technice zostały pobrane od pacjentów poddawanych wskazanym przez wytyczne wprowadzeniom CIEDs zgodnie z rutynową praktyką kliniczną w Leeds Teaching Hospitals NHS Trust (Leeds, Wielka Brytania). Protokół badania, wraz z całą pozostałą dokumentacją, został zatwierdzony przez lokalną komisję bioetyczną (11/YH/0291) przed zapisaniem uczestnika. Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej.

1. Populacja pacjentów

  1. Pozyskać świeżą podskórną tkankę tłuszczową (SAT) podczas implantacji CIED z SAT nakładającej się na mięsień piersiowy większy.
  2. Próbki SAT należy wyizolować w sterylnych warunkach, a próbki tkanek po pobraniu należy obchodzić się z okapem z przepływem laminarnym w ściśle aseptycznych warunkach, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu.

2. Izolacja i hodowla komórek śródbłonka

UWAGA: Schemat izolacji hSATMVEC jest pokazany w Rysunek 1.

  1. Do izolacji hSATMVEC należy użyć co najmniej 250 mg świeżej podskórnej tkanki tłuszczowej (SAT) uzyskanej podczas implantacji CIED z SAT pokrywającej mięsień piersiowy większy (patrz Rysunek 1).
    UWAGA: Użycie większych ilości świeżego SAT zwiększa wydajność hSATMVEC podczas izolacji i daje największą szansę na udaną izolację i hodowlę hSATMVEC.
  2. Natychmiast umieść SAT w lodowatym roztworze do przechowywania tkanek do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml przed przeniesieniem do laboratorium.
    UWAGA: Aby uzyskać największą szansę na pomyślną izolację, izolację hSATMVEC należy przeprowadzić tak szybko, jak to możliwe. Jednak SAT może być przechowywany do 24 godzin na lodzie przed izolacją, jeśli jest to wymagane.
  3. Przygotować roztwór roboczy 1 mg/ml kolagenazy/dypazy w następujący sposób.
    1. Najpierw należy rozpuścić 500 mg liofilizowanego proszku kolagenazy/dypazy w 5 ml sterylnej wody, aby utworzyć roztwór podstawowy kolagenazy/dypazy o stężeniu 100 mg/ml.
    2. Dla każdej izolacji hSATMVEC rozcieńczyć 100 μl roztworu podstawowego kolagenazy/dypazy w 10 ml zimnego roztworu soli Hanksa, aby uzyskać roztwór roboczy o stężeniu 1 mg/ml.
  4. W komorze z przepływem laminarnym użyj dwóch skalpeli, aby zmielić tkanki na ~1 mm3 kawałki w 500 μl 1 mg/ml roztworu kolagenazy/dypazy na pokrywie szalki Petriego, rozcierać i przenieść do czystej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
  5. Umyć pokrywkę szalki Petriego 4,5 ml świeżego roztworu kolagenazy/dispazy o stężeniu 1 mg/ml i dodać do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Pozostawić do strawienia na 30 minut w temperaturze 37 °C w rotatorze probówkowym przy 20 obr./min. Zatrzymaj proces trawienia, dodając 10 ml kompletnej pożywki EC MV.
  6. Roztarć strawioną mieszaninę i przepuścić ją przez sito komórkowe o wielkości 70 μm. Przepłukać sito 10 ml 0,5% buforu soli fizjologicznej z albuminą surowicy bydlęcej (PBS-BSA) buforowanym fosforanami. Odwirować próbkę o masie 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Powtórz ten krok z kolejnymi 5 ml 0,5% PBS-BSA.
  7. Następnie usuń martwe komórki za pomocą zestawu do usuwania martwych komórek. W tym celu należy inkubować osad komórkowy w 200 μl kulek do usuwania martwych komórek (wir przed użyciem) przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT) w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  8. Przymocuj kolumnę LS z filtrem 30 μm do magnesu separatora i umieść pod nim probówkę wirówkową o pojemności 15 ml. Przemyć kolumnę magnetyczną raz 1 ml buforu wiążącego do usuwania martwych komórek przed dodaniem zawiesiny próbki/kulki i pozwolić jej pasywnie przejść pod wpływem grawitacji.
  9. Następnie przemyć kolumnę, dodając 0,5 ml buforu wiążącego i pozwolić mu pasywnie przejść przez kolumnę. Powtórz to pranie cztery razy.
  10. Zebrać eluat jako żywą frakcję komórkową, wirować komórki przy 300 x g w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie umyć i ponownie zawiesić powstały osad w 400 μl 0,5% PBS-BSA.
  11. Dodać 20 μl kulek magnetycznych pokrytych anty-CD31 do zawieszonych komórek i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Po inkubacji odwirować próbkę o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl 0,5% PBS-BSA.
  12. Przymocuj kolumnę MS z filtrem 30 μm do magnesu separatora i umieść pod nim probówkę wirówkową o pojemności 15 ml. Zalać kolumnę 500 μl 0,5% PBS-BSA. Powtórz ten krok dwukrotnie.
  13. Dodaj zawiesinę mikrokulek komórkowych i pozwól jej przejść pod wpływem grawitacji. Przemyć kolumnę trzykrotnie 500 μl 0,5% PBS-BSA. Przepływ w probówce wirówkowej pod kolumną zawiera frakcję CD31-.
  14. Aby zebrać frakcję CD31+ (tj. frakcję zawierającą hSATMVECs), wyjmij kolumnę MS z magnesu separatora i umieść ją w świeżej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodać 1 ml 0,5% PBS-BSA i jednym płynnym ruchem nałożyć tłok kolumny, aby uwolnić wychwycone hSATMVECs.
  15. Odwirować próbkę o masie 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml kompletnej pożywki wzrostowej EC MV i podzielić 1 ml roztworu komórkowego między jedną lub dwie studzienki (w zależności od wielkości osadu) 24-dołkowej płytki pokrytej żelatyną (przejście 0).
    UWAGA: Nie należy się martwić, jeśli w ciągu pierwszych kilku dni po izolacji jest niewiele przylegających komórek.
  16. Zmieniaj nośniki co 3 dni. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C z 5 % CO2 . Gdy wyizolowane komórki osiągną ~80% konfluencji (2-4 tygodnie), przenieś je do pojedynczego dołka sześciodołkowej płytki (przejście 1).
    UWAGA: Kolejne pasaże mogą ponownie pokryć komórki z jednej studni zlewającej się dawcy do studzienek biorcy. Doświadczenia przeprowadzono na komórkach pasażowanych 2-4 generacji po tym, jak komórki wykazały czystość >99% za pomocą cytometrii przepływowej (patrz punkt 3). Komórki zachowały typową morfologię śródbłonka co najmniej do pasażu 5.

3. Cytometria przepływowa

  1. Przed zastosowaniem cytometrii przepływowej należy sprawdzić wzrokowo hSATMVECs, aby upewnić się, że wydają się zlewające się i morfologicznie reprezentatywne. Przeprowadzić ocenę metodą cytometrii przepływowej hSATMVEC w pasażu 2, używając komórek z pojedynczego dołka płytki 6-dołkowej.
  2. Umyj komórki dwukrotnie PBS, dodając dobrze 500 μl PBS i zasysając za każdym razem. Następnie dodaj 300 μl/studzienkę ciepłego roztworu trypsyny/EDTA (0,25%). Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 minuty.
  3. Po odłączeniu zneutralizować roztwór trypsyny/EDTA za pomocą 700 μl kompletnej pożywki wzrostowej EC MV i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  4. Odwirować zawiesinę komórek o sile 400 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant bez naruszania osadu. Następnie ponownie zawieś osad komórek w buforze MACS o pojemności 1 ml i podziel między dwie probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml oznaczone jako niebarwiona kontrola i barwiona próbka (500 μl na studzienkę).
  5. Dodać dodatkowe 500 μl buforu MACS do każdej probówki do mikrowirówki, a następnie ponownie odwirować przy 400 x g przez 8 minut w temperaturze suchej masy.
  6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 100 μl buforu MACS do niebarwionej kontroli i 100 μl koktajlu barwiącego (tabela uzupełniająca 1) dla barwionej próbki. Wybarwić komórki CD45-FITC (marker pan-leukocytów), a także CD144-PE i CD31-PerCP (które ulegają ekspresji w komórkach śródbłonka).
  7. Krótko wirować zawieszone komórki przez 5 s, a następnie inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Następnie dodać 1 ml buforu MACS do każdej probówki, ponownie odwirować przy 400 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
  8. Na koniec ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu MACS i przenieść go do świeżej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Umieść oznakowaną probówkę w zakrytym pojemniku na lód gotowym do analizy.
    UWAGA: Wszystkie zawarte analizy cytometrii przepływowej zostały przeprowadzone na 4-laserowym cytometrze przepływowym Beckman Coulter Cytoflex (przy użyciu tylko lasera wzbudzającego 488 nm).
  9. Ustaw maksymalną długość fali emisji i filtr dla każdego fluorochomu w następujący sposób: CD45-FITC - maksymalna emisja 520 nm, filtr 525/50; CD144-PE - maksymalna emisja 578 nm, filtr 585/40; CD31-PerCP - maksymalna emisja 675 nm, filtr 655-730.
  10. Jak pokazano w Rysunek 2, zapisz dane dla 10 000 komórek na próbkę w bramce singletowej (P2). Sprawdź, czy P1 otacza główne skupisko komórek i czy większość tych komórek wpada do bramki singletowej P2. Upewnij się, że niezabarwiona kontrola ma minimalną liczbę komórek CD45-CD144 + CD31 + jako % singletów.
  11. Zapisać procentową zawartość pojedynczych komórek CD45-CD144+CD31+ w barwionej próbce.

4. Czas podwajania i proliferacji komórek śródbłonka (Rysunek 3)

  1. W przejściach 2 i 3 policz liczbę żywotnych hSATMVEC dla każdej próbki za pomocą hemocytometrii. Zapisz datę i godzinę zliczania każdej komórki.
  2. Oblicz liczbę podwojeń populacji między tymi punktami zgodnie z równaniem: czas podwojenia = (czas trwania x log(2))/(log (stężenie końcowe)-log(stężenie początkowe)).
    UWAGA: Kalkulator online jest dostępny pod adresem https://doubling-time.com/compute.php.
  3. Oceń proliferację hSATMVECs za pomocą dostępnego na rynku zestawu do obrazowania proliferacji komórek. Wysiewaj hSATMVEC o gęstości 20 000 komórek na studzienkę na 24-dołkowej płytce i pozostaw je na noc w kompletnej pożywce wzrostowej EC MV do odzyskania.
  4. Następnego dnia dodać 5-etynylo-2'-deoksyurydynę (EdU) do każdego studzienka rozcieńczonego w kompletnych pożywkach wzrostowych EC MV o końcowym stężeniu 10 μM. Inkubować w temperaturze 37 °C (5% CO2) przez 2 godziny.
  5. Usunąć pożywkę zawierającą EdU i umyć każdą studzienkę dwukrotnie PBS. Utrwalić komórki 4% paraformaldehydem przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć każdą studzienkę dwukrotnie PBS i dodać 500 μl 0,5% Triton X-100 do buforowanego tris-buforem soli fizjologicznej (TBS). Pozostawić do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
    UWAGA: To przenika przez błonę komórkową, umożliwiając wejście azydku znakowanego fluorem 488 Alexa do komórki.
  6. Przygotuj koktajl azydkowy z oznaczeniem Alexa fluor 488 zgodnie z instrukcjami producenta, w zależności od liczby studzienek (patrz6). Umyj każdą studzienkę dwukrotnie PBS przed dodaniem 100 μl koktajlu azydkowego znakowanego fluorem 488 Alexa i inkubuj przez 30 minut w temperaturze RT chronionej przed światłem.
    UWAGA: Koktajl azydkowy z oznaczeniem Alexa fluor 488 reaguje z EdU w reakcji kliknięcia.
  7. Usuń koktajl azydkowy z oznaczeniem Alexa fluor 488 i umyj dwukrotnie PBS. Dodać 500 μl jodku propidyny do dołka i inkubować przez 20 minut w temperaturze RT.
    UWAGA: Ten etap przeciwbarwi jądra (zarówno proliferujące, jak i nieproliferujące) na czerwono.
    Usunąć jodek propidyny, przemyć dwukrotnie PBS i pozostawić każdą studzienkę w 500 μl PBS do obrazowania.
  8. Zobrazuj każdą studzienkę w 4 polach o dużej mocy przy 10-krotnym powiększeniu, z wzbudzeniem/emisją 495/519 nm dla azydku 488 nm (patrz Rysunek 3C).
    UWAGA: Obrazy na rysunkach zostały wykonane przy użyciu systemu analizy żywych komórek przy 10-krotnym powiększeniu i czasie naświetlania 800 ms.
  9. Policz liczbę proliferujących komórek (zielony) i wyraź jako procent (%) wszystkich komórek w każdym polu o dużej mocy (średnio 4 regiony na dołek).

5. Tworzenie rurki komórkowej śródbłonka

  1. Opuść Matrigel (macierz błony podstawnej; BMM) do rozmrażania przez noc na lodzie. Następnego dnia, gdy płytka jest na lodzie, dodać 160 μl BMM do każdego dołka na 24-dołkowej płytce zgodnie z wymaganiami. Przechyl płytę, aby uzyskać pełne pokrycie każdej studzienki za pomocą BMM. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w celu zastygnięcia podczas przygotowywania komórek.
  2. Wysiewaj hSATMVEC w 100 000 komórek (w 1 ml pożywki) na studzienkę. Odpipetować z boku studzienki i uważać, aby pipetować powoli, aby uniknąć oderwania się matrycy. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 4 godziny
    UWAGA: W tym momencie płyta jest gotowa do obrazowania. Wyniki i rysunki poniżej obrazowania fazowego w systemie analizy żywych komórek przy 10-krotnym powiększeniu zostały wykorzystane w 5 różnych obszarach studzienek (patrz Rysunek 3D).
  3. Policz liczbę całych probówek w każdym polu o dużej mocy i oblicz średnią wartość dla każdej próbki.

6. Stymulacja insuliną hSATMVEC

  1. Hodowla hSATMVEC na płytce 6-dołkowej w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Po zlewaniu się usuń całe podłoże do wzrostu komórek śródbłonka MV i przemyj dwukrotnie PBS.
  2. Dodać 500 μl pożywki do produkcji surowicy (pożywki do wzrostu komórek śródbłonka MV bez suplementów) do każdej studzienki i pozostawić do inkubacji w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 4 godziny. W tym czasie należy przygotować 500 μl podwielokrotności insuliny zwiększającej stężenie insuliny (0-150 μM) przygotowane w pożywce do głodzenia surowicy.
  3. Po głodzeniu surowicy przez 4 godziny, usunąć pożywkę z dołków, dodać 1 ml pożywki zawierającej insulinę (o rosnącym stężeniu) do każdej studzienki i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  4. Przemyć dwukrotnie zimnym PBS przed dodaniem 100 μl buforu do lizy białek zawierającego inhibitory proteazy i fosfatazy w celu lizy komórek na białko. Określ ilościowo białko za pomocą testu BCA.
    UWAGA: W eksperymencie opisanym poniżej, lizaty komórkowe inkubowano przez 30 minut w łaźni lodowej i odwirowywano przy 20 000 x g przez 15 minut. Przed elektroforezą próbki białek gotowano w celu denaturacji białek w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Białka rozdzielono na 4-12% żelu Bis-Tris NuPAGE i przeniesiono do membrany nitrocelulozowej. Analizę immunoblot przeprowadzono zgodnie ze standardowymi protokołami przy użyciu odpowiednich przeciwciał fosfoproteinowych i przeciwciał białkowych ogółem (zgodnie z instrukcjami producenta). Do wykrycia przeciwciała pierwszorzędowego użyto odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego Ig/HRP (zgodnie z instrukcją producenta). Poziomy białka określono ilościowo za pomocą densytometrii w oparciu o intensywność prążków z każdej próbki. Tam, gdzie było to właściwe, ß-aktynę stosowano jako kontrolę obciążenia.

7. Konfiguracja ko-hodowli adipocytów hSATMVEC-adipocyte (Rysunek 4)

UWAGA: W poniższych wynikach, komercyjnie dostępne ludzkie białe podskórne preadipocyty w przejściu 2 od pojedynczego męskiego dawcy rasy kaukaskiej zostały użyte we wszystkich testach adipocytów. Preadipocyty początkowo rozn.p.a. z fiolki dostarczonej przez dostawcę (przejście 0) do dwunastu kriofilii zawierających pożywkę do zamrażania krio-SFM (przejście 1).

  1. Każda 24-dołkowa płytka do kohodowli wymaga jednego kriowialnego preadipocytów (przejście 1). Szybko rozmrozić każdą fiolkę i płytkę w kolbie T75 zawierającej 12-15 ml ciepłej pożywki PGM-2 (zawierającej 10% FBS, 30 μg/ml L-glutaminy i 15 ng/ml GA-1000 SingleQuots). Zmieniaj media co 3 dni, aż do 90% konfluencji.
  2. Po zlewaniu się w 90% przemyj ludzkie białe podskórne preadipocyty PBS, a następnie dodaj 1 ml roztworu trypsyny/EDTA (0,25%). Pozostaw w RT na 2 minuty i potwierdź oderwanie za pomocą mikroskopii świetlnej. Dodaj 23 ml pożywki PGM-2, aby zneutralizować trypsynę/EDTA i przygotuj 24 ml roztworu zawieszonego preadipocytów.
  3. Umieść 1 ml zawieszonego ludzkiego podskórnego białego roztworu preadipocytów do każdej studzienki 24-dołkowej płytki towarzyszącej do kokultury i rozwijaj do zbiegu (zwykle 2-3 dni).
  4. Podczas wzrostu do konfluencji przygotuj pożywki do różnicowania preadipocytów (PDM). Aby przygotować PDM, przygotuj 2x PDM, dodając zastrzeżoną mieszankę insuliny, deksametazonu, indometacyny i izobutyloksantyny do podłoża bazowego PGM. Rozcieńczyć 2x PDM w stosunku 1:1 z PGM, aby uzyskać 1x PDM.
  5. Po zlewaniu się różnicuj ludzkie podskórne białe preadipocyty, zmieniając pożywkę na 1 ml pożywki 1x PDM do każdej studzienki (dzień 0). Pozostawić ludzkie podskórne białe preadipocyty do inkubacji w temperaturze 37 °C 5% CO2 przez 10 dni (bez zmian pożywki), aby w pełni się różnicować. Monitoruj różnicowanie za pomocą mikroskopii fazy świetlnej (patrz Rysunek 4B).
    UWAGA: Zróżnicowane adipocyty nie mogą być pasażowane i mogą być używane do testów od 10 do 12 dnia. Różnicowanie adipocytów można zmierzyć za pomocą amplifikacji mRNA leptyny, adiponektyny i PPAR-γ.
  6. W 6 dniu różnicowania wysiewa się hSATMVEC o gęstości 5 x 104 komórek na wkładkę w 500 μl kompletnej pożywki EC MV na wkładkach transwell (membrana 0,4 μM). Umieścić wkładki transwell w studzience z 500 μl kompletnej pożywki wzrostowej EC MV () i rosnąć do konfluencji w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
  7. W dniu 10, kiedy adipocyty są w pełni zróżnicowane, usuń połowę pożywki PDM z każdej studzienki i przenieś wkładki transwell zawierające zbiegający się hSATMVEC w ich własnych pożywkach (ECGM-MV) do każdej studzienki (patrz Figura 4A).
  8. Pozostaw komórki w kohodowli na 24 godziny przed usunięciem wkładek transwell i wykonaj testy oceniające funkcję adipocytów.
    UWAGA: W tym momencie adipocyty mogą być również poddawane lizie w celu izolacji białka lub RNA, jeśli jest to wymagane.

8. Wychwyt 2-(N-(7-Nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo)Amino)-2-deoksyglukozy (2-NBD)-wychwyt glukozy

  1. Po 24 godzinach w kohodowli usunąć wstawki komórkowe zawierające hSATMVEC. Następnie dodać 2-NBD-glukozę do pożywki w każdym dołku, aby osiągnąć końcowe stężenie 20 μM. Chronić przed światłem i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  2. Umyj komórki dwukrotnie w PBS i utrwal adipocyty za pomocą 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Umyj komórki trzy razy w PBS przed pozostawieniem w 100 μl PBS.
    UWAGA: W tym momencie adipocyty są gotowe do obrazowania. Na załączonych rysunkach obrazowanie fazowe i zielone światło (wzbudzenie 440-480 nm/emisja 504-544 nm) uzyskano na systemie analizy żywych komórek przy 10-krotnym powiększeniu w czterech polach o dużej mocy (patrz Rysunek 4C).
  3. Określ ilościowo poziom wychwytu glukozy, określając ilościowo procentową zawartość koloru zielonego w całkowitej powierzchni za pomocą progowania w ImageJ (lub innym podobnym pakiecie oprogramowania).

Wyniki

czystość i fenotyp hSATMVEC
Izolowany hSATMVEC od pacjentów z grupy kontrolnej (tj. osób bez historii choroby kardiometabolicznej) stanowił 99,5% CD31 + CD144 + CD45- w cytometrii przepływowej (Ryc. 2). Izolowany hSATMVEC miał morfologię podobną do kostki brukowej typową dla EC (Rysunek 3A). hSATMVEC miały średni czas podwojenia populacji wynoszący 56,6 h ± 8,1 h (średnia ± SEM, n = 10) (Figura 3B), a aktywna replikacja DNA w hSATMVEC została potwierdzona przy użyciu zestawu do obrazowania proliferacji komórek (Figura 3C).

hSATMVEC zachowywał się jak działające MVEC i tworzył rurki w Matrigel (Rysunek 3D). Względna ekspresja kluczowych białek zaangażowanych w szlak sygnalizacji insuliny Akt-eNOS pokazano w Rysunek 3E. Zarówno eNO, jak i Akt wykazały wzrost fosforylacji indukowanej insuliną, reprezentowany jako stosunek fosforylowanego białka / całkowitego białka znormalizowanego do ß-aktyny (Figura 3E).

hSATMVEC-kokultura adipocytów
Ilustracyjny model kokultury hSATMVEC i adipocytów można zobaczyć w Rysunek 4A. W miarę jak ludzkie podskórne białe preadipocyty stają się bardziej zróżnicowane, można zauważyć rozwój wakuoli lipidowych (Figura 4B), które można określić ilościowo za pomocą barwienia czerwienią olejową O (Figura 4B).

Ilustracyjne obrazowanie kontrastu fazowego i fluorescencji (wzbudzenie 440-480 nm/emisja 504-544 nm) zróżnicowanych adipocytów po 30 minutach inkubacji z 20 μM 2-NBD glukozy jest pokazane w Rysunek 4C. Wychwyt glukozy można określić ilościowo, mierząc zielony obszar jako procent całkowitej powierzchni komórek.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat przedstawiający zbieranie i przetwarzanie hSATMVECs Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Typowy wynik analizy metodą cytometrii przepływowej hodowanych hSATMVECs. (A) Wykres punktowy obszaru rozproszonego bocznego (SSC-A) i obszaru rozproszenia przodu (FSC-A) pokazujący bramkowanie (czerwona ramka) hodowanych hSATMVEC wokół określonej gęstości populacji komórek. (B) Wykres punktowy szerokości rozproszenia do przodu (FSC-Width) i FSC-A pokazujący bramkowanie (czerwona ramka) hodowanych hSATMVEC wokół określonej gęstości populacji komórek. (C) Histogram przedstawiający fluorescencję bramkowanych komórek do CD45-FITC. (D) Wykres punktowy intensywności fluorescencji CD144-PE (oś x) i CD31-PerCP (oś y). (E) Histogram pokazujący fluorescencję bramkowanych komórek do CD144-PE. (F) Histogram przedstawiający fluorescencję bramkowanych komórek do CD31-PerCP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: fenotyp hSATMVEC. (A) Obraz z mikroskopii świetlnej hSATMVEC w pobliżu zbiegu, ukazujący wygląd przypominający bruk. (B) Czas podwojenia hSATMVEC - Mikroskopia świetlna HATEC wykonana w odstępie 24 godzin, pokazująca zakres proliferacji komórek. (C) Rozprzestrzenianie się hSATMVEC. Mikroskopia fluorescencyjna hSATMVEC z jodkiem propidyny i EdU/Alexa-fluor 488 od osób z grupy kontrolnej. (D) Formowanie się rurki hSATMVEC u osób kontrolnych (zdjęcia wykonane przy 4-krotnym powiększeniu). (E) Stymulacja insulinowa HATEC - wykazująca względną ekspresję fosforylowanego Akt (seryna 473) do całkowitego Akt (lewy panel), fosforylowanego eNOS (seryna 1177) do całkowitego eNOS (prawy panel) przy rosnących stężeniach insuliny z ilustracyjnymi western blot poniżej standaryzowanego na B-aktynę. Dane są przedstawiane jako średnia ± SEM. Wielkości próbek znajdują się pod każdym panelem. Skróty: 5-etynylo-2'-deoksyurydyna (EdU), ludzkie podskórne komórki śródbłonka mikronaczyniowego tkanki tłuszczowej (hSATMVEC), błąd standardowy średniej (SEM). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Współkultura hSATMVEC-adipocytów. (A) Schematyczny obraz kokultury hSATMVEC-adipocytów. (B) Różnicowanie adipocytów. Lewy panel pokazuje preadipocyty w dniu 0, a prawy panel pokazuje zróżnicowane adipocyty w dniu 10 po dodaniu PDM. Dolny rysunek przedstawia ilość lipidów przechowywanych w adipocytach i preadipocytach barwionych testem wychwytu glukozy Oil Red O. (C). Lewy panel przedstawia obrazowanie fazowe adipocytów po kohodowli i inkubacji z 20 μM glukozy 2-NBD przez 30 minut. Prawy panel pokazuje zielone obrazowanie, na podstawie którego można określić ilościowo wychwyt glukozy (jako % koloru zielonego całkowitej powierzchni). Dane są przedstawione jako średnia ± SEM. Skróty: Dzień 10 (D10), ludzkie podskórne komórki śródbłonka mikronaczyniowego tkanki tłuszczowej (hSATMVEC), pożywki różnicujące preadipocyty (PDM) Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Koktajl barwiący do cytometrii przepływowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

W badaniu opisano technikę izolowania hSATMVEC pobranego z SAT podczas rutynowej implantacji CIEDs. Wykazujemy, że wyizolowany hSATMVEC ma wysoką czystość, ulega ekspresji specyficznych dla EC białek transbłonowych CD144 i CD31 i nie wykazuje znaczącej ekspresji leukocytów CD45. Następnie pokazujemy, że w powtarzalny i wiarygodny sposób izolowany hSATMVEC namnaża się i może być wykorzystany eksperymentalnie do badania wewnątrzkomórkowej maszynerii zaangażowanej w sygnalizację insuliny i angiogenezę. Oprócz możliwości hodowania ich w izolacji, mogą być również wykorzystywane we wspólnej hodowli do badania wzajemnych oddziaływań hSATMVEC-adipocytów.

Komórki śródbłonka wykorzystywane w badaniach podstawowych i translacyjnych są zwykle pozyskiwane z dużych naczyń, takich jak aorta i ludzka żyła pępowinowa lub mikrokrążenie. Oba te źródła mają swoje własne ograniczenia 7,8; Komórki śródbłonka z dużych naczyń krwionośnych są albo trudno dostępne (w przypadku tkanki aorty), albo pochodzą z tkanki noworodka o potencjalnie różnej fizjologii i narażeniu środowiskowym9. Wykorzystanie komórek śródbłonka wyizolowanych z tkanki pobranej podczas implantacji CIED pozwala na badanie i eksperymentowanie z fizjologią komórkową w określonych rzeczywistych grupach pacjentów. CIED są wszczepiane w różnych wskazaniach, w tym u pacjentów z bradyarytmią, niewydolnością serca oraz prewencją pierwotną i wtórną tachyarytmii komorowych10. Pacjenci ci często cierpią na wiele chorób współistniejących, w tym cukrzycę, otyłość i chorobę wieńcową, które są głównym globalnym celem badań sercowo-naczyniowych 11,12,13. Ponadto, chociaż dane ilustracyjne w tym artykule odnoszą się do pacjentów kontrolnych, zastosowaliśmy te techniki do wyizolowania i zbadania SATMVEC od szeregu pacjentów, w tym tych z zaawansowaną niewydolnością serca i / lub cukrzycą typu 2.

Nierzadko spotykamy się z problemami ze słabymi wynikami hSATMVEC po próbie izolacji komórek. Ryzyko to można znacznie zmniejszyć, stosując większą początkową objętość SAT do izolacji hSATMVEC. Ponadto spotykamy się z tym częściej w SAT u osób z chorobami kardiometabolicznymi, a w szczególności z cukrzycą.

Jednym z ograniczeń tej techniki jest to, że izolowany hSATMVEC może przejść tylko ograniczoną liczbę pasaży. Z naszego doświadczenia wynika, że po pasażu 5, niezależnie od fenotypu pacjenta, proliferacja hSATMVEC znacznie zwalnia. Ponadto hSATMVEC wyizolowany przy użyciu tej techniki nie namnaża się dobrze, gdy jest zbyt słabo zaludniony; dlatego zalecamy, aby nie przechodzić hSATMVEC w stosunku większym niż 1:6. jak wspomniano na stronie 1. Udało nam się rozmrozić i ożywić hSATMVEC przechowywany w ciekłym azocie przez okres do 4 lat, a z naszego doświadczenia wynika, że szansa na reanimację jest większa, gdy kriokonserwuje się go przy niższej liczbie pasaży (zwykle krioprezerwujemy hSATMVEC przy pasażu 2).

Tkanka pobrana podczas insercji CIED jest swobodnie dostępna i może być pobrana bez szkody dla pacjenta. Dlatego łatwo dostępne, stosunkowo nieinwazyjne źródło komórek śródbłonka z tych grup pacjentów jest bardzo korzystne w prowadzeniu ukierunkowanych badań. Podczas gdy reprezentatywne obrazy w tym artykule pochodzą od pacjentów "kontrolnych" (tj. pacjentów bez rozpoznania niewydolności serca lub cukrzycy, choć ze wskazaniem do implantacji CIED), udało nam się wyizolować, wyhodować i współhodować SATMVEC od pacjentów z niewydolnością serca, cukrzycą i kombinacją tych patologii. Co więcej, techniki te można również zastosować do innych łożysk mikronaczyniowych, w tym mięśni szkieletowych, a obecnie optymalizujemy model przesłuchu MVEC-miocytów mięśni szkieletowych.

hSATMVEC można wyizolować z tkanki ludzkiej pobranej w momencie insercji CIED i mają wystarczającą czystość, aby można je było stosować eksperymentalnie do badania dysfunkcji mikronaczyniowej i wzajemnego oddziaływania komórek śródbłonka i adipocytów u osób z chorobą kardiometaboliczną i bez niej.

Oświadczenia

SS otrzymało wsparcie niefinansowe, honoraria prelegentów i honoraria od AstraZeneca. RC otrzymał honoraria prelegentów od Janssen Oncology. OIB otrzymało honoraria za prelegentów od Novartis.

Podziękowania

Jesteśmy bardzo wdzięczni Wydziałowi Nauk Biologicznych (University of Leeds, Wielka Brytania) za korzystanie z urządzenia do cytometrii przepływowej, które było wspierane przez grant Rady ds. Biotechnologii i Nauk Biologicznych (BBSRC BB/R000352/1). SS był wspierany przez British Heart Foundation Clinical Research Training Fellowship (FS/CRTF/20/24071). CL był wspierany przez stypendium doktoranckie British Heart Foundation (FS/19/59/34896). LDR był wspierany przez nagrodę Diabetes UK RD Lawrence Fellowship (16/0005382). RMC było wspierane przez British Heart Foundation Intermediate Clinical Research Fellowship (FS/12/80/29821). MTK jest profesorem British Heart Foundation w dziedzinie badań nad układem sercowo-naczyniowym i cukrzycą (CH/13/1/30086) oraz posiada grant programowy British Heart Foundation (RG/F/22/110076)

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
170L CO2 InkubatorGS Biotech170G-014
2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo)Amino)-2-Deoksyglukoza)InvitrogenN13195
4% PARAFIX buforowany histologiczny utrwalaczVWR ChemicalsPRC/R/38/1
Akt (tAkt) Królik  1:1000Technologia sygnalizacji komórkowej9272
BD Venflon Pro Safety 14 g x 45 mm, Pomarańczowy, 50/opkMedisave393230
Roztwór albuminy surowicy bydlęcej, 7,5%MerckA8412-100ML
CD144 ( VE-Cadherin) Przeciwciało, anty-ludzkie, PE, REAfinityMiltenyi Biotec130-118-495
CD31 Przeciwciało, anty-ludzkie, PerCP-Vio 700, REAfinityMiltenyi Biotec130-110-811
CD31 MicroBead Kit, człowiek, 1 zestawMiltenyi Biotec130-091-935
CD45 Przeciwciało, antyludzkie, FITC, REAfinityMiltenyi Biotec130-110-769
Ekstrakcja komórek Wirówka doFNN0011Invitrogen
5804 REppendorf
Click-iT EdU do obrazowania, barwnik Alexa Fluor 488Zestaw do obrazowania proliferacji komórekInvitrogenC10337
Kolagenaza / Dyspaza, 500 mgRoche/Merck11097113001
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Macierz błony podstawnejCorning 354230Matryca membrany podstawnej
Corning 100 mm Naczynie hodowlane z powłoką TCCorning 
Costar 24-dołkowe, przezroczyste płytki wielodołkowe nasączone TC, indywidualnie pakowane, sterylnekordoning 3526
Costar 6-dołkowe, przezroczyste płytki wielodołkowe z powłoką TC, indywidualnie pakowane, sterylnekordonowanie 3516
CytoFLEX S – 4 Cytometr laserowyBeckman
Zestaw do usuwania martwych komórekMiltenyi Biotec130-090-101
Dulbecco′ s Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiMerckD8537-500ML
EASYssitko Sito komórkowe do probówek 50 mL, 70 &mikro; m siatka, Niebieska, sterylna, 50/pkGreiner Bio-One542070
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka MVPromoCellC-22020
Mikroprobówki Eppendorf Safe-LockMerckEP0030120094
Roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowegoMerckE8008-100ML
Falcon 24 Well TC-Treated Cell Polistyrenowa przepuszczalna płyta nośna, z pokrywką, Sterylne, 1/opakowanie, 50/skrzynkaAppleton WoodsCF537
Falcon Permeable Support do płytki 24-dołkowej z 0,4 i mikro; m Przezroczysta membrana PET, sterylna, 1/opakowanie, 48/opakowanieAppleton WoodsCF521
Zamrażalnik Cryo-SFMPromoCellC-29912
Roztwór żelatyny, 2% w wodzieMerckG1393-100ML
Gibco Antybiotyk-Antybiotyk (100x), 100mLFisher Scientific11570486
Gibco TrypLE Select Enzyme (1x), bez czerwieni fenolowejFisher Scientific
Hanks′ Zrównoważony roztwór soliMerckH6648-500ML
Ludzkie podskórne komórki preadipocytówLonzaPT-5020
Incucyte ZOOMEssen BioScienceSystem analizy żywych komórek
Roztwór insuliny ludzkiMerckI9278-5ML
LS Kolumny, 25/pkMiltenyi Biotec130-042-401
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Roztwór do przechowywania tkanek MACSMiltenyi Biotec130-100-008
MACSmix Rotator rurowyMiltenyi Biotec130-090-753Rotator rurowy
MS, 25/pkMiltenyi Biotec130-042-201
NuPAGE 4– 12% Bis-tris GelInvitrogenNP0322BOX
OctoMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-109
PGM-2 Preadipocyte Growth Medium-2 BulletKitLonzaPT-8002
Phospho (Ser1177) eNOS Rabbit 1:1000Technologia sygnalizacji komórkowej9570
Phospho-Akt (Ser473) Rabbit  1:1000Technologiasygnalizacji komórkowej4060
Filtry do separacji wstępnej 30 i mikro; m, 50/pkMiltenyi Biotec130-041-407
Roztwór do barwienia jodku propidyny (PI)/RNazyTechnologia sygnalizacji komórkowej4087
Separator QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
Skalpel jednorazowy sterylny styl 10VWRI501
Tubka z nakrętką, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, z nadrukiemSarstetd62.554.502
Nakrętka tubka, 50 ml, (LxØ): 114 x 28 mm, PP, z nadrukiemSarstedt62.547.254
Tubka z nakrętką, 50 ml, (LxØ): 114 x 28 mm, PP, z nadrukiemSarstetd62.547.254
Total eNOS Mouse 1:1000BD Biosciences610297
Triton X-100, BioUltra, do biologii molekularnejMerck93443-500ML
β-Aktyna (C4) Mysz 1:5000Santa Cruz Biotechnologia  SC-47778
Buffer Zestaw do proliferacji komórek 5805000060 43016712563029

Bibliografia

  1. Bierhansl, L., et al. Central role of metabolism in endothelial cell function and vascular disease. Physiology. 32 (2), 126-140 (2017).
  2. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), a006429(2012).
  3. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int J Biol Sci. 9 (10), 1057-1069 (2013).
  4. Brown, O. I., Bridge, K., Kearney, M. T. Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases in glucose homeostasis and diabetes-related endothelial cell dysfunction. Cells. 10 (9), 2315(2021).
  5. Luk, C., Haywood, N. J., Bridge, K. I., Kearney, M. T. Paracrine role of the endothelium in metabolic homeostasis in health and nutrient excess. Front Cardiovasc Med. 26 (9), 882923(2022).
  6. Click-iT EdU Imaging Kits. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Fmp10338.pdf (2024).
  7. Bouïs, D., et al. Endothelium in vitro: A review of human vascular endothelial cell lines for blood vessel-related research. Angiogenesis. 4 (2), 91-102 (2001).
  8. Ades, E. W., et al. HMEC-1: establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. J Invest Dermatol. 99 (6), 683-690 (1992).
  9. Chi, J. T., et al. Endothelial cell diversity revealed by global expression profiling. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (19), 10623-10628 (2003).
  10. Brignole, M., et al. 213 ESC Guidelines on cardiac pacing and cardiac resynchronization therapy. Eur Heart J. 34 (29), 2281-2329 (2013).
  11. Greenspon, A. J., et al. Trends in permanent pacemaker implantation in the United States from 1993 to 2009: Increasing complexity of patients and procedures. J Am Coll Cardiol. 60 (16), 1540-1545 (2012).
  12. Prioritized Research Agenda for Prevention and Control of Noncommunicable Diseases. Mendis, S. A., Alwan, A. , World Health Organization. Geneva. (2011).
  13. Brown, O. I., et al. Relationship among diabetes, obesity, and cardiovascular disease phenotypes: A UK biobank cohort study. Diabetes Care. 46 (8), 1531-1540 (2023).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

kom rki r db onka tkanki t uszczowejkom rki r db onka mikro naczyniowegoizolacja kom reksortowanie za pomoc kulek magnetycznychmodel kokulturyr nicowanie kom rekcytometria przep ywowaangiogenne tworzenie cewek

Powiązane artykuły