Skuteczność terapeutyczna lasera ekscymerowego 308 nm połączonego z matriną w bielactwie poprzez modulację immunoglobuliny w surowicy i cytokiny zapalne

Podsumowanie

Połączenie lasera ekscimerowego o średnicy 308 nm i matryny jamy ustnej znacznie poprawiło repigmentację bielactwa poprzez promowanie regeneracji melanocytów i przywracanie równowagi odpornościowej. Ta terapia dwumodalna zmniejszyła liczbę cytokin prozapalnych, znormalizowała immunoglobuliny, podniosła IL-10 i osiągnęła wyższą skuteczność kliniczną przy doskonałym bezpieczeństwie i tolerancji pacjentów.

Streszczenie

Bielactwo to przewlekłe autoimmunologiczne zaburzenie depigmentacyjne, charakteryzujące się utratą funkcjonalnych melanocytów oraz nieprawidłową aktywacją immunologiczną. Pomimo postępów w fototerapii, odpowiedzi kliniczne pozostają niespójne, głównie z powodu utrzymującej się aktywności zapalnej i niewystarczającej regulacji odporności. Badanie to badało skuteczność terapeutyczną oraz mechanizmy immunologiczne łączenia fototerapii laserem ekscymerowym 308 nm z matryną doustną, naturalnym alkaloidem o właściwościach przeciwzapalnych i immunoregulacyjnych. Łącznie 232 pacjentów z niesegmentalnym bielactwem zostało prospektywnie przydzielonych do otrzymania monoterapii laserem ekscymerowym lub terapii skojarzonej przez 12 tygodni. Poprawę kliniczną oceniono za pomocą Indeksu Oceny Obszaru Bielactwa (VASI), a immunoglobuliny i cytokiny w surowicy przeanalizowano w celu oceny ogólnoustrojowej modulacji immunologicznej. Oba schematy wywołały znaczącą repigmentację, jednak terapia skojarzona przyniosła wyraźniejsze zmniejszenie VASI (z 9,72 ± 3,24 na początku do 5,76 ± 2,18 po leczeniu) niż sam laser ekscymerowy (z 9,68 ± 3,37 do 6,63 ± 2,34, s. < 0,001). Odsetek pacjentów wykazujących doskonałą lub dobrą repigmentację był wyraźnie wyższy przy łączonym reżimie (76,7%) w porównaniu do monoterapii (58,7%). Równolegle poziomy IgG w surowicy znacznie spadły (13,72 ± 2,64 g/L do 11,85 ± 2,18 g/L, p < 0,001), podczas gdy poziomy IgA wzrosły nieznacznie (2,07 ± 0,68 g/L do 2,23 ± 0,61 g/L, p = 0,041). Cytokiny prozapalne, w tym IFN-γ i IL-17, były istotnie obniżone ( zarówno p< 0,001), podczas gdy przeciwzapalne IL-10 wzrosły z 8,3 ± 3,2 do 12,9 ± 3,5 pg/mL (p < 0,001). Poprawa VASI koreluje odwrotnie do zmian IFN-γ (r = –0,482, p < 0,05) i IL-17 (r = –0,451, p < 0,001), a dodatkowo z podniesieniem IL-10 (r = 0,503, p < 0,001). Wyniki te pokazują, że matryna zwiększa skuteczność lasera ekscymerowego poprzez wspieranie regeneracji melanocytów i przywracanie równowagi immunologicznej, ustanawiając strategię dualnej modalności opartą na biomarkerach dla precyzyjnego i trwałego leczenia bielactwa.

Wprowadzenie

Bielactwo to przewlekłe, nabyte zaburzenie skóry odbarwiającej, charakteryzujące się selektywnym niszczeniem lub dysfunkcją melanocytów naskórka, prowadzącym do rozwoju dobrze zdefiniowanych białych plamek o zmiennej wielkości i rozmieszczeniu. Dotyka około 0,5%–2% populacji światowej, bez względu na płeć czy rasę, i często objawia się przed ukończeniem 30 lat ^1,2. Chociaż choroba nie zagraża życiu, nakłada na siebie znaczne obciążenie psychospołeczne i emocjonalne, znacząco obniżając poczucie własnej wartości, funkcjonowanie społeczne i jakość życia³. Patogeneza bielactwa pozostaje wieloczynnikowa i niedo końca wyjaśniona, obejmująca predyspozycje genetyczne, stres oksydacyjny, reakcje autoimmunologiczne oraz czynniki neurohumoralne⁴. Najnowsze dowody szczególnie podkreślają kluczową rolę dysregulacji odporności zarówno w inicjacji, jak i utrzymaniu się niszczenia melanocytów ^5,6. W epidermie autoreaktywne cytotoksyczne limfocyty T CD8⁺ rozpoznają antygeny melanocytów, takie jak tyrozynaza i gp100, uwalniając perforynę i granzym B, aby wywołać apoptozę⁷. Równocześnie cytokiny prozapalne, w tym interferon-γ (IFN-γ), czynnik martwicy nowotworów-α (TNF-α), interleukina-1β (IL-1β), IL-6 i IL-17, wzmacniają kaskadę zapalną, upośledzają przeżywalność melanocytów i hamują migrację komórek pigmentowych⁸. Nierównowaga między regulatorowymi limfocytami T (Treg) a efektorowymi limfocytami T dodatkowo przyczynia się do utrzymującej aktywacji immunologicznej i utraty melanocytów⁹. Dlatego kluczowe znaczenie kliniczne mają strategie terapeutyczne mające na celu zarówno wspieranie regeneracji melanocytów, jak i przywracanie homeostazy immunologicznej.

Poza lokalnymi nieprawidłowościami immunologicznymi, coraz więcej dowodów wskazuje, że bielactwo jest ogólnoustrojową chorobą autoimmunologiczną. U pacjentów udokumentowano zmienione poziomy immunoglobuliny w surowicy (IgG, IgA i IgM), co odzwierciedla uogólnioną aktywację komórek B oraz nieprawidłową odporność humoralną^10,11. Nieregulowana produkcja immunoglobuliny może ułatwiać tworzenie autoprzeciwciał przeciwko antygenom specyficznym dla melanocytów, pogłębiając uszkodzenia tkanek. Ponadto środowisko cytokinowe u pacjentów z bielactwem często wykazuje podwyższone IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-17 i IL-23, co sugeruje ogólnoustrojową aktywację immunologiczną poza skórą po uszkodzeniu^12,13. Te mediatory immunologiczne nie tylko działają jako czynniki napędzające, ale także korelują z aktywnością choroby i odpowiedzią terapeutyczną, co czyni je potencjalnymi biomarkerami do monitorowania leczenia¹⁴. Dlatego interwencje zdolne do przywrócenia równowagi odpornościowej — poprzez modulację zarówno komórkowej, jak i humoralnej odpowiedzi — mogą przynosić lepsze i trwałe wyniki kliniczne. Pomimo dostępności miejscowych kortykosteroidów, inhibitorów kalcineuriny, układowych leków immunosupresyjnych oraz fototerapii, skuteczność leczenia pozostaje niezadowalająca dla wielu pacjentów, zwłaszcza tych z chorobą rozwiniętą lub oporną¹⁵. W konsekwencji podejścia kombinowane obejmujące wiele mechanizmów patofizjologicznych zyskały w ostatnich latach na popularności.

Fototerapia od dawna jest fundamentem leczenia bielactwa. Spośród różnych metod, laser ekscymerowy o długości 308 nm (EL) stał się jedną z najbardziej celowanych i skutecznych opcji w leczeniu miejscowego bielactwa^16,17. Dostarcza monochromatyczne promieniowanie UVB na 308 nm bezpośrednio do odbarwionych zmian, stymulując tym samym proliferację i migrację melanocytów z mieszków włosowych, jednocześnie minimalizując ekspozycję otaczającej zdrowej tkanki¹⁸. W porównaniu z konwencjonalnym wąskopasmowym UVB, laser ekscymerowy oferuje zalety w postaci szybkiego rozpoczęcia repigmentacji, krótszego czasu skumulowanej ekspozycji oraz poprawionego profilu bezpieczeństwa^19,20. Mechanistycznie niskodawkowe napromieniowanie 308 nm indukuje lokalną immunomodulację poprzez zmniejszenie aktywności komórek Langerhansa naskórka, zwiększenie infiltracji Treg oraz zwiększenie melanogenezy poprzez zwiększenie wyregulowania tyrozynazy i mikroftalmijnie powiązanego z czynnikiem transkrypcyjnym (MITF)²¹. Jednak odpowiedzi pozostają zmienne, a wielu pacjentów nie osiąga pełnej repigmentacji. Nadmierne lub długotrwałe napromieniowanie może paradoksalnie wywołać uwalnianie cytokin zapalnych — takich jak IL-1β, IL-6 i TNF-α — oraz dalsze uszkodzenie melanocytów^22,23. Tak więc, choć leczenie laserem excimerowym skutecznie stymuluje regenerację melanocytów, jego skuteczność może być ograniczona przez jednoczesną aktywację zapalną. Ta dwoistość podkreśla potrzebę terapii uzupełniających zdolnych do łagodzenia stanu zapalnego i zwiększania odporności immunologicznej podczas fototerapii.

Matryna, naturalny alkaloid chinolizydyny pozyskiwany z Sophora flavescens (Ku Shen), ostatnio zyskał znaczną uwagę jako czynnik immunomodulacyjny i przeciwzapalny o niskiej toksyczności^24,25. Badania eksperymentalne wykazały, że matryny mogą hamować szlaki sygnalizacyjne NF-κB i JAK/STAT, zmniejszać produkcję cytokin prozapalnych (w tym IFN-γ, TNF-α i IL-6) oraz wspierać ekspresję mediatorów przeciwzapalnych, takich jak IL-10-26. W chorobach immunologicznych matrina wykazała skuteczność w modulowaniu różnicowania Th1/Th17, poprawianiu funkcji regulatorowych limfocytów T oraz normalizacji profili immunoglobulinowych^27,28. Ponadto matryna wykazuje działanie antyoksydacyjne i antyapoptotyczne, które może chronić melanocyty przed uszkodzeniami wywołanymi stresem oksydacyjnym²⁹. Chociaż te właściwości czynią matrynę atrakcyjną kandydatką do chorób autoimmunologicznych chorób skóry, niewiele badań badało jej rolę w bielactwie. Połączenie matryny z fototerapią przedstawia nowatorskie podejście terapeutyczne: matryny mogą osłabić mikrośrodowisko zapalne, stabilizować homeostazę melanocytów oraz wzmacniać melanogenezę indukowaną laserowo. Ponadto ogólnoustrojowa aktywność immunoregulacyjna matryny może uzupełniać lokalne efekty lasera ekscymerowego, co skutkuje synergicznymi korzyściami klinicznymi. Z naszej wiedzy nie było żadnego wcześniejszego badania klinicznego kompleksowo badanego łącznego zastosowania lasera ekscymerowego 308 nm i matryny w bielactwie ani nie oceniało jego immunologicznych korelatów za pomocą profilowania biomarkerów surowicowych.

Na podstawie tego uzasadnienia wysunęliśmy hipotezę, że połączenie lasera ekscymerowego 308 nm i matryny przyniesie lepszą skuteczność terapeutyczną w porównaniu z monoterapią laserem ekscymerowym, jednocześnie wspierając regenerację melanocytów i tłumiąc aktywację immunologiczną z zaburzeniami awaryjnymi. Konkretnie postulowaliśmy, że podanie matryn pomocniczej zwiększy częstość repigmentacji klinicznej, moduluje poziom immunoglobuliny w surowicy (IgG, IgA i IgM) w kierunku równowagi fizjologicznej oraz zmniejszy poziom cytokin prozapalnych, takich jak IFN-γ, TNF-α i IL-17, jednocześnie zwiększając poziom cytokin przeciwzapalnych. W tym badaniu systematycznie oceniliśmy wyniki kliniczne, parametry immunologiczne oraz ich korelacje u pacjentów z bielactwem leczonymi tą terapią skojarzoną. Nowość tego badania tkwi w jego podwójnym mechanistycznym skupieniu — lokalnej stymulacji fotobiologicznej i systemowej modulacji odporności — oraz integracji ilościowej analizy biomarkerów w celu wyjaśnienia mechanizmów terapeutycznych. Poprzez wyjaśnienie immunoregulacyjnego wpływu matryny w połączeniu z ukierunkowaną fototerapią, nasza praca ma na celu zapewnienie opartej na dowodach podstaw dla nowego paradygmatu terapeutycznego w leczeniu bielactwa. Ostatecznie te odkrycia mogą posunąć dziedzinę do przodu w kierunku precyzyjnych, immunologicznie sterowanych strategii fototerapii, które osiągają nie tylko repigmentację, ale także długotrwałą stabilizację choroby i zapobieganie nawrotom.

Protokół

Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z zasadami etycznymi Deklaracji Helsińskiej oraz instytucjonalnymi regulacjami regulującymi badania na ludziach. Badanie przeprowadzono zgodnie z zasadami etycznymi Deklaracji Helsińskiej i zatwierdzono przez Komisję Etyczną Szpitala Ludowego Xingtai, Oddział Dermatologii (ID zatwierdzenia: 2021[029]). Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną świadomą zgodę przed udziałem.

Selekcja pacjentów
W ciągu 3 lat, od stycznia 2021 do grudnia 2023, od stycznia 2021 do grudnia 2023 roku przyjęto do szpitala 232 pacjentów z kliniczną diagnozą bielactwa. U wszystkich uczestników zdiagnozowano niesegmentalne bielactwo (typ uogólniony lub lokalny) i sklasyfikowano ich jako stabilne lub postępujące na podstawie braku lub obecności nowych zmian w ciągu 3 miesięcy przed wstąpieniem do programu. Czas trwania choroby i rozmieszczenie zmian zostały zarejestrowane na początku. Kryteria zapisu obejmowały osoby w wieku od 18 do 65 lat z białactwem stabilnym lub postępującym potwierdzonym przez dermatologów za pomocą badań klinicznych, oświetlenia lampy Wooda oraz dermoskopii. Kryteria wykluczenia to ciąża, laktacja, zaburzenia fotoalergiczne, ogólnoustrojowa choroba autoimmunologiczna, ciężka dysfunkcja wątroby lub nerek oraz wcześniejsze stosowanie ogólnoustrojowych kortykosteroidów, leków immunosupresyjnych lub fototerapii w ciągu 3 miesięcy. Wszystkie procedury były wykonywane pod ciągłym nadzorem etycznym, zapewniając pacjentowi komfort i bezpieczeństwo przez cały czas leczenia.

Przegląd badania i sposób leczenia
Ogólny przebieg badania, obejmujący rejestrację pacjentów, przydział grupowy, oceny kontrolne oraz analizę biomarkerów, został zilustrowany na Rysunku 1. Kwalifikujący się uczestnicy zostali przydzieleni w stosunku 1:1 do jednej z dwóch równoległych grup badawczych: grupy monoterapii laserem ekscimerowym 308 nm (sam laser ekscimerowy; n = 116) oraz grupy terapii skojarzonej (laser ekscymerowy 308 nm plus matrina ustna; n = 116). Przydział grupowy przeprowadzono za pomocą komputerowej losowej sekwencji przygotowanej przez niezależnego pracownika badawczego, który nie brał udziału w ocenie wyników; Zadania były umieszczane w sekwencyjnie numerowanych, zapieczętowanych kopertach i otwierane po zapisie w celu ustalenia przydziału leczenia. Przepływ pracy terapeutycznej składał się z trzech głównych faz: (1) oceny i dokumentacji wyjściowej, (2) 12 tygodni aktywnego leczenia zgodnie z wyznaczonym schematem oraz (3) oceny po leczeniu, w tym badań laboratoryjnych immunoglobulin w surowicy i cytokin zapalnych. Każdy pacjent otrzymał ustandaryzowany plan opieki, identyczne interwały obserwacyjne oraz jednolite procedury analizy laboratoryjnej. Zdjęcia kliniczne i ocenę VASI wykonali dermatolodzy nieświadomi przydziału leczenia. Wszystkie zabiegi wykonywano w sali fototerapii dermatologicznej Szpitala Ludowego w Xingtai w kontrolowanych warunkach otoczenia (temperatura pokoju 22–24 °C, wilgotność względna 40%–60%).

Przygotowanie obszaru leczenia
Przed każdą sesją laserową docelowe odbarwione obszary były delikatnie czyszczone sterylną solą fizjologiczną i osuszane gazą medyczną bez kłaczków. Zbadano skórę z uszkodzeniami, aby potwierdzić brak infekcji, wyrzucenia lub skorupy. Gdy podczas jednej wizyty leczyono więcej niż jedną zmianę, każda zmiana była przygotowywana i leczona kolejno. Zmiany przekraczające pojedyncze pole napromieniowania dzielono na sąsiednie pola napromieniowania, a otaczająca normalna skóra była osłonięta nieprzezroczystą folią blokującą UV dla każdego pola, aby zminimalizować niepotrzebne narażenie. Pacjentom zalecono unikanie środków miejscowych, fotouczulających kosmetyków lub perfum przez 24 godziny przed zabiegiem. Zarówno pacjent, jak i operator nosili okulary ochronne przez cały czas trwania zabiegu.

Procedura napromieniowania laserem ekscymerowym o średnicy 308 nm
Zastosowano monochromatyczny system laserowy z ksenonowo-chlorkiem (XeCl) o średnicy 308 nm. Wszystkie sesje laserowe były wykonywane przez dwóch wykwalifikowanych dermatologów według ustandaryzowanego protokołu, aby zapewnić stałą produkcję energii, odległość napromieniowania oraz powtarzalność. Wyjście urządzenia było weryfikowane za pomocą skalibrowanego miernika mocy UV przed każdym dniem zabiegu, a wszystkie systemy były cotygodniowo kalibrowane przez certyfikowanego technika, aby utrzymać margines błędu poniżej ±5%. Przed pierwszym napromieniowaniem minimalną dawkę rumienia (MED) dla każdego pacjenta określano poprzez stopniowe dawki (100–400 mJ/^cm2) na małych obszarach testowych na wewnętrznej stronie przedramienia i ocenę reakcji rumieniaka po 24 godzinach; Wyniki były fotografowane i zapisywane w kartach pacjentów. Reprezentatywna dokumentacja MED oraz tabela dawkowo-dostosowująca dla sesji są dostępne w Tabeli Uzupełniającej 1. MED został zdefiniowany jako najniższa dawka testowa, która powoduje wyraźnie widoczny, jednolity rumień po 24 godzinach. Początkowa dawka leczenia była ustalana na poziomie 80%–90% indywidualnego MED, a kolejne zmiany dawki stosowano według wcześniej zdefiniowanego algorytmu opartego na 24-godzinnej reakcji rumienia przed sesją (zwiększenie o 10%–20% przy nieobecnym lub łagodnym rumieniu, utrzymanie tej samej dawki przy umiarkowanym rumianie i zmniejszenie o 10%–20% przy pęcherzach lub silnym bólu). Początkowa dawka terapeutyczna została ustalona na 150–250 mJ/cm^² (około 80%–90% indywidualnego MED). Każda sesja rozpoczynała się od wygodnego siedzenia pacjenta na regulowanym krześle. Rękopis laserowy trzymano prostopadle (90°) do skóry w odległości 10–15 cm, a pola promieniowania okrągłego lub prostokątnego były wyrównane tak, aby całkowicie pokryć odbarwione obszary przy minimalnym nakładaniu się. Napromieniowanie trwało 1–3 sekundy na jedno pole ekspozycji, w zależności od płynności. Dawki były następnie zwiększane o 10%–20% na sesję zgodnie z wcześniejszą odpowiedzią rumieniacą; jeśli wystąpiła umiarkowana rukieć, poprzednia dawka była utrzymywana, natomiast pęcherze lub ból wymagały zmniejszenia o 10%–20%. Maksymalna dawka nie przekraczała 2 000 mJ/^cm2. Każda sesja obejmowała wszystkie widoczne zmiany i trwała 10–20 minut, w zależności od zakresu. Zabiegi wykonywano 2 razy w tygodniu, z co najmniej 72 godzinami przerwy między sesjami w łącznym okresie 12 tygodni (24 sesje). Po napromieniowaniu nałożono cienką warstwę sterylnego żelu na bazie aloesu, aby złagodzić miejscowe runienie. Pacjentom zalecono unikanie ekspozycji na słońce przez 48 godzin oraz stosowanie kremu z filtrem o szerokim spektrum (SPF >30) przez cały czas trwania leczenia. Zmiany o >50% repigmentacji utrzymywały się przy tych samych parametrach aż do osiągnięcia stabilnej pigmentacji.

Administracja matryn ustnych
W grupie kombinowanej przygotowano jałowy ekstrakt wodny korzeni Sophora flavescens zgodnie z Chińską Farmakopeją (wydanie 2020)³⁰ i ustandaryzowano do stężenia 5 mg/mL o czystości ≥98%, zweryfikowanej za pomocą wysokowydajnej chromatografii cieczowej (HPLC). Roztwór przechowywano w temperaturze 4 °C w bursztynowych butelkach, aby zapobiec fotodegradacji. Losowe testy partiowe potwierdziły stężenie alkaloidów (5± 0,3 mg/mL) oraz bezpłodność mikroorganizmów. Każdy pacjent otrzymywał roztwór matrynowy doustnie w dawce 0,3 g (60 mL) dwa razy dziennie przez 12 tygodni, synchronizując się z harmonogramem leczenia laserowego. Dawka została dobrana na podstawie wcześniejszych danych farmakologicznych wykazujących skuteczną immunomodulację z korzystnym profilem bezpieczeństwa w przewlekłych dermatozach zapalnych^31,32. Pacjenci zostali zainstruowani, aby przyjmować roztwór 30 minut po posiłkach, aby zminimalizować dyskomfort żołądkowo-jelitowy oraz unikać alkoholu, mocnej herbaty i ostrych potraw podczas terapii, aby zmniejszyć obciążenie wątrobą. Łagodne nudności lub zmęczenie łagodzono podaniem niewielkiej ilości ciepłej wody. Przestrzeganie leczenia oceniano za pomocą dziennika leków oraz weryfikacji powrotu butelki podczas każdej wizyty kontrolnej. Bezpieczeństwo oceniano podczas każdej wizyty poprzez uporządkowane badania objawów i dokumentację działań niepożądanych, w tym dyskomfortu przewodu pokarmowego, zmęczenia oraz wszelkich oznak wskazujących na nietolerancję wątroby. W okresie obserwacji nie dopuszczono dodatkowych leków ogólnoustrojowych, miejscowych kortykosteroidów ani immunosupresantów, aby zapobiec zakłócającym efektom.

Ocena odpowiedzi klinicznej
Zmiany pigmentacji oceniono na początku oraz w tygodniach 4, 8 i 12 przez dwóch doświadczonych dermatologów, którzy nie znali informacji o leczeniu. Standaryzowane zdjęcia cyfrowe wykonano przy identycznym oświetleniu i ustawieniach aparatu (odległość 60 cm, ekspozycja 1/60 s, ISO 200). Stopień repigmentacji został zmierzony za pomocą Wskaźnika Oceny Obszaru Bielactwa (VASI). Zmiany zmiany zostały dodatkowo ocenione na cztery kategorie: Doskonałe (≥75% repigmentacja), Dobre (50%–74%), Umiarkowane (25%–49%), Słabe (<25%). Pacjenci wypełnili także 10-punktową skalę wizualnych analogów (VAS) dla satysfakcji i złagodzenia objawów. Podczas każdej wizyty dokumentowano niepożądane zdarzenia, takie jak rumieniat, pieczenie, świąd, pęcherze i przebarwienia.

Pobieranie próbek surowicy
Do analizy biomarkerów pobierano krew obwodową na czo (5 mL) od każdego pacjenta na początku badania oraz pod koniec 12. tygodnia za pomocą probówek rozdzielających surowicę. Próbki pozostawiano do zakrzepnięcia przez 30 minut w temperaturze pokojowej i wirowano w 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Surowica supernatantowa była alicytatowana do kriovialów o pojemności 0,5 mL i przechowywana w temperaturze −80 °C do czasu analizy. Wszystkie próbki zostały przetworzone w ciągu 2 godzin od pobrania, aby zminimalizować degradację cytokin.

Ilościowa identyfikacja immunoglobuliny w surowicy
Stężenia IgG, IgA i IgM w surowicy zostały określone za pomocą zautomatyzowanej immunonefelometrii zgodnie z instrukcjami producenta. Krzywe kalibracyjne przygotowywano przy użyciu seryjnego rozcieńczania standardów referencyjnych. Każdy test zawierał surowicę kontrolną jakości w wysokich i niskich stężeniach. Pomiary wyrażano w g/L i powtarzano 2 razy, aby zapewnić zmienność wewnątrz testu < 5%. Precyzja i kalibracja instrumentu były weryfikowane codziennie za pomocą standardów sterowania możliwych do śledzenia. Wyniki były rejestrowane elektronicznie i przeglądane przez dwóch niezależnych techników, którzy nie znali informacji o pacjencie.

Pomiar cytokin zapalnych
Profilowanie cytokinowe obejmowało IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17 i IL-10, ilościowo zidentyfikowane za pomocą platformy multiplex enzymatycznie powiązanej z immunosorbentem (ELISA). Przygotowanie odczynników przebiegało według standardowego protokołu producenta. Krótko do każdej dołki pokrytej przeciwciałami dodano 100 μL rozcieńczonej surowicy i inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Po przemyciu solą fizjologiczną z buforem fosforanowym zawierającym 0,05% Tween-20 (PBST) dodano 100 μL biotynowo-indykowanego przeciwciała wykrywającego i inkubowano przez 1 godzinę. Następnie studnie inkubowano z peroksydazą streptawidyny-chrzanu przez 30 minut, a następnie wywoływano kolor na podłożu tetrametylobenzydynowym (TMB) przez 10 minut w ciemności. Reakcję zatrzymano przy użyciu 50 μL kwasu siarkowego o stężeniu 2 mol/L, a absorpcję zmierzono na poziomie 450 nm za pomocą czytnika mikropłyt. Krzywe standardowe były generowane z szeregowych rozcieńczeń rekombinowanych cytokin, a stężenia wyrażano jako pg/mL. Wszystkie próbki były mierzone w duplikacie. Aby zapewnić powtarzalność, współczynnik zmienności między testami (CV) utrzymywano poniżej 10%. Puste dołki zawierały bufor testowy bez surowicy, a doły kontrolne zawierały matrycę wolną od cytokin przetwarzaną identycznie jak próbki i równoważną standardowi 0 pg/mL, aby potwierdzić specyficzność testu. Wszelkie próbki hemolizowane lub lipemiczne zostały wykluczone z ostatecznej analizy.

Analiza statystyczna
Dane były wprowadzane do dedykowanej elektronicznej bazy danych i weryfikowane pod kątem dokładności przez dwóch niezależnych menedżerów danych. Wielkość próby oszacowano na podstawie oczekiwanego rozmiaru efektu (d Cohena = 0,5) z α = 0,05 i mocą (1–β) = 0,8, co dało minimum 100 uczestników na grupę. Aby kontrolować wielokrotne porównania cytokin, zastosowano korektę Bonferroniego tam, gdzie było to stosowne. Zastosowano wielowymiarową regresję liniową tam, gdzie było to konieczne, aby uwzględnić potencjalne czynniki zakłócające, takie jak wiek, płeć, czas trwania choroby oraz obszar zmiany wyjściowej. Rozkład normalny zmiennych ciągłych został zweryfikowany za pomocą testu Shapiro–Wilka. Statystyki opisowe przedstawiano jako średnią ± odchylenia standardowego (SD) dla danych rozkładu normalnego lub jako mediana (zakres interkwartylowy, IQR) dla danych skośnych. Zmiany przed i po leczeniu analizowano za pomocą testów t w parach, natomiast porównania między grupami analizowano za pomocą testów t z niezależnej próby lub testów Mann–Whitney U, w zależności od stosowności. Dane kategoryczne porównano z chi-kwadratem lub testem dokładnym Fishera. Korelacje między poziomami cytokin, immunoglobulinami a poprawą pigmentacji oceniano za pomocą współczynnika korelacji Pearsona. Wszystkie analizy przeprowadzono z użyciem SPSS v26.0 (RRID: SCR_002865), a statystycznie uznano dwustronne p < 0,05.

Wyniki

Podstawowe cechy kliniczne wykazały porównywalne profile demograficzne i choroby między grupami
Łącznie 232 pacjentów z niesegmentalnym bielactwem zostało włączonych i równomiernie przydzielonych do grupy ekscimerowej (n = 116) lub grupy terapii skojarzonej otrzymującej laser plus matrina oralna (n = 116). Parametry demograficzne i kliniczne bazowe, w tym wiek (35,8 ± 6,0 vs. 35,4 ± 5,6 lat), rozkład płci (mężczyźni/kobiety: 59/57 vs. 59/57), czas trwania choroby (4,8 ± 1,0 vs....

Dyskusja

Badanie to wprowadza połączone podejście terapeutyczne, integrujące laser ekscymerowy o średnicy 308 nm z matryną jamy ustnej do leczenia bielactwa niesegmentalnego. Główną tezą jest to, że podwójna modulacja — lokalna fotobiologiczna stymulacja melanocytów w połączeniu z systemową immunoregulacją — może zapewnić bardziej odporną i długotrwałą repigmentację niż grupa ekscymerowa. Wyniki potwierdzają tę hipotezę: terapia skojarzona spowodowała wcześniejsze pigmentacje okołopęcherzykowe, większą redukcję VASI oraz wyższą s...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System laserowy XeCl XeCl 308 nm	STRATA Skin Sciences (XTRAC)	Velocity 400 (model)	Ukierunkowany laser UVB o średnicy 308 nm na zmiany bielacza; Sprawdź model na swojej stronie; lub równoważne urządzenie
– 80 i stopni; C Ultra-Low Freezer	Thermo Scientific	Seria Forma 900 (Model 980)	Długoterminowe przechowywanie surowicy
Płytki ELISA z 96 dołkami (wysokie wiązanie)	Corning Costar	9018	Jeśli używasz wewnętrznych powłok lub workflow single-plex
Regulowany fotel medyczny	Środek	641 Przewodniczący Procedur	Ustawianie pacjenta dla stałej odległości napromieniowania
Żel kojący na bazie aloesu	3M	9236	Cienka warstwa po napromieniowaniu dla ulgi w rumieniu; lub równoważny żel medyczny
Bursztynowa szklana butelka (500 mL)	Fisherbrand	02-897-2J	Przechowywanie chronione przed światłem w kątach 4 i stopnie; C jak rozwiązanie matrynowe
Analityczna waga (0,1 mg)	METTLER TOLEDO	ME104E	Przygotowanie grawimetryczne i kontrola jakości
Automatyczny immunonefelometr	Siemens Healthineers	BN ProSpec System	Ilościowo określa IgG/IgA/IgM według producenta' S IFU
Etykiety kodów kreskowych (bezpieczne dla krio)	Zróżnicowana biotechnologia	CRY-1000	Śledzenie próbek i łańcuch dowodowy
Zestaw przeciwciał wykrywających biotynęlowe	MSD	Dołączone z panelem	Dopasowywanie do wychwytywania przeciwciał
Szerokospektralny krem przeciwsłoneczny SPF ≥ 30	Neutrogena	070501017052 (Ultra Sheer SPF 50)	Fotoochrona po sesji; Przedmiot poradnictwa ambulatoryjnego
Kalibratory immunoglobuliny	Siemens Healthineers	Standard białkowy N SL	Kalibracja śledzona do nefelometrii
Sera kontrolna (wysoka/niska) do testów Ig	Siemens Healthineers	Kontrola N/T Protein	Dzienna kontrola jakości przebiegów nefelometrycznych
Fiolki kriogeniczne, 0,5 mL	Termonaukowy Nunc	375418	alikwoty w serumie; wątek zewnętrzny; Wolne od DNazy/RNazy
Dermatoskop	DermLite	DL4	Polaryzacyjny dermatoskop ręczny do badania zmian
Karta skali dermoskopii i fotografii	3Gen	Karta referencyjna skali/kolorów	Zapewnia spójność kolorów w różnych punktach czasowych
Aparat cyfrowy do standaryzowanych obrazów	Kanon	EOS 80D	Stała odległość 60 cm; ekspozycja 1/60 s; ISO 200; Polecam statyw
Chłodnicza wirówka o stałym kącie chłodzenia	Eppendorf	5810 R	800 i razy; g, 10 min, 4 i stopnie; Separacja surowicy C
Kolumna HPLC (C18, 4,6&krat; 250 mm, 5 i mikro; m)	Agilent	ZORBAX Eclipse Plus C18, 959990-902	Rutynowe rozdzielanie alkaloidów; lub równoważny
HPLC System	Agilent	1260 Infinity II (G7111B)	Weryfikacja czystości i standardyzacja wsadowa matryn
Analiza / pomiar obrazu	ImageJ (NIH)	1,54 (RRID:SCR_003070)	Opcjonalna ilościowa identyfikacja obszaru zmian na podstawie fotografii
Bezkłaczkowa gaza medyczna (sterylna)	Johnson & Johnson	546112	Suszenie obszaru po oczyszczeniu
Matrine (≥ 98%, HPLC)	MedChemExpress	HY-N0156	Przygotowanie roztworu doustnego; Zweryfikowaj zgodność lokalnych dostawców i farmakopei
Czytnik mikropłyt (450 nm)	BioTek (Agilent)	Synergia H1	Absorpcja przy 450 nm; Korekcja długości ścieżki
Podkładka mikropłytowa	BioTek (Agilent)	ELx405	Automatyczne cykle mycia; zmniejsza zmienność
Panel Multiplex Human Cytokine (niestandardowy 6-plex)	Odkrywanie na skali meso (MSD)	Platforma U-PLEX (K15067L)	Obejmuje IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17A, IL-10; lub równoważny
Tablety PBS	Gibco	18912-014	Przygotowanie PBS do płukania/buforów
Filmy do uszczelniania płyt	Bio-Rad	MSB1001	Zapobiega parowaniu podczas inkubacji
Ochronne gogle UV (operator)	Uvex (Honeywell)	S0360X Ultra-Spec 2000	Ochrona oczu operatora; Użyj dedykowanej pary
Ochronne okulary UV (pacjent)	Uvex (Honeywell)	S0360X Ultra-Spec 2000	Okulary blokujące UV dla bezpieczeństwa pacjenta podczas napromieniowania
Rurki separacyjne do serum (SST II Advance)	BD Vacutainer	367955	Pobieranie krwi na czczo na początku i w 12. tygodniu
Oprogramowanie statystyczne	IBM	SPSS Statystyki v26.0 (RRID:SCR_002865)	Analiza danych pierwotnych dla protokołu
Bezpłodna sól fizjologiczna (0,9%)	Baxter	2B1324 (500 mL)	Oczyszczanie zmian przed każdą sesją laserową
Stop Solution (2 M H2SO4)	Sigma-Aldrich	258105	Zatrzymuje reakcję TMB
Streptavidyna-HRP	Thermo Scientific	N100	Czynnik wykrywający; Kompatybilność z zestawem
Podłoże TMB (ELISA)	Thermo Scientific	34028	Rozwój chromogeniczny; 10 minut w ciemności
Statyw z Oznacznikiem Odległości	Manfrotto	MKCOMPACTLT-BK	Utrzymuje stałą odległość między aparatem a obiektem
Tween-20 (dla PBST 0,05%)	Sigma-Aldrich	P1379	Powierzchniowo czynny środek buforowy płukania
Radiometr UV / miernik mocy	Międzynarodowe Technologie Światła	ILT2400	Do codziennej weryfikacji wyników i testów MED; z detektorem SED240/NS254 lub odpowiednikiem
Przezroczysta tkanina/oprawa blokująca UV	Thorlabs	Tkanina zaciemniająca BK5	Osłony otaczające normalną skórę, aby uniknąć niezamierzonego narażenia; lub równoważny
Arkusze punktacji VASI (drukowane)	Wewnątrz	NA-VASI-2025	Standaryzowane formularze oceny klinicznej; archiwum z identyfikatorem podmiotu
Wood' Lampa s (UV-A, 365 nm)	Spektrolina	ENF-260C	Diagnostyka kliniczna i ocena krawędzi zmiany
Wood' Osłona osłony lampy	DermLite	DL Hood	Poprawia kontrast podczas badania UV-A