Wizualizacja uwalniania dopaminy w pojedynczych zakończeniach presynaptycznych za pomocą FFN

Fluorescencyjny fałszywy neurotransmiter. FFN 511 to fluorescencyjna monoamina, która po zastosowaniu w skrawkach mózgu może działać jako substrat dla synaptycznego fizycznego transportera monoamin. FN 511 jest pobierana do dopaminergicznych pęcherzyków synaptycznych za pośrednictwem transportera monoamin i może być wykorzystywana do bezpośredniej wizualizacji uwalniania neurotransmitera z zakończeń presynaptycznych neuronów monoaminergicznych, takich jak neurony w warstwie S. Uwalnianie neurotransmitera z zakończeń jest widoczne w skrawku jako redukcja punktowych sygnałów fluorescencyjnych.

W tym filmie przygotowano koronalne skrawki mózgu o grubości 250 mikrometrów przy użyciu vibrotomu, zabarwiono je barwnikiem FFN 511 i obrazowano za pomocą wielofotonowego mikroskopu laserowego. Przedstawiono eksperymenty z detekcją, które ujawniają heterogeniczność uwalniania iCal zależną od częstotliwości. Cześć, jestem HU z laboratorium Davida w Departamencie Neurologii na Uniwersytecie Columbia.

Cześć, jestem Minerva, również z Soldier Lab. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę znakowania zakończeń dopaminergicznych w skrawkach mózgu przy użyciu fluorescencyjnych fałszywych neuroprzekaźników. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania uwalniania dopaminy.

Zacznijmy zatem. Przed przygotowaniem ostrych przekrojów tkanek, należy upowietrzyć sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (A CSF) i chłodzić go w lodzie przez co najmniej 15 minut. Przed wyjęciem mózgu należy dopilnować, aby A CSF był lodowaty i upowietrzony. Podczas sekcji należy wyjąć cały mózg z myszy i zamocować go na tacy urządzenia Vibroslice, przytwierdzając go za pomocą kleju kropelkowego. Wyjęcie i zamocowanie mózgu musi zostać wykonane w ciągu dwóch minut.

Wypełnij kuwetę schłodzonym, natlenionym A CSF, wycinając koronalne przekroje proste mózgu lub plastry mózgu o grubości 250 µm w zakresie od +1,54 do +0,62. Uzyskane zostaną trzy plastry, które można podzielić igłą na sześć półplastrów. Inkubuj plastry mózgu w natlenionym A CSF w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną godzinę podczas procesu inkubacji.

W natlenionym A CSF przygotuj 10 mikromolowy roztwór ładujący FFN 511, dodając 10 milimolowy roztwór zapasowy FFN 511 do A CSF. Następnie przygotuj roztwór 100 mikromolowy A-D-V-A-S-E-P siedem w A CSF; oba roztwory należy natleniać przez co najmniej 15 minut przed pojedynczym podaniem do skrawków. Inkubuj każdy skrawk mózgu z roztworem ładującym FFN 511 przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie usuń di związany z tkanką zewnątrzkomórkową, inkubując obciążony skrawek w natlenionym 100 µM advers, siedmiu A CSF przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Skrawki są teraz gotowe do obrazowania. Barwienie FFN 511 zostanie zobrazowane w skrawkach przy użyciu multiphotonowego skanującego mikroskopu laserowego prairie Ultima. Umieść skrawek obciążony FFN 511 w komorze rejestracyjnej i poddaj perfuzji natlenionym A CSF przy szybkości przepływu od 1 do 2 ml/min. Następnie umieść na wierzchu skrawka platynową harfę z nylonowymi strunami, aby zminimalizować ruchy.

W trakcie eksperymentu, aby dodatkowo zminimalizować ruchy, należy pozwolić plastrom na stabilizację w komorze przez co najmniej 10 minut przed obrazowaniem. Zwizualizuj i zlokalizuj grzbietowy prążkowiec AUM za pomocą luminescencji w polu jasnym pod obiektywem imersyjnym z wodą 10x, a następnie umieść i wypozycjonuj bipolarne skręcone elektrody wolframowe w tym obszarze w celu przeprowadzenia eksperymentu stymulacyjnego. Obszar obrazowania w stanie spoczynku znajduje się w odległości 300 micrometers.

Pomiędzy dwoma końcami stymulującej elektrody bipolarnej umieść ten obszar w centrum obrazu pola widzenia FFN 511 z oznakowanymi zakończeniami SAL, korzystając z obiektywu ultrafioletowego do imersji w wodzie 63 x FFN 511; wzbudzenie odbywa się przy 760 nanometrach za pomocą lasera mi tai firmy spectral physics. Optymalna fluorescencja zakończeń SAL jest widoczna przez filtr pasmowy; wykonaj przechwytywanie obrazów w formacie 12 bit z obszarami zainteresowania o wymiarach 75 by 75 mikrometr i rozdzielczością 512 by 512 pikseli. Poniżej przedstawiono przykładowy obraz zakończeń dopaminergicznych SAL oznakowanych FFN 511.

Etykieta FFN 511 może zostać usunięta albo przez wysokie stężenia siarczanu amfetaminy i chlorku potasu, albo poprzez stymulację elektryczną w eksperymencie usuwania etykiety chlorkiem potasu; gdy do skrawka mózgu zostanie zastosowany roztwór CSF z wysokim stężeniem potasu, etykieta FFN 511 zostaje usunięta w ciągu czterech minut. Rejestruj obrazy XYZT, aby śledzić usuwanie FFN 511 w czasie podczas usuwania barwienia FFN 511 za pomocą stymulacji elektrycznej. Przed stymulacją uzyskaj kontrolną serię czasową obrazów skrawka przez co najmniej pięć minut, aby zapewnić minimalny ruch skrawka i brak fotowybielania laserem po akwizycji obrazów kontrolnych.

Kontynuuj obrazowanie XYZT, rozpoczynając stymulację częstotliwościami 1, 4 lub 20 Hz; bodźce są przyłożone lokalnie do prążkowia za pomocą izolatora stymulacji isoflex wyzwalanego przez generator impulsów master eight z wykorzystaniem elektrod bipolarnych. Ten film pokazuje przemieszczanie się FFN 511 podczas egzocytozy w plastrze mózgu SAL. Po zakończeniu ładowania FFN 511 do SAL obserwuje się intensywne znakowanie w prążkowiu, rzadkie znakowanie w korze oraz brak znakowania w cielem niej모stym.

Selektywne znakowanie zakończeń dopaminergicznych można usunąć za pomocą wysokiego stężenia chlorku potasu, co pokazano na tych reprezentatywnych obrazach przed podaniem chlorku potasu oraz dwie minuty po zastosowaniu 70 mM chlorku potasu. Usunięcie znakowania FFN 511 z CSF można również osiągnąć za pomocą amfetaminy. Ten obraz przedstawia znakowanie FFN 511 w prążkowiu przed podaniem amfetaminy.

Podczas gdy ten obraz przedstawia prążkowie 20 minut po odwiązaniu z zastosowaniem 20 µM amfetaminy, odwiązanie znakowania FFN 511 za pomocą lokalnej stymulacji elektrycznej zilustrowano na tych obrazach, które pokazują znakowanie FFN 511 w prążkowiu przed stymulacją oraz w 217 sekundzie i 514 sekundzie po rozpoczęciu stymulacji z częstotliwością 4 Hz. Ten wykres znormalizowanej intensywności fluorescencji w czasie pokazuje, że odwiązanie FFN 511 jest zależne od wapnia i częstotliwości; kontrolę reprezentowaną przez niezypełnione trójkąty nie poddano stymulacji. Odwiązanie z użyciem chlorku kadmu, reprezentowane przez niezypełnione koła, było identyczne z kontrolami niestymulowanymi.

Krzywe zaniku dla każdej częstotliwości stymulacji, reprezentowane przez kolorowe kółka, dopasowano do funkcji pojedynczego wykładniczego spadku, a wartości okresu półtwalenia obliczono jako tau pomnożone przez 0,693. Właśnie pokazaliśmy, jak wprowadzić fluorescencyjny czujnik neuroprzekaźnika FFN 511 do zakończeń dopaminergicznych w świeżym przekroju mózgu oraz jak wywołać jego uwalnianie za pomocą wysokiego stężenia potasu i stymulacji. Jest to pierwsza metoda opracowana w celu optycznego badania uwalniania neuroprzekaźnika na poziomie pojedynczych zakończeń synaptycznych.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zadbać o utrzymanie wysokiej żywotności skrawków oraz zwracać uwagę na czas inkubacji, tło po wybielaniu i artefakty ruchowe; skrawki wykazują prawidłowe ładowanie FFN pięć 11 oraz możliwość obrazowania do czterech godzin po ich przygotowaniu. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.