Name: Uwalnianie dopaminy w poszczególnych końcach presynaptycznych wizualizowane za pomocą FFN (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-31T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji uwalniania dopaminy z użyciem FFN 511 w preparatach mózgu myszy. Technika fluorescencyjna umożliwia obserwację neurotransmisji w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczych zakończeń presynaptycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

D. Sames dziękuje fundacji The G. Harold &amp; Leila Y. Mathers Charitable Foundation oraz programom Columbia University's Initiatives in Science and Engineering. D. Sames i D. Sulzer dziękują fundacji McKnight Foundation za przyznanie The McKnight Technological Innovations in Neuroscience Award D. Sulzer dziękuje NIDA, NIMH oraz fundacjom Picower i Parkinson's Disease Foundations. H. Zhang dziękuje NARSAD. R.H. Edwards dziękuje fundacji Michael J. Fox Foundation, National Parkinson Foundation, NIDA oraz NIMH. Dziękujemy Robertowi Burke’owi za iniekcje 6-OHDA i porady, Markowi Sondersowi za pomocne dyskusje, Merekowi Siu za programowanie analizy obrazowania oraz Janowi Schmoranzerowi za wsparcie techniczne przy konfiguracji mikroskopii TIRF.

Metoda ta została wykorzystana w badaniach opisanych w pracy <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/324/5933/1441">Gubernator et al., Science 324 (5933). 1441-1444 (2009)</a>.
1. Przygotowanie ostrych skrawków prążkowia
<ol>
<li>Przed przygotowaniem ostrych skrawków prążkowia należy natlenić sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ASCF) i chłodzić go w lodzie przez co najmniej 15 minut przed wyjęciem mózgu. Podczas sekcji ACSF należy utrzymywać w niskiej temperaturze (w lodzie) i stale natleniać. ACSF (w mM): NaCl 125, KCl 2.5, NaHCO3 26, CaCl2 2.4, MgSO4 1.3, KH2PO4 0.3, glukoza 10, HEPES 5; pH 7.3-7.4, 290-295 mOsm.</li>
<li>Dokonać dekapitacji samca myszy bez znieczulenia.</li>
<li>Wyjąć cały mózg z myszy i przymocować go do tacy wibrotomu za pomocą Krazy®Glue. Wyjęcie i montaż mózgu muszą zostać wykonane w ciągu 2 minut. W tym czasie należy dbać o to, aby ACSF pozostawał schłodzony w lodzie i natleniony, aby zachować żywotność tkanki.</li>
<li>Wyciąć koronalne skrawki prążkowia o grubości 250μm w przedziale od bregma +1.54 do +0.621. Uzyskane zostaną trzy pełne skrawki, które można następnie podzielić za pomocą igły na 6 połówkowych skrawków.</li>
<li>Inkubować skrawki mózgu w natlenionym ACSF w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę przed wprowadzaniem sondy. Skrawki wykazują prawidłowe obciążenie FFN511 i pozostają aktywne do obrazowania do 4 godzin po przygotowaniu.</li>
</ol>
2. Załadowanie FFN511
<ol>
<li>Przygotować roztwór ładujący FFN511 (10μM FFN511 w ACSF); przygotować również 100μM ADVASEP-7 w ACSF. Wszystkie roztwory powinny być przygotowane na świeżo i napowietrzone przez co najmniej 15 minut przed wprowadzeniem do skrawków.</li>
<li>Inkubować poszczególne skrawki w roztworze ładującym FFN511 przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Następnie usunąć barwnik związany z tkanką pozakomórkową, inkubując naładowany skrawek w napowietrzonym roztworze 100μM ADVASEP-7 ACSF przez 30 minut w temperaturze pokojowej2. Skrawki są teraz gotowe do obrazowania.</li>
</ol> 
3. Obrazowanie FFN511 w skrawkach mózgu
Obrazowanie FFN511 w skrawkach wykonuje się przy użyciu multiphotonowego skaningowego mikroskopu laserowego. Wykorzystujemy multiphotonowy skaningowy mikroskop laserowy Prairie Ultima (wcześniej używaliśmy multiphotonowego skaningowego mikroskopu laserowego Zeiss LSM 510 NLO i część wyników uzyskano przy użyciu mikroskopu Zeiss).
<ol>
<li>Umieść skrawek obciążony FFN511 w komorze rejestracyjnej (RC-27L, Warner) i poddawaj superfuzyjnie natlenionym ACSF przy szybkości przepływu 1-2 ml na minutę. Następnie umieść na górze skrawka platynową harfę z nylonowymi strunami, aby zminimalizować ruchy podczas eksperymentu. Aby dodatkowo ograniczyć przemieszczanie się tkanki, pozwól skrawkowi stabilizować się w komorze przez co najmniej 10 minut przed obrazowaniem.</li>
<li>Wizualizuj i zlokalizuj grzbietowe prążkowie, korzystając z luminescencji w polu jasnym pod obiektywem imersyjnym wodnym 10x.</li>
<li>W przypadku przeprowadzania eksperymentu ze stymulacją, umieść i wypozycjonuj bipolarne skręcone elektrody wolframowe w tym obszarze. Idealny obszar obrazowania znajduje się w odległości 300 μm pomiędzy dwoma końcami stymulującej elektrody bipolarnej. Umieść ten region w centrum pola widzenia.</li>
<li>Obrazuj terminale prążkowia oznakowane FFN511 pod ultrafioletowym obiektywem imersyjnym wodnym 63x (0.9 NA). FFN511 jest wzbudzany przy 760 nm za pomocą lasera Mai Tai firmy Spectral Physics, a optymalna fluorescencja terminali prążkowia jest widoczna przez filtr pasmowy (480-520 nm). Obrazy są rejestrowane w formacie 12-bitowym z obszarami zainteresowania o wymiarach 75 x 75 μm przy rozdzielczości 512 x 512 pikseli. W eksperymentach z wymywaniem indukowanym stymulacją, w celu skompensowania przesunięcia w osi z, dla każdego przedziału czasowego pozyskiwana jest seria z składająca się z 5-7 obrazów, oddzielonych od siebie o 1 μm w płaszczyźnie z.</li>
</ol>
4. Odbarwianie FFN511
Znacznik FFN511 można usunąć za pomocą wysokiego stężenia KCl (stosujemy 70 mM KCl), siarczanu (+)-amfetaminy (AMPH, 20 μM) lub stymulacji elektrycznej. W eksperymencie z usuwaniem znacznika za pomocą KCl, po zastosowaniu roztworu ACSF o wysokim stężeniu potasu do skrawka mózgu, znacznik FFN511 zostaje usunięty w ciągu 2 minut. Należy rejestrować obrazy xyz-t, aby śledzić proces usuwania FFN511 w czasie. Poniżej opisano proces usuwania znacznika z zakończeń dopaminergicznych zależny od stymulacji elektrycznej:
<ol>
<li>Aby monitorować odbarwianie FFN511 w czasie, rejestruje się obrazy xyz-t. Aby zapewnić minimalne przemieszczenie skrawka (mniej niż 4 μm w osi z) oraz brak fotobleachingu wywołanego laserem, należy uzyskać kontrolne obrazy serii czasowej stosu z przez co najmniej 5 minut przed stymulacją. W przeciwnym razie należy skorygować moc lasera.</li>
<li>Po wykonaniu tych obrazów kontrolnych należy kontynuować obrazowanie xyz-t, rozpoczynając stymulację z częstotliwością 1, 4 lub 20 Hz. Bodźce o częstotliwości 1, 4 lub 20 Hz (300 μs x 1 mA) są przyłożone lokalnie do prążkowia za pomocą izolatora stymulacji Iso-Flex wyzwalanego przez generator impulsów Master-8 (AMPI, Jerusalem, Israel) z użyciem elektrod bipolarnych. Aby zminimalizować zmienność depolaryzacji miejsc uwalniania, zastosowano protokół stymulacji wykorzystujący 150% maksymalnej intensywności stymulacji wyznaczonej za pomocą woltametrii cyklicznej.</li>
<li>Do analizy obrazów należy użyć odpowiedniego oprogramowania. W naszym laboratorium używamy programu Image J (Wayne Rosband, National Institutes of Health, Rockville, MD) oraz autorskiego oprogramowania w języku IDL (Research Systems, Boulder, CO) do ilościowego oznaczenia fluorescencji punktów (puncta) oraz zmian zachodzących w czasie3.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1 przedstawia zakończony proces wprowadzania FFN511 do przekroju prążkowia. Reprezentatywne obrazy wykonane przy użyciu obiektywów 10x i 60x pokazano na Rys. 1. Selektywne znakowanie zakończeń dopaminergicznych można usunąć za pomocą 20 μM amfetaminy. Rysunek 2 przedstawia usuwanie znakowania FFN511 za pomocą wysokiego stężenia KCl. Rysunek 3 przedstawia usuwanie znakowania FFN511 za pomocą lokalnej stymulacji elektrycznej. 
<img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig1.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej przekrojów mózgu, przedstawiający warunki kontrolne i doświadczalne." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. FFN511 znakuje zakończenia dopaminergiczne w żywych ostrych przekrojach korowo-prążkowiowych. (A) Znakowanie za pomocą FFN511 w ostrym żywym przekroju korowo-prążkowiowym: obfite znakowanie w prążkowiu (STR), rzadsze znakowanie w korze (CTX) oraz brak oznakowania w ciele modzelowatym (CC). Pasek skali: 100 μm. (B) Usuwanie FFN511 z prążkowia za pomocą amfetaminy. Panele lewe: przed podaniem amfetaminy; panele prawe: po 20 minutach działania 20 μM amfetaminy. Pasek skali: 10 μm.
<img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig2.jpg" alt="Obraz mikroskopowy; odpowiedź komórkowa na KCl. Kontrola i traktowanie z widocznymi zmianami kontrastu." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Odbarwienie znakowania FFN511 pod wpływem wysokiego stężenia KCl. Znakowanie FFN511 ulega odbarwieniu w ciągu 2 min aplikacji 70 mM KCl w ACSF. Pasek skali: 10μm.
<img src="/files/ftp_upload/1562/1562fig3.jpg" alt="Sygnalizacja wapniowa neuronów; obrazowanie fluorescencyjne, wykres zaniku; analiza wzbudzenia optycznego;" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. 
Zależne od częstotliwości odbarwianie znakowania FFN511 w prążkowiu. (A) Lokalna stymulacja z częstotliwością 4 Hz spowodowała odbarwianie z zakończeń. Stymulację rozpoczęto w t = 0. Pasek skali: 5 μm. (B) Odbarwianie FFN511 przy 4 Hz jest zależne od Ca2+ oraz częstotliwości. Grupy kontrolne nie otrzymały stymulacji (153 punkta z 3 skrawków). Odbarwianie z dodatkiem chlorku kadmu (200 μM) było identyczne z niepobudzanymi kontrolami (475 punktów z 5 skrawków). Krzywe odbarwiania dla każdej częstotliwości stymulacji dopasowano za pomocą funkcji pojedynczego wykładniczego zaniku, a wartości okresu półtrwania (t1/2) obliczono jako τ x 0,693 (1 Hz: 765 punktów z 9 skrawków, 4 Hz: 410 punktów z 7 skrawków, 20 Hz: 416 punktów z 6 skrawków). Prosimy o zapoznanie się z mikrofilmem wideo z mikroskopii dwufotonowej przedstawiającym odbarwianie FFN511 podczas egzocytozy w preparacie skrawka mózgu z prążkowiem.

<ol><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxi coordinators. , Academic Press. San Diego. (1997).</li>
<li>Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+synaptic+activity+in+intact+brain+and+slices+with+FM1-43+in+C.+elegans%2C+lamprey%2C+and+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat.</a> Neuron. 24, 8098-8117 (1999).</li>
<li>Bamford, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosynaptic+dopamine+neurotransmission+selects+sets+of+corticostriatal+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Heterosynaptic dopamine neurotransmission selects sets of corticostriatal terminals.</a> Neuron. 42, 653-653 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym filmie prezentujemy metodę optycznej wizualizacji neurotransmisji z wykorzystaniem fluorescencyjnych analogów dopaminy. FFN511 jest pierwszą generacją opracowanych przez nas FFN. Chociaż został on zaprojektowany poprzez ukierunkowanie na neuronalny transporter monoamin pęcherzykowy (VMAT2), który transportuje neurotransmitery monoaminowe z cytoplazmy do pęcherzyków synaptycznych i specyficznie znakuje zakończenia dopaminergiczne w prążkowiu oraz domniemane zakończenia katecholaminergiczne i/lub serotonergiczne w korze (jak pokazano w publikacji w czasopiśmie Science), odpowiedni czas ładowania jest krytyczny dla specyficzności, ponieważ FFN511 jest stosunkowo hydrofobowy. Stwierdzono, że inkubacja trwająca dłużej niż 40 minut prowadzi do rozległego niespecyficznego barwienia w skrawkach prążkowia. Specyficzność można łatwo określić poprzez odbarwianie z użyciem wysokiego stężenia KCl, co powinno spowodować uwolnienie FFN z funkcjonalnych pęcherzyków synaptycznych. Ekspozycja skrawka na FFN511 przez mniej niż 15 minut skutkuje słabym sygnałem fluorescencyjnym z powodu niewystarczającego załadowania barwnika do zakończeń. W tym protokole stosujemy 100μM ADVASEP-7 w celu usunięcia barwnika związanego z tkanką pozakomórkową. Krok ten nie jest niezbędny, ale w przypadku jego pominięcia czas wypłukiwania w ACSF musi zostać wydłużony. Podsumowując, w zależności od wybranego preparatu, konieczna będzie modyfikacja stężenia i czasu ładowania w celu ustalenia optymalnego znakowania.

<table><tbody><tr><td>FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one)</td><td>Columbia University - Dalibor Sames Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADVASEP-7 </td><td>CyDex</td><td>AR-OA7-005</td><td></td></tr><tr><td>Komora rejestracyjna RC-27L</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0375</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt 6-dołkowy PELCO PrepEze</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>36157-1</td><td>Do inkubacji skrawków</td></tr><tr><td>Stymulator impulsowy Master-8 oraz izolator stymulacji Iso- Flex</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja uwalniania dopaminy w pojedynczych zakończeniach presynaptycznych za pomocą ffn

Dopamine Release at Individual Presynaptic Terminals Visualized with FFNs

Układ nerwowy przekazuje sygnały między neuronami poprzez uwalnianie neuroprzekaźników podczas fuzji pęcherzyków synaptycznych. Aby bezpośrednio obserwować pobieranie i uwalnianie neuroprzekaźników z poszczególnych zakończeń presynaptycznych, zaprojektowaliśmy fluorescencyjne fałszywe neuroprzekaźniki służące jako substraty dla transporterów monoamin pęcherzyków synaptycznych. Wykorzystując te sondy do obrazowania uwalniania dopaminy w prążkowiu, dokonaliśmy kilku obserwacji istotnych dla plastyczności synaptycznej. Stwierdzono, że frakcja pęcherzyków synaptycznych uwalniających neuroprzekaźnik na jeden bodziec była zależna od częstotliwości stymulacji. W tych warunkach eksperymentalnych nie zaobserwowano kinetycznie odrębnej populacji „rezerwowych” pęcherzyków synaptycznych. Wykazano zależną od częstotliwości heterogeniczność zakończeń presynaptycznych, która była częściowo zależna od receptorów dopaminowych D2, co wskazuje na mechanizm zależnego od częstotliwości kodowania selekcji presynaptycznej.

Hui Zhang i Niko G. Gubernator wnieśli równy wkład w tę pracę.

Nowa metoda optycznego pomiaru neurotransmisji z wykorzystaniem fluorescencyjnych analogów dopaminy.

Wizualizacja uwalniania dopaminy w pojedynczych zakończeniach presynaptycznych za pomocą FFN

Układ nerwowy przekazuje sygnały między neuronami poprzez uwalnianie neuroprzekaźników podczas fuzji pęcherzyków synaptycznych. Aby zaobserwować wychwyt neuroprzekaźników i...

Fluorescencyjny fałszywy neurotransmiter. FFN 511 to fluorescencyjna monoamina, która po zastosowaniu w skrawkach mózgu może pełnić rolę substratu dla synaptycznego fizycznego transportera monoamin. FN 511 jest pobierany do dopaminergicznych pęcherzyków synaptycznych za pośrednictwem transportera monoamin i może być wykorzystywany do bezpośredniej wizualizacji uwalniania neurotransmiterów z zakończeń presynaptycznych neuronów monoaminergicznych, takich jak neurony w warstwie S. Uwalnianie neurotransmiterów z zakończeń jest widoczne w skrawku jako redukcja punktowych sygnałów fluorescencyjnych.W tym filmie przygotowano koronalne skrawki mózgu w rozmiarze 250 µm przy użyciu wibrotomu, barwiono je barwnikiem FFN 511 i obrazowano za pomocą wielofotonowego mikroskopu laserowego. Przedstawiono eksperymenty z odblokowaniem, które ujawniają zależną od częstotliwości heterogeniczność uwalniania Ca²⁺. Cześć, jestem HU z laboratorium Davida z Katedry Neurologii na Uniwersytecie Kolumbii.Cześć, jestem Minerva, również z Soldier Lab. Dzisiaj przedstawimy procedurę znakowania zakończeń dopaminergicznych w skrawkach mózgu z użyciem fluorescencyjnych fałszywych neuroprzekaźników. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania uwalniania dopaminy.Zacznijmy zatem. Przed przygotowaniem ostrych plastrów jądra półleżącego (sal), należy uprzednio natlenić sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (A CSF) i schładzać go w lodzie przez co najmniej 15 minut przed wyjęciem mózgu; podczas sekcji należy utrzymywać A CSF w niskiej temperaturze i w stanie natlenienia. Wyjmij cały mózg z myszy, a następnie zamocuj go na tacy wibratoma za pomocą kleju kropelkowego. Wyjęcie i zamocowanie mózgu musi zostać wykonane w ciągu dwóch minut.Wypełnij kuwetę schłodzonym, napowietrzonym A CSF oraz przekrojami koronalnymi mózgu o grubości 250 micrometer, wyciętymi z zakresu od +1.54 do +0.623. Otrzymane zostaną trzy pełne plastry, które można podzielić igłą na sześć połówek. Inkubuj plastry mózgu w napowietrzonym A CSF w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną godzinę.W natlenionym A CSF przygotować 10 µM roztwór ładujący FFN 511, dodając 10 mM roztwór stokowy FFN 511 do A CSF. Następnie przygotować w A CSF roztwór 100 µM A-D-V-A-S-E-P seven. Oba roztwory należy natleniać przez co najmniej 15 minut przed indywidualnym wprowadzeniem do skrawków. Każdy skrawek mózgu inkubować z roztworem ładującym FFN 511 przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Następnie należy usunąć di związane z tkanką pozakomórkową, inkubując załadowany skrawek w natlenionym roztworze advers 100 µM w A CSF przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Skrawki są teraz gotowe do obrazowania. Barwienie FFN 511 zostanie zobrazowane w skrawkach przy użyciu multiphotonowego skaningowego mikroskopu laserowego Prairie Ultima. Umieść skrawek załadowany FFN 511 w komorze rejestracyjnej i przepłukuj go natlenionym A CSF z prędkością przepływu od 1 do 2 ml/min. Następnie umieść platynową harfę z nylonowymi strunami na górze skrawka, aby zminimalizować jego ruchy.Aby dodatkowo zminimalizować ruchy podczas eksperymentu, należy pozostawić skrawki w komorze na co najmniej 10 minut w celu stabilizacji przed obrazowaniem. Przy użyciu obiektywu imersyjnego z wodą 10x, zwizualizuj i zlokalizuj grzbietową część AUM za pomocą luminescencji w jasnym polu, a następnie umieść i ustaw bipolarne, skręcone elektrody wolframowe w tym obszarze w celu przeprowadzenia eksperymentu stymulacyjnego. Obszar obrazowania w stanie spoczynku znajduje się w odległości 300 µm.Pomiędzy dwoma końcami stymulującej elektrody bipolarnej należy umieścić ten obszar w centrum obrazu pola widzenia FFN 511, z oznakowanymi zakończeniami SAL, przy użyciu obiektywu imersyjnego wodnego 63 x. FFN 511 jest wzbudzany przy 760 nanometrach za pomocą lasera mi tai firmy Spectral Physics. Optymalna fluorescencja zakończeń SAL jest widoczna przez filtr pasmowy; należy rejestrować obrazy w formacie 12-bitowym z obszarami zainteresowania o wymiarach 75 by 75 mikrometrów przy rozdzielczości 512 by 512 pikseli. Przykładowy obraz z zakończeniami dopaminergicznymi SAL oznakowanymi FFN 511 został przedstawiony tutaj.Znakowanie FFN 511 może zostać usunięte albo przez wysokie stężenia siarczanu amfetaminy z chlorkiem potasu, albo poprzez stymulację elektryczną w eksperymencie usuwania znaczników chlorkiem potasu; gdy do skrawka mózgu aplikowany jest roztwór CSF o wysokim stężeniu potasu, znakowanie FFN 511 zanika w ciągu czterech minut. Należy rejestrować obrazy XYZT, aby śledzić usuwanie FFN 511 w czasie podczas usuwania znakowania FFN 511 za pomocą stymulacji elektrycznej. Przed stymulacją należy uzyskać kontrolną serię obrazów czasowych Zack przez co najmniej pięć minut, aby upewnić się, że ruch skrawka jest minimalny i nie zachodzi fotobleaching wywołany laserem po akwizycji obrazów kontrolnych.Kontynuuj obrazowanie XYZT, rozpoczynając stymulację z częstotliwościami 1, 4 lub 20 Hz; impulsy są aplikowane lokalnie do prążkowia za pomocą izolatora stymulacji Isoflex wyzwalanego przez generator impulsów Master-8 z wykorzystaniem elektrod bipolarnych. To wideo przedstawia rozkład FFN 511 podczas egzocytozy w skrawku mózgu SAL. Przygotowanie: po zakończeniu ładowania FFN 511 do SAL obserwuje się obfite znakowanie w prążkowiu, rzadkie znakowanie w korze oraz brak znakowania w cielemwołkowym.Selektywne znakowanie zakończeń dopaminergicznych może zostać zniesione przez wysokie stężenie chlorku potasu, co pokazują te reprezentatywne obrazy przed podaniem chlorku potasu oraz dwie minuty po zastosowaniu 70 mM chlorku potasu. Zniesienie znakowania FFN 511 w płynie mózgowo-rdzeniowym może być również osiągnięte za pomocą amfetaminy. Ten obraz przedstawia znakowanie FFN 511 w prążkowiu przed podaniem amfetaminy.Podczas gdy ten obraz przedstawia prążkowie 20 minut po odwiązaniu z zastosowaniem 20 µM amfetaminy, odwiązanie znakowania FFN 511 poprzez lokalną stymulację elektryczną zostało zilustrowane na tych obrazach, które pokazują znakowanie FFN 511 w prążkowiu przed stymulacją oraz w 217 sekundzie i 514 sekundzie po rozpoczęciu stymulacji z częstotliwością 4 Hz. Ten wykres znormalizowanej intensywności fluorescencji w czasie pokazuje, że odwiązanie FFN 511 jest zależne od wapnia i częstotliwości; grupy kontrolne reprezentowane przez niez wypełnione trójkąty nie otrzymały stymulacji. Odwiązanie z użyciem chlorku kadmu, reprezentowane przez niez wypełnione koła, było identyczne z kontrolami niestymulowanymi.Krzywe wygaszania dla każdej częstotliwości stymulacji, reprezentowane przez kolorowe okręgi, dopasowano za pomocą funkcji pojedynczego zaniku wykładniczego, a wartości okresu półtrwania obliczono jako tau pomnożone przez 0.693. Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak wprowadzić fluorescencyjny czujnik neurotransmitera FFN 5.11 do zakończeń dopaminergicznych w ostrym skrawku i jak wywołać jego uwalnianie za pomocą wysokiego stężenia potasu oraz stymulacji. Jest to pierwsza metoda opracowana w celu optycznego badania uwalniania neurotransmiterów na poziomie pojedynczych zakończeń synaptycznych.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zachowaniu wysokiej żywotności skrawków oraz zwracać uwagę na czas ładowania, tło wybielania i artefakty ruchowe; skrawki wykazują prawidłowe ładowanie FFN five 11 i umożliwiają obrazowanie do czterech godzin po przygotowaniu. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.

dopamine-release-at-individual-presynaptic-terminals-visualized-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Uwalnianie dopaminy w pojedynczych zakończeniach przedsinaptycznych wizualizacja za pomocą FFN

Niniejszy raport demonstruje technikę mechanicznej izolacji pojedynczych żywych neuronów z zachowaniem przytwierdzonych boutonów presynaptycznych. Neurony poddane wibrodysocjacji charakteryzują się zaletami takimi jak szybki czas przygotowania, doskonała kontrola farmakologiczna oraz usprawniona stabilizacja potencjału błonowego (space-clamp) bez wpływu komórek sąsiednich. Metoda ta może być wykorzystywana do obrazowania elementów synaptycznych oraz rejestracji metodą patch-clamp.

Wibrodysocjacja neuronów z plastrów mózgu gryzoni w celu badania transmisji synaptycznej i obrazowania terminali presynaptycznych

Opisano technikę obrazowania fluorescencyjnego na żywo, służącą do ilościowego określenia uzupełniania i mobilizacji specyficznych pul pęcherzyków synaptycznych (SV) w centralnych zakończeniach nerwowych. Monitorowane są dwie rundy recyklingu SV w tych samych zakończeniach nerwowych, co zapewnia kontrolę wewnętrzną.

Ilościowa analiza uzupełniania puli pęcherzyków synaptycznych w hodowlanych neuronach ziarnistych móżdżku z wykorzystaniem barwników FM

Wykorzystanie szybkoskanującej woltamperometrii cyklicznej do pomiaru elektrycznie wywołanej dynamiki dopaminy presynaptycznej w skrawkach mózgowych prążkowia.

Dynamika dopaminy presynaptycznej w przekrojach mózgu w obrębie prążka z wykorzystaniem szybkiej woltamperometrii cyklicznej

Inkubować wycinek w płynie CSF zawierającym fluorescencyjne fałszywe neuroprzekaźniki lub FFN.

Wizualizacja neuroprzekaźnictwa za pomocą fluorescencyjnych fałszywych neuroprzekaźników

Ten film demonstruje wszczepienie elektrod i kaniul u znieczulonego szczura w celu pomiaru uwalniania dopaminy w jądrze półleżącym za pomocą potencjostatu oraz infuzji leków w celu modulacji aktywności dopaminergicznej w brzusznej części nakrywki.

Monitorowanie uwalniania dopaminy w modelu szczurzym za pomocą manipulacji receptorem neuronów dopaminergicznych VTA

Opisujemy użycie styrylowych barwników FM do obrazowania recyklingu pęcherzyków synaptycznych w funkcjonalnych zakończeniach nerwowych. Protokół ten może być stosowany nie tylko do wywołanych, ale także spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych. Protokół rozszerza różnorodność zdarzeń synaptycznych, które można skutecznie ocenić.<br...

Badanie recyklingu pęcherzyków synaptycznych za pomocą barwników FM podczas wywołanych, spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie jest wykorzystywane do badania zachowania i interakcji między dwoma typami endosomów w zakończonych nerwach żywych kręgowców.  Ruch tych małych struktur jest scharakteryzowany w trzech wymiarach, co pozwala na potwierdzenie zdarzeń takich jak fuzja endosomów i egzocytoza.

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

Cykl pęcherzyków synaptycznych (SV) jest podstawowym mechanizmem komunikacji międzykomórkowej w synapsach neuronalnych. Wychwyt i uwalnianie barwnika FM są podstawowymi sposobami ilościowego oznaczania endo- i egzocytozy SV. Tutaj porównujemy wszystkie metody stymulacji w celu napędzania cyklu FM1-43 w synapsie modelu połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila (NMJ).

Cykl barwnika FM w synapsie: porównanie wysokiej depolaryzacji potasu, stymulacji elektrycznej i rodopsyny kanałowej

Celem tego protokołu jest bezpośrednie manipulowanie receptorami brzusznego obszaru nakrywki w celu zbadania ich udziału w subsekundowym uwalnianiu dopaminy.

Skojarzona infuzja i stymulacja z woltamperometrią cykliczną Fast-Scan (CIS-FSCV) w celu oceny regulacji dopaminy fazowej przez receptory brzusznego obszaru nakrywki

Połączenie nerwowo-mięśniowe larw danio pręgowanego jest atrakcyjnym modelem do badania fizjologii synaptycznej. Jest podatny na wiele technik eksperymentalnych, w tym elektrofizjologię i obrazowanie optyczne. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania transmisji synaptycznej za pomocą sondy na bazie pHluoryny pod pionowym mikroskopem epifluorescencyjnym.

Obrazowanie na żywo recyklingu pęcherzyków synaptycznych w złączu nerwowo-mięśniowym wypreparowanych larw danio pręgowanego

Poznaj metodę wizualizacji uwalniania dopaminy z użyciem FFN 511 w preparatach mózgu myszy. Technika fluorescencyjna umożliwia obserwację neurotransmisji w czasie rzeczywistym na poziomie pojedynczych zakończeń presynaptycznych.

Wizualizacja uwalniania dopaminy w pojedynczych zakończeniach presynaptycznych za pomocą FFN

Przeglądaj więcej filmów