Name: In situ Subkomórkowe frakcjonowanie przylegających i nieprzylegających komórek ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj metodę subkomórkowego frakcjonowania komórek ssaków in situ na szkiełkach mikroskopowych. Technika umożliwia wizualizację lokalizacji białek za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Anyaporn Sawasdichai oraz Nazefah Abdul Hamid są wdzięczni odpowiednio Rządowi Królestwa Tajlandii oraz Rządowi Malezji za stypendia doktoranckie. Praca ta była finansowana z grantu projektowego Wellcome Trust przyznanego PSJ i KG. Jesteśmy również wdzięczni ośrodkowi University of Bristol Wolfson Bioimaging Facility.

I. Przygotowanie do frakcjonowania
W tej sekcji opisano przygotowanie szkiełek nakrywkowych do mikroskopu powlekanych poli-L-lizyną oraz przyłączanie komórek przed frakcjonowaniem. W razie potrzeby komórki można przejściowo przetransfekować wektorami ekspresyjnymi białek przed lub po przyłączeniu.
A. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych powlekanych poli-L-lizyną
<ol>
	<li>Przygotować roztwór poli-L-lizyny o stężeniu 1mg/ml w wodzie destylowanej.</li>
	<li>Pokryć czyste szkiełka nakrywkowe poli-L-lizyną, inkubując je w roztworze przez co najmniej 1 godzinę na platformie kołyszącej w temperaturze 2°C.</li>
	<li>Przemyć pokryte szkiełka dwukrotnie sterylną wodą destylowaną, a następnie jednokrotnie 96% etanolem.</li>
	<li>Wysuszyć pokryte szkiełka na powietrzu na kawałku papieru filtracyjnego i przechowywać w suchym pojemniku do późniejszego użycia (po wyschnięciu można je układać w stosy).</li>
</ol>
B. Przytwierdzanie komórek do szkiełek podstawowych
Komórki nieprzylegające (w tym przypadku używamy linii komórkowej K562)
<ol>
	<li>Umieść szkiełko podstawkowe pokryte poli-L-lizyną w dołku płytki 6-dołkowej, tak aby pokryta powierzchnia była skierowana do góry.</li>
	<li>Zasiać komórki K562 w zagęszczeniu 7x105 komórek/dołek w podłożu DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium) uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz PS (penicylina 10units/ml, streptomycyna 10mg/ml). W przypadku komórek K562 przed wysianiem można przeprowadzić transfekcję przejściową za pomocą elektroporacji (kuwety do elektroporacji 0,4cm z 1x107 komórek w 200μl pożywki przy 250V / 975μF).</li>
	<li>Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37°C w 5% CO2.</li>
	<li>Odlać pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki lodowatym solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS).</li>
	<li>Następnie postępować zgodnie z protokołem frakcjonowania subkomórkowego.</li>
</ol>
Komórki adherentne (w tym przypadku używamy komórek Cos-7)
<ol>
 <li>Umieść niepowlekane szkiełko nakrywką w dołku płytki 6-dołkowej.</li>
 <li>Przemyj dwukrotnie w PBS uprzednio ogrzanym do 37°C.</li>
 <li>Od publicités komórki poprzez trawienie trypsyną (0,03% EDTA, 0,25% trypsyny) w PBS w 37°C przez 2 do 5 minut. Ważne jest, aby nie doprowadzić do nadmiernego strawienia komórek i przerwać proces trawienia, gdy pojawią się głównie pojedyncze, pływające komórki.</li>
 <li>Przerwij trawienie, wysiewając komórki z gęstością 3x105 komórek/dołek w płytce 6-dołkowej w DMEM uzupełnionym o 10% FBS i PSG (penicylina 10 units/ml, streptomycyna 10ug/ml i L-glutamina 292ug/ml), na zwykłych szkiełkach nakrywkach. Komórki adherentne zazwyczaj dobrze przylegają do zwykłych szkiełek nakrywek mikroskopowych, jednak w razie potrzeby można zastosować szkiełka powlekane poli-L-lizyną.</li>
 <li>Inkubuj komórki przez 24 godziny w 37°C i 5% CO2. W przypadku komórek Cos-7, jeśli jest to wymagane, można przeprowadzić przejściową transfekcję za pomocą Fugene 6 (Roche), a następnie pozostawić komórki do regeneracji na kolejne 24 godziny w 37°C i 5% CO2.</li>
 <li>Odlej pożywkę i przemyj komórki dwukrotnie lodowatym PBS.</li>
 <li>Następnie postępuj zgodnie z protokołem frakcjonowania subkomórkowego.</li>
</ol>
 
II. Frakcjonowanie subkomórkowe
In situ frakcjonowanie przeprowadza się zgodnie ze schematem przedstawionym na Rysunku 1, w oparciu o metodę opisaną wcześniej5 z modyfikacjami opisanymi wcześniej7 oraz w szczegółowym protokole poniżej. Zaleca się przenoszenie szkiełek podstawkowych do nowej płytki 6-dołkowej po każdym etapie frakcjonowania, wyjmując szkiełko przed usunięciem cieczy. Chociaż do obrazowania wymagane są tylko cztery szkiełka podstawkowe, dodatkowe szkiełka są niezbędne do przygotowania frakcji ekstraktu z całych komórek oraz macierzy jądrowej do analizy western blotting, jeśli ma ona być przeprowadzona równolegle.
<ol>
	<li>Przygotować i przefiltrować bufor do cytoszkieletu (CSK): 10 mM PIPES, 30 mM sacharozy, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl22, 1mM EGTA. Bufor CSK powinien zostać przygotowany na świeżo w dniu frakcjonowania.</li>
	<li>W razie potrzeby komórki z jednej szkiełka nakrywki mogą zostać wykorzystane do przygotowania ekstraktu z całych komórek do analizy western blotting poprzez delikatne naniesienie 20 µl buforu TES (1% SDS, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 7,4) bezpośrednio na szkiełko nakrywkę i inkubowanie przez 1 lub 2 minuty w temperaturze 22°CNastępnie można usunąć całkowity ekstrakt komórkowy, a białka wytrącić poprzez dodanie 250 µl 1M (NH4)4)2SO4 oraz inkubowanie w lodzie do czasu przygotowania pozostałych próbek do analizy Western blot.</li>
	<li>Pozostałe szkiełka nakrywkowe należy dwukrotnie przemyć 1 ml lodowatego PBS w temperaturze 22°C poprzez dwu- lub trzykrotne przechylenie płytki 6-dołkowej.</li>
	<li>Zdjąć szkiełko przykrywcze z całymi komórkami i przenieść je do nowej płytki 6-dołkowej. Następnie przeprowadzić protokół fiksacji komórek i immunofluorescencji.</li>
	<li>Ostrożnie usuń PBS z pozostałych studzienek.</li>
	<li>Wyodrębnić białka cytoplazmatyczne i słabo związane białka jądrowe, delikatnie nanosząc 20 $\mu$l buforu CSK z dodatkiem 0,1% (V/V) Tritonu X-10 bezpośrednio na każdą z pozostałych szkiełek podstawkowych i inkubując na lodzie przez 1 minutę.</li>
	<li>Usunąć ekstrakt cytoplazmatyczny oraz słabo związany ekstrakt jądrowy i przeprowadzić wytrącanie zgodnie z opisem w kroku 2.</li>
	<li>Przemyj szkiełka podstawowe dwukrotnie 1 ml lodowatego PBS w temperaturze 22°C poprzez przechylenie płytki 6-dołkowej.</li>
	<li>Usuń szkiełko cover-slip reprezentujące ściśle związane materiały jądrowe, a następnie przeprowadź protokół fiksacji komórek i immunofluorescencji.</li>
	<li>Ostrożnie usuń bufor PBS z pozostałych dołków, a następnie wyodrębnij silnie związane białka, nakładając delikatnie 20 µl buforu CSK z dodatkiem 0,5% (V/V) Triton X-10 bezpośrednio na każde z pozostałych szkiełek podstawowych i inkubując na lodzie przez 20 minut.</li>
	<li>Usunąć ściśle związany ekstrakt i przeprowadzić precypitację zgodnie z opisem w kroku 2.</li>
	<li>Przemyj szkiełka nakrywkowe dwukrotnie 1 ml lodowatego PBS przy 22°C poprzez przechylenie płytki 6-dołkowej.</li>
	<li>Usuń szkiełko nakrywowe reprezentujące frakcję chromatyny, a następnie przeprowadź procedurę fiksacji komórek i protokół immunofluorescencji.</li>
	<li>Delikatnie usuń PBS z pozostałych dołków, a następnie nanieś 200 $\mu$l buforu CSK z dodatkiem 10 $\mu$g/ml DNazy I na pozostałe szkiełka podstawne i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Usunąć ekstrakt chromatyny i przeprowadzić precypitację zgodnie z opisem w kroku 2.</li>
	<li>Przemyć szkiełka podstawowe dwa razy w lodowatym PBS przy 22°C poprzez przechylenie płytki 6-dołkowej.</li>
	<li>Usuń szkiełko nakrywkowe reprezentujące frakcję macierzy jądrowej, a następnie przeprowadź utrwalanie komórek zgodnie z protokołem immunofluorescencji.</li>
	<li>W razie potrzeby białka macierzy można usunąć z dodatkowej szkiełka nakrywki z macierzą do analizy western blotting, używając 20 µl buforu TES, zgodnie z opisem w kroku 2.</li>
	<li>Próbki do analizy western blot należy odwirować w mikrocentry fudze nakładkowej z prędkością 130 obr./min przy 4°C a osady resuspendowano w 40 $\mu$l buforu do ładowania SDS (62,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS (m/v), 50 mM DTT, 10% glicerolu, 0,01% błękitu bromofenolowego (m/v)) przed analizą za pomocą SDS-PAGE. <img src="/files/ftp_upload/1958/1958fig1.jpg" alt="Schemat western blottingu: proces frakcjonowania komórek w celu wyizolowania składników jądrowych przy użyciu buforów CSK i TES." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rycina 1. Schematyczne przedstawienie in situ frakcjonowanie subkomórkowe Bufor cytoszkieletowy (CSK) składa się z 10 mM PIPES, 30 mM sacharozy, 10 mM NaCl i 3 mM MgCl22, 1 mM EGTA. Bufor TES składa się z 1% SDS, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 7,4.</li>
</ol>
III. Fixacja komórek i immunofluorescencja
<ol>
 <li>Ostrożnie dodaj 1ml 4% formaldehydu/PBS na każde szkiełko nakrywki i inkubuj w temperaturze 4°C przez 30 minut.</li>
 <li>Każde szkiełko nakrywki przemyj delikatnie 2-3 razy, używając 1ml PBS w temperaturze 2°C.</li>
 <li>Dodaj 40ul 0,1% Triton X-10/PBS na każde szkiełko nakrywki i inkubuj w temperaturze 2°C przez 10 minut.</li>
 <li>Każde szkiełko nakrywki przemyj delikatnie 2-3 razy, używając 1ml PBS w temperaturze 2°C.</li>
 <li>Dodaj 40ul 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA)/PBS i inkubuj w temperaturze 2°C przez 20 minut w celu zmniejszenia potencjalnego barwienia tła.</li>
 <li>Każde szkiełko nakrywki przemyj delikatnie 2-3 razy, używając 1ml PBS w temperaturze 2°C.</li>
 <li>Nanieś 100ul przeciwciała pierwszorzędowego w PBS bezpośrednio na szkiełko nakrywki i inkubuj w temperaturze 2°C przez 1 godzinę. Przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe należy rozcieńczyć w PBS do wymaganego stężenia. Może to wymagać optymalizacji dla każdego użytego przeciwciała.</li>
 <li>Każde szkiełko nakrywki przemyj delikatnie 2-3 razy, używając 1ml PBS w temperaturze 2°C.</li>
 <li>Nanieś 20ul przeciwciała drugorzzędowego w PBS i inkubuj w temperaturze 2°C przez 1 godzinę, chroniąc przed światłem.</li>
 <li>Każde szkiełko nakrywki przemyj delikatnie 2-3 razy, używając 1ml PBS w temperaturze 2°C.</li>
 <li>Zamocuj każde szkiełko nakrywki (komórkami dołu) na szklanym preparacie mikroskopowym, używając medium montażowego Vectashield zawierającego DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole hydrochloride).</li>
 <li>Usuń nadmiar medium montażowego z okolic szkiełka nakrywki za pomocą ręcznika papierowego i inkubuj preparat w temperaturze 22°C przez co najmniej 30 minut, chroniąc przed światłem.</li>
 <li>Przymocuj szkiełko nakrywki do szklanego preparatu za pomocą bezbarwnego akrylowego lakieru do paznokci.</li>
 <li>Przechowuj preparaty w ciemności przed wizualizacją za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
</ol>
IV. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/1958/1958fig2.jpg" alt="Schemat mikroskopii immunofluorescencyjnej; α-tubulina, α-H1, α-laminy A/C w frakcjach komórkowych z użyciem DAPI i TRITC." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rysunek 2. Frakcjonowanie subkomórkowe nietransfekowanych komórek COS-7. Ufrakcjonowane komórki Cos-7 utrwalono formaldehydem, a następnie poddano immunostynowaniu z użyciem przeciwciał przeciwko $\alpha$-tubulinie, $\alpha$-histonie H1 lub $\alpha$-laminie A/C sprzężonych z TRITC, po czym zastosowano medium montażowe zawierające DAPI. Obrazy pozyskano za pomocą okularu 10x i obiektywu 63x przy użyciu konfokalnego mikroskopu Leica. Jądra komórkowe wizualizowano przy użyciu zestawu filtrów DAPI, natomiast w tym samym polu widzenia komórki barwione przeciwciałami markerowymi wizualizowano przy użyciu zestawu filtrów TRITC. 
<img src="/files/ftp_upload/1958/1958fig3.jpg" alt="Mikroskopia komórek barwionych DAPI oraz FITC-TRITC, przedstawiająca frakcje jądrowe i rozkład chromatyny." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rysunek 3. Białko fuzyjne GFP-6E2 wiąże się z macierzą jądrową. Frakcjonowanie subkomórkowe komórek Cos-7 wykazujących ekspresję białka fuzyjnego składającego się z zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) połączonego z białkiem E2 wirusa HPV typu 6 (GFP-6E2). Jądra komórkowe wizualizowano za pomocą barwienia DAPI, natomiast lokalizację GFP-6E2 w komórkach przetransfekowanych wizualizowano bezpośrednio poprzez fluorescencję GFP. Laminę A/C wizualizowano przy użyciu przeciwciał α-Lamin A/C sprzężonych z TRITC oraz zestawu filtrów TRITC. Obrazy z nałożeniem kanałów (merge) wykazują, że część białka GFP-6E2 jest związana z macierzą jądrową (panel prawy dolny). Obrazy uzyskano zgodnie z opisem w Rysunku 2.

<ol><li>Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopBP1+regulates+human+papillomavirus+type+16+E2+interaction+with+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">TopBP1 regulates human papillomavirus type 16 E2 interaction with chromatin.</a> J Virol. 81, 4338-4342 (2007).</li>
<li>Javed, A., Guo, B., Hiebert, S., Choi, J. Y., Green, J., Zhao, S. C., Osborne, M. A., Stifani, S., Stein, J. L., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Groucho%2FTLE%2FR-esp+proteins+associate+with+the+nuclear+matrix+and+repress+RUNX+%28CBF%28alpha%29%2FAML%2FPEBP2%28alpha%29%29+dependent+activation+of+tissue-specific+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Groucho/TLE/R-esp proteins associate with the nuclear matrix and repress RUNX (CBF(alpha)/AML/PEBP2(alpha)) dependent activation of tissue-specific gene transcription.</a> J Cell Sci. 113, 2221-2231 (2000).</li>
<li>Kowalczyk, A. M., Roeder, G. E., Green, K., Stephens, D. J., Gaston, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+induction+or+inhibition+of+apoptosis+by+HPV+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Measuring the induction or inhibition of apoptosis by HPV proteins.</a> Methods Mol. Med. 119, 419-432 (2005).</li>
<li>McLarren, K. W., Theriault, F. M., Stifani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+with+the+nuclear+matrix+and+interaction+with+Groucho+and+RUNX+proteins+regulate+the+transcription+repression+activity+of+the+basic+helix+loop+helix+factor+Hes1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Association with the nuclear matrix and interaction with Groucho and RUNX proteins regulate the transcription repression activity of the basic helix loop helix factor Hes1.</a> J Biol. Chem. 276, 1578-1584 (2001).</li>
<li>McNeil, S., Guo, B., Stein, J. L., Lian, J. B., Bushmeyer, S., Seto, E., Atchison, M. L., Penman, S., van Wijnen, A. J., Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+the+YY1+transcription+factor+to+the+nucleolus+and+the+nuclear+matrix+in+situ%3A+the+C-terminus+is+a+principal+determinant+for+nuclear+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Targeting of the YY1 transcription factor to the nucleolus and the nuclear matrix in situ: the C-terminus is a principal determinant for nuclear trafficking.</a> J Cell Biochem. 68, 500-510 (1998).</li>
<li>Melan, M. A., Sluder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redistribution+and+differential+extraction+of+soluble+proteins+in+permeabilized+cultured+cells.+Implications+for+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Redistribution and differential extraction of soluble proteins in permeabilized cultured cells. Implications for immunofluorescence microscopy.</a> J Cell Sci. 101, 731-743 (1992).</li>
<li>Zou, N., Lin, B. Y., Duan, F., Lee, K. Y., Jin, G., Guan, R., Yao, G., Lefkowitz, E. J., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hinge+of+the+human+papillomavirus+type+11+E2+protein+contains+major+determinants+for+nuclear+localization+and+nuclear+matrix+association%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The hinge of the human papillomavirus type 11 E2 protein contains major determinants for nuclear localization and nuclear matrix association.</a> J. Virol. 74, 3761-3770 (2000).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Typowe problemy i sugestie:
Wszystkie lub większość komórek zostają utracone podczas płukania. Podczas etapów płukania ciecze należy dodawać powoli, kierując je na ściankę płytki 6-dołkowej, aby uniknąć bezpośredniego strumienia na szkiełko podstawowe. Podobnie, ciecze należy usuwać poprzez ostrożne przechylenie płytki i powolne odpipetowanie nadmiaru płynu. Adhezję komórek można zwiększyć, stosując szkiełka podstawowe powlekane poli-L-lizyną.
DNA genomowe nie został...

<table><tbody><tr><td>BSA</td><td>Odczynnik chemiczny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Odczynnik chemiczny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lizyna</td><td>Odczynnik chemiczny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8920</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Odczynnik chemiczny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Odczynnik chemiczny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378-25G</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Odczynnik chemiczny</td><td>VWR</td><td>284216N</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Odczynnik chemiczny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6757</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Odczynnik chemiczny</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/8600/53</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Odczynnik chemiczny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6876</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowy z DAPI</td><td>Odczynnik chemiczny</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Fugene 6</td><td>Odczynnik chemiczny</td><td>Roche Group</td><td>11814443001</td><td></td></tr><tr><td>Histona H1</td><td>Przeciwciała</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-8030</td><td></td></tr><tr><td>Lamin A/C</td><td>Przeciwciała</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-20681</td><td></td></tr><tr><td>Tubulina-&amp;alpha;</td><td>Przeciwciała</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-32293</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ frakcjonowanie subkomórkowe adherentnych i nieadherentnych komórek ssaków

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Funkcja białek jest ściśle powiązana z ich lokalizacją. Choć niektóre białka są ograniczone do konkretnego miejsca lub przedziału subkomórkowego, wiele z nich występuje jako populacja swobodnie dyfundująca, znajdująca się w ciągłej wymianie z subpopulacją ściśle związaną z konkretną domeną lub strukturą subkomórkową. Frakcjonowanie subkomórkowe in situ umożliwia wizualizację kompartymentalizacji białek, a także może ujawnić subpopulacje białek lokalizujące się w określonych strukturach. Na przykład usunięcie rozpuszczalnych białek cytoplazmatycznych oraz słabo związanych białek jądrowych może ukazać trwałe powiązanie niektórych czynników transkrypcyjnych z chromatyną. Następujące po tym trawienie DNA może w niektórych przypadkach ujawnić powiązanie z siecią białek i RNA, określaną zbiorczo jako rusztowanie jądrowe lub macierz jądrowa.
W niniejszym materiale opisujemy kroki niezbędne do przeprowadzenia frakcjonowania in situ adherentnych i nieadherentnych komórek ssaków na szkiełkach podstawowych do mikroskopu. Wizualizację białek można przeprowadzić z wykorzystaniem swoistych przeciwciał lub fluorescencyjnych białek fuzyjnych oraz mikroskopii fluorescencyjnej. Przeciwciała i/lub barwniki fluorescencyjne pełniące rolę markerów konkretnych kompartmentów lub struktur pozwalają na szczegółowe mapowanie lokalizacji białek. Frakcjonowanie in situ można również połączyć z metodą western blotting w celu porównania ilości białek obecnych w każdej frakcji. To proste podejście biochemiczne może ujawnić powiązania, które w przeciwnym razie pozostałyby niewykryte.

In situ frakcjonowanie subkomórkowe komórek ssaków na szkiełkach podstawowych do mikroskopu umożliwia wizualizację lokalizacji białek.

In situ frakcjonowanie subkomórkowe adherentnych i nieadherentnych komórek ssaków

Funkcja białka jest ściśle powiązana z jego lokalizacją. Chociaż niektóre białka są ograniczone do konkretnego miejsca lub przedziału podkomórkowego, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest frakcjonowanie adherentnych i nieadherentnych komórek ssaków in situ w celu zbadania lokalizacji białek. Jest to osiągane poprzez uprzednie przytwierdzenie komórek do szkiełek podstawowych do mikroskopu. Drugim krokiem procedury jest usunięcie białek cytoplazmatycznych i słabo związanych białek jądrowych.Trzecim krokiem procedury jest usunięcie silnie związanych białek jądrowych. Ostatnim etapem procedury jest usunięcie frakcji chromatyny, co pozostawia macierz jądrową i dysocjowane białka na szkiełku podstawowym. W rezultacie można uzyskać wyniki obrazujące subkomórkową lokalizację i kolokalizację białek za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.Witajcie, nazywam się Anya Ho Hai i pracuję w laboratorium Kevina Gastona w School of Biochemistry na Uniwersytecie w Bristolu. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę frakcjonowania subkomórkowego. Wykorzystujemy tę metodę do badania lokalizacji czynników transkrypcyjnych.Zacznijmy zatem. W pierwszej kolejności zaprezentujemy procedury przytwierdzania do szkiełek nakrywek zarówno nieprzylegających, jak i przylegających komórek ssaków. W tym przypadku komórkami nieprzylegającymi są komórki K 5 6 2, a kom

in-situ-subcellular-fractionation-adherent-non-adherent-mammalian

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In situ Subfrakcjonowanie subkomórkowe przywierających i nieprzywierających komórek ssaków

Ten film opisuje przygotowanie frakcji subkomórkowych z komórek białaczkowych, co jest metodą generowania frakcji komórkowych i jądrowych z komórek białaczkowych. Frakcje jądrowe i cytoplazmatyczne można wykorzystać do dalszej analizy.

Przygotowanie frakcji subkomórkowych z komórek białaczkowych: metoda generowania frakcji komórkowych i jądrowych z komórek białaczkowych

Tutaj prezentujemy protokół frakcjonowania błony mózgowej, który stanowi solidną procedurę izolowania białek należących do różnych przedziałów synaptycznych.

Frakcjonowanie błony mózgowej: podejście ex vivo do oceny lokalizacji białek subsynaptycznych

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia prostego frakcjonowania komórkowego w celu subkomórkowej separacji białek cytoplazmatycznych i jądrowych w ludzkich biopsjach jelit świeżych i mrożonych.

Frakcjonowanie subkomórkowe ze świeżych i mrożonych próbek przewodu pokarmowego

Tutaj prezentujemy protokół izolacji błony plazmatycznej, cytoplazmy i mitochondriów komórek U937 bez użycia szybkiego wirowania. Technika ta może być stosowana do oczyszczania frakcji subkomórkowych w celu późniejszego zbadania lokalizacji białka za pomocą immunoblottingu.

Frakcjonowanie komórek U937 przy braku wirowania z dużą prędkością

Ten protokół umożliwia optymalizację i późniejsze efektywne generowanie frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych z pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej. Próbki te są wykorzystywane do określenia lokalizacji białek, a także zmian w transporcie białek, które zachodzą między przedziałami jądrowymi i cytoplazmatycznymi po stymulacji komórek i leczeniu farmakologicznym.

Subkomórkowe frakcjonowanie pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej w celu monitorowania transportu białek jądrowych/cytoplazmatycznych

Ten protokół frakcjonowania pozwoli badaczom wyizolować białka cytoplazmatyczne, jądrowe, mitochondrialne i błonowe z komórek ssaków. Dwie ostatnie frakcje subkomórkowe są dalej oczyszczane za pomocą gradientu gęstości izopikenowej.

Frakcjonowanie komórek U937 przez izopiknowe oczyszczanie w gradimencie gęstości

Ten protokół przedstawia solidną, szczegółową metodę uzyskiwania wysoce czystych synaptosomów, pęcherzyków synaptycznych i innych frakcji synaptycznych z mózgu myszy. Metoda ta umożliwia ocenę procesów synaptycznych, w tym analizę biochemiczną lokalizacji i funkcji białek z rozdzielczością kompartmentową.

Frakcjonowanie subkomórkowe w celu wyizolowania składników synaptycznych z mózgu myszy

Ta metoda zapewnia dostępny i elastyczny protokół do przygotowania siatek mikroskopii elektronowej (EM) do kriotomografii komórkowej in situ oraz korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej (CLEM).

Przygotowanie próbki do kriotomografii in situ komórek ssaków

Tutaj opisujemy metodę szybkiej homogenizacji wspomaganą separacją magnetyczną do produkcji na dużą skalę nanopęcherzyków pochodzących z endosomów jako nowy typ egzosomów naśladujących (EM), które mają to samo pochodzenie biologiczne i podobną strukturę, morfologię i skład białkowy natywnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV).

Metoda szybkiej homogenizacji wspomagana separacją magnetyczną do produkcji pęcherzyków pochodzących z endosomów na dużą skalę

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Poznaj metodę subkomórkowego frakcjonowania komórek ssaków in situ na szkiełkach mikroskopowych. Technika umożliwia wizualizację lokalizacji białek za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

In situ frakcjonowanie subkomórkowe adherentnych i nieadherentnych komórek ssaków

Przeglądaj więcej filmów