PAR-CliP - metoda identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących RNA w całym transkryptomie
2 lipca 2010
Transkrypty RNA podlegają rozległej regulacji potranskrypcyjnej, w której pośredniczy wiele trans-działających białek wiążących RNA (RBP). W tym miejscu przedstawiamy uogólnioną metodę precyzyjnej identyfikacji w skali całego transkryptomu miejsc wiązania RNA RBP.
Ogólnym celem tej procedury jest określenie szerokich miejsc wiązania transkryptomu białek wiążących RNA lub RVP. Osiąga się to poprzez pierwsze użycie fotoreaktywnych analogów nukleozydów do znakowania in vivo powstających transkryptów. Drugim etapem zabiegu jest sieciowanie RNA i białek wiążących RNA za pomocą światła UV o długości 365 nanometrów.
Trzecim etapem zabiegu jest immunoprecyptacja badanego białka wiążącego RNA i odzyskanie usieciowania do RNA. Ostatnim krokiem procedury jest przekształcenie RNA w bibliotekę CD NA i głęboką sekwencję. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują szerokie miejsca wiązania transkryptomu RVP i umożliwiają określenie elementu rozpoznającego RNA i jego preferencji wiązania.
Cześć, nazywam się Marcus Hoffner i pracuję w laboratorium Toma SEL na Uniwersytecie Rockefellera w Nowym Jorku. Dzisiaj pokażemy metodę zwaną par lip lub fotoowalnym analogiem nukleozydu żeber, wzmocnionym sieciowaniem i immunoprecypitacją. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do identyfikacji transkryptomu na podstawie jego skali, miejsc wiązania białek wiążących RNA oraz ich motywów wiążących i preferencji.
Dobra, więc zacznijmy. Sieciowanie UV in vivo rozpoczyna się w okapie z przepływem laminarnym. W tym protokole użyjemy oznaczonych IGF dwóch komórek BP one jako przykładowego modelu przy użyciu techniki sterylnej.
Rozwiń komórki HEK 2 93 stabilnie eksprymujące flagę HA, oznaczone IGF, dwa BP, jeden pod kontrolą represora Tet w pożywce do hodowli komórkowych HEK 2, 93, użyj od 100 do 400 razy 10 do szóstych komórek i wyhoduj je do około 80% płynności CO. Na 14 godzin przed usieciowaniem komórki miały fotoreaktywny analog rybozydu dla tiourydyny lub SU bezpośrednio do pożywki do hodowli komórkowej. Alternatywnie, sześć th guine lub sześć SG można zastosować po dodaniu fotoreaktywnego rybozydu, indukować ekspresję flagi HA znakowanej IGF, dwa BP, jeden przez dodanie komórek doksycykliny, są następnie inkubowane przez noc w inkubatorze komórkowym.
Następnie zdekantować podłoże wzrostowe. Następnie umyj komórki raz 10 mililitrami lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem na płytkę. Następnie całkowicie usunąć PBS przez dekantację.
Umieść odkryte płytki na tacy z lodem i naświetl je światłem UV o długości 365 nanometrów w łączniku bramowym 2, 400 UV crosslinker lub równoważnym po promieniowaniu UV, zeskrob komórki gumowym policjantem w jednym mililitrze PBS na płytkę. Przenieś komórki do 50-mililitrowych probówek wirówkowych i wiruj przy 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzuć super nazwę i zachowaj osad komórkowy.
W tym momencie granulki komórkowe można błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze minus 80 przez co najmniej 12 miesięcy. Aby kontynuować procedurę, ponownie zawiesić osad w trzech objętościach jednego buforu do lizy X NP 40 i inkubować na lodzie przez 10 minut. Oczyścić lizat komórkowy przez odwirowanie w stężeniu 13 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Po odwirowaniu należy dalej oczyścić lizat, filtrując go przez pięciomikronowy membranowy filtr strzykawkowy. Na koniec dodaj RNA T jeden do końcowego stężenia jednej jednostki na mikrolitr i inkubuj w łaźni wodnej w temperaturze 22 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie schłodzić reakcję na lodzie przez pięć minut.
Po sieciowaniu UV in vivo. Przygotuj kulki magnetyczne do immunoprecypitacji. Przenieś 10 mikrolitrów cząstek magnetycznych białka G z kulkami dyna na jeden mil lizatu komórkowego do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej.
Następnie umieść probówkę zawierającą koraliki na stojaku magnetycznym na jedną do dwóch minut. Usunąć supernatant i dodać jeden mililitr buforu fosforanowo-cytrynianowego do probówki, gdy znajduje się ona na separatorze magnetycznym. Następnie zakryj probówkę i zawiruj próbkę, aby ponownie zawiesić kulki.
Odwirować na krótko, aby zebrać wszelkie kulki pozostałe w nasadce probówki. Powtórz to płukanie z dodatkowym jednym mililitrem buforu fosforanu cytrynianu. Po przepłukaniu zawiesić kulki i bufor fosforanu cytrynianu w objętości dwukrotnie większej niż pierwotna objętość zawiesiny buraków.
Następnie dodać 0,25 miligrama przeciwciała monoklonalnego Anti-Flag M dwa na jeden mililitr zawiesiny do bicia. Po inkubacji inkubować zawiesinę na obracającym się kole przez 40 minut w temperaturze pokojowej, po inkubacji przemyć kulki dwukrotnie w jednym mililitrze buforu fosforanu cytrynianu, jak opisano poprzednio, przemywanie to służy do usunięcia wszelkich niezwiązanych przeciwciał po przemyciu Resus, zawiesić kulki i bufor fosforanu cytrynianu, jak przed czwartą. Aby rozpocząć immunoprecypitację, dodaj świeżo przygotowane kulki magnetyczne sprzężone z przeciwciałami do RNA T jeden litat komórkowy poddany działaniu przeciwciała.
Przenieś mieszaninę do 15-mililitrowych probówek wirowych i obracaj przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji zebrać kulki magnetyczne, wyrzucić supernatant i zawiesić kulki w jednym mililitrze bufora do płukania IP i przenieść je do 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych. Umyj koraliki zgodnie z wcześniejszym opisem dwa razy w jednym mililitrze buforu do płukania IP.
Po ostatnim praniu należy zawiesić kulki w pierwotnej objętości koralików bufora do płukania IP. Następnie dodaj RNAT jeden do końcowego stężenia 100 jednostek na mikrolitr. Zawiesinę kulek inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 22 stopni Celsjusza przez 15 minut.
Następnie schłodzić zawiesinę na lodzie przez pięć minut. Następnie umyj kulki trzy razy w jednym mililitrze bufora do płukania o wysokiej zawartości soli. Następnie ponownie zawieś kulki w jednej oryginalnej objętości kulki buforu defosforylacyjnego.
Dodać fosfatazę alkaliczną jelitową cielęcia do końcowego stężenia 0,5 jednostki na mikrolitr i inkubować zawiesinę przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przemyć kulki dwukrotnie w jednym mililitrze buforu do płukania fosfatazy, a następnie jeszcze dwa razy w kinazie polinukleotydowej lub buforze PNK bez DTT. Na koniec ponownie zawieś koraliki w jednej oryginalnej objętości koralików bufora PNK.
Aby rozpocząć znakowanie radiowe usieciowanego RNA. Dodać gamma 32 PATP i T four PNK do jednej oryginalnej objętości świeżo przygotowanej zawiesiny perełek. Inkubować zawiesinę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnie dodaj nieradioaktywny TP do zawiesiny i inkubuj go przez kolejne pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umyj kulki magnetyczne pięciokrotnie 800 mikrolitrami buforu PNK bez naziemnej telewizji cyfrowej. Na koniec ponownie zawieś koraliki w 70 mikrolitrach strony SDS.
Bufor ładujący inkubuje zawiesinę etykiety radiowej przez pięć minut w bloku grzewczym w temperaturze 95 stopni Celsjusza w celu denaturacji i uwolnienia białek wiążących immunologicznie wytrącone RNA z usieciowanym RNA. Następnie usuń kulki magnetyczne z separatora i przenieś super natin do czystej 1,5 mililitrowej mikrorurki wirówkowej Załaduj 40 mikrolitrów suade na studzienkę Novox bis triss od czterech do 12% prefabrykowanego żelu poliakrylamidowego i uruchom żel przez 55 minut przy napięciu 200 woltów. Po wypłynięciu żelu należy zdemontować komorę żelu i zdemontować płytki, pozostawiając żel zamontowany na jednej płytce, aby ułatwić wyrównanie żelu z wydrukiem na papierze do obrazowania fosfonim.
Wszczepić trzy maleńkie kawałki radioaktywnego żelu asymetrycznie w rogach żelu. Owiń żel w folię z tworzywa sztucznego, taką jak folia Saran, aby uniknąć zanieczyszczenia. Wystaw żel na pusty ekran imagera fosfonowego na godzinę, a następnie na obrazie fosfonowym.
Następnie wyrównaj żel na wydruku z obrazowania fosfo, używając wszczepionych kawałków żelu w celu orientacji. Wytnij prążki, które odpowiadają oczekiwanemu rozmiarowi białka wiążącego RNA lub RBP. Przenieś pasma do rurki MIDI dializatora DTU i dodaj 800 mikrolitrów jednego bufora elektrycznego XSDS.
Usieciowany kompleks R-N-A-R-B-P pod napięciem 100 woltów przez dwie godziny zgodnie z instrukcjami producenta. Po elucji elektrycznej. Dodać bufor proteinazy K i proteinazę K inkubować roztwór przez 30 minut w temperaturze 55 stopni Celsjusza.
Odzyskaj RNA przez ekstrakcję kwasowym fenolowo-chloroformowym alkoholem izoamylowym, a następnie ekstrakcję chloroformem. Następnie dodaj jeden mikrolitr glikogenu i wytrącić RNA, dodając trzy objętości etanolu. Na koniec rozpuść powstały granulat w 10,5 mikrolitra wody.
Po odzyskaniu RNA należy przeprowadzić go przez standardowy protokół przygotowania biblioteki CDNA i przeprowadzić staranną analizę bioinformatyczną odczytanej sekwencji. Reprezentatywne wyniki dla klipu par wykonanego z HK 2 93 komórkami wykazującymi ekspresję flagi H ha oznaczonej IGF dwa BP jeden pokazano z fotoreaktywnymi analogami nukleozydów czterema SU i sześcioma SG: skuteczność sieciowania alternatywnego fotoreaktywnego rybozydu sześć SG jest na ogół niższa niż dla czterech su. Niższa wydajność sieciowania może skutkować wyższym tłem sekwencji pochodzących z fragmentów obfitych komórkowych RNA, dlatego w eksperymencie należy początkowo użyć więcej komórek.
Różne fotoreaktywne analogi urydyny par clip są porównywane z tradycyjnym sieciowaniem UV 2 54 nanometrowym lub klipsem, jak pokazano tutaj. Sieciowanie białek RNA UV 2 54 nanometrów ma ograniczoną skuteczność sieciowania. Intensywność odpowiednio dobranego pasma radioaktywnego wskazuje, czy eksperyment z klipem par clip zadziałał i czy wyizolowano wystarczającą ilość RNA, aby przeprowadzić przez protokół sekwencjonowania małego RNA.
Częstość występowania charakterystycznych mutacji w sekwencjonowanych odczytach po analizie bioinformatycznej wskazuje na pomyślnie usieciowane sekwencje. Mutacje te to przejścia T, dwa, C przy użyciu czterech SU i przejścia G, dwa przejścia A przy użyciu sukcesu. G. Cechą charakterystyczną wargi parkowej jest możliwość wyznaczenia lokalizacji usieciowania krzyżowego poprzez punktację dla charakterystycznej mutacji rezydującej w bibliotekach CD NA przygotowanych z odzyskanych RNA.
Pozwala to na łatwe oddzielenie sygnału pochodzącego ze specyficznie związanych RNA, od szumu sekwencji pochodzących z wyizolowanych fragmentów licznych komórkowych RNA. Pokazaliśmy wam dzisiaj, jak wyizolować segmenty RNA, specyficznie rozpoznawane przez białka wiążące RNA. Podczas wykonywania tej procedury.
Ważne jest, aby pracować bez RNA. I to było to. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących RNA (RBP) w skali całego transkryptomu. Procedura wykorzystuje fotoreaktywne analogi nukleozydów oraz sieciowanie UV w celu ułatwienia badania oddziaływań RBP z RNA.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biologia molekularna
Wstęp
- Transkrypty RNA podlegają rozległej regulacji potranskrypcyjnej.
- Białka wiążące RNA (RBP) odgrywają kluczową rolę w tej regulacji.
- Identyfikacja miejsc wiązania RBP jest niezbędna do zrozumienia biologii RNA.
- Obecnym metodom może brakować precyzji lub możliwości zastosowania w całym transkryptomie.
Cel badania
- Opracowanie uniwersalnej metody identyfikacji miejsc wiązania białek RBP.
- Pogłębienie zrozumienia elementów rozpoznawania RNA oraz preferencji wiązania.
- Dostarczenie protokołu, który można zastosować do różnych białek wiążących RNA.
Zastosowane metody
- Znakowanie nascentnych transkryptów in vivo z wykorzystaniem fotoreaktywnych analogów nukleozydów.
- Sieciowanie RNA i białek wiążących RNA (RBP) za pomocą światła UV.
- Immunoprecypitacja białek RBP w celu odzyskania sieciowanego RNA.
- Sekwencjonowanie głębokie RNA w celu identyfikacji miejsc wiązania.
Główne wyniki
- Skuteczna identyfikacja miejsc wiązania RBP w całym transkryptomie.
- Definicja elementów rozpoznawania RNA oraz ich preferencji wiązania.
- Wykazanie możliwości zastosowania metody w różnych typach komórek.
Wnioski
- Opracowana metoda stanowi solidne podejście do badania oddziaływań RBP.
- Usprawnia ona zrozumienie mechanizmów regulacji potranskrypcyjnej.
- Technikę tę można wykorzystać w różnych kontekstach badawczych do zgłębiania biologii RNA.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Identyfikacja oddziaływań RNA-białko w całym transkryptomie umożliwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka w przypadku białek wiążących RNA będących celami terapeutycznymi we wczesnych etapach odkrywania leków. Metoda PAR-CliP zapewnia dyskryminację sygnału opartą na mutacjach, co zwiększa pewność w określaniu celu i redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich w procesach walidacji RBP. Wspiera to wiarygodność predykcyjną w identyfikacji wiodących związków poprzez wyjaśnienie elementów rozpoznawania RNA oraz preferencji wiązania w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez mapowanie bezpośrednich miejsc wiązania RNA przez białka RBP zaangażowane w regulację potranskrypcyjną.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje fotoreaktywne analogi nukleozydów (4-SU, 6-SG) oraz sieciowanie UV o długości fali 365 nm w celu uchwycenia przejściowych i trwałych oddziaływań w żywych komórkach.
- Wartość naukowa: Definiuje elementy rozpoznawania RNA i preferencje wiązania poprzez mutacje T→C lub G→A w sekwencjach cDNA, oddzielając rzeczywisty sygnał od tła.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe, znakowane mutacjami biblioteki cDNA do sekwencjonowania głębokiego, umożliwiając odtwarzalne wykrywanie fragmentów RNA związanych z RBP.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowane, skalowalne dane wejściowe do analizy bioinformatycznej, wspierając gotowość testów do przesiewania zaangażowania celu.
- Wartość naukowa: Charakteryzuje preferencje wiązania i wzbogacenie motywów, dostarczając informacji do projektowania małych cząsteczek lub oligonukleotydów celowanych w RNA.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy miejsca wiązania RBP z wynikami funkcjonalnymi w systemach istotnych dla chorób, wspierając dopasowanie biomarkerów translacyjnych.
- Wartość operacyjna: Metoda działa w różnych typach komórek (np. HEK293) i może być dostosowana do pierwotnych komórek lub komórek modeli chorobowych wykazujących ekspresję znakowanych RBP.
- Wartość naukowa: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektów z uwzględnieniem ryzyka poprzez wyjaśnienie mechanistycznych ról RBP w stabilności, splicingu lub translacji RNA.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda PAR-CliP wpisuje się w kontinuum odkrywania leków, od walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne badania mechanistyczne, zapewniając rozdzielczość miejsca wiązania, która determinuje dalsze strategie modulacji.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez identyfikację bezpośrednich celów RNA dla białek wiążących RNA (RBP) regulujących transkrypty istotne dla przebiegu chorób.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowe wyniki gotowe do sekwencjonowania, które umożliwiają porównanie wiązania w różnych warunkach, mutantach lub przy zaburzeniach terapeutycznych.
- Analityka: Opiera się na bioinformatycznej ocenie mutacji sygnaturowych (T→C, G→A) w celu odróżnienia RNA sieciowo powiązanego od tła, co umożliwia precyzyjne wyznaczanie pików (peak calling).
- Badania translacyjne: Łączy dane o wiązaniu molekularnym z ciągłością funkcjonalną poprzez powiązanie miejsc wiązania RBP z losem RNA w modelach przedklinicznych.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do profilowania różnych RBP (np. IGF2BP1) w wielu projektach, ograniczając redundantne opracowywanie metod.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności predykcyjnej w walidacji celów, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w mapowaniu regulonów RNA.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja dzięki zdefiniowanym warunkom sieciowania, filtrowaniu opartemu na mutacjach oraz powtarzalnemu przygotowaniu bibliotek.
- Wartość strategiczna: Lepsze podejmowanie decyzji go/no-go poprzez wyjaśnienie siły i specyficzności oddziaływań RBP-RNA, co redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja terapeutyków celujących w RNA z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowane miejsca wiązania i preferencje motywowe.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie klonowania molekularnego, hodowli komórkowej oraz protokołów sieciowania UV.
- Wymaga dostępu do urządzenia do sieciowania UV o długości fali 365 nm, odczynników do immunoprecypitacji oraz infrastruktury do sekwencjonowania głębokiego.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie dawkowania analogów, czasu sieciowania oraz rygorystyczności etapów przemywania.
- Wymaga adaptacji przy przejściu z modeli z nadekspresją białek znakowanych na systemy endogenne lub pierwotne komórki.
- Ograniczenie praktyczne: 6-SG wykazuje niższą wydajność sieciowania niż 4-SU, co wymusza zastosowanie większej liczby komórek w celu zniwelowania tła pochodzącego z obfitych komórkowych RNA.
