Name: PAR-CliP - metoda identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących RNA w całym transkryptomie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Poznaj metodę PAR-CliP do identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących RNA w całym transkryptomie. Wykorzystuje analogi nukleozydów i UV do badania interakcji RNA-białko.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium Tuschl za pomocne dyskusje. M.H. jest wspierany przez Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD). Prace te zostały wsparte przez Szwajcarski Fundusz Narodowy Grant #3100A0-114001 dla M.Z.; T.T. jest badaczem HHMI, a praca w jego laboratorium była wspierana przez granty NIH GM073047 i MH08442 oraz Fundację Starr.

Poniższy protokół opisuje procedurę PAR-CliP dla komórek HEK293 wykazujących ekspresję IGF2BP1 oznaczonych FLAG/HA po indukcji doksycykliną. Do immunoprecypitacji użyjemy przeciwciała anty-FLAG.
PAR-CliP będzie działać z dowolną linią komórkową wyrażającą wykrywalne poziomy endogennego, nieoznakowanego białka wiążącego RNA (RBP) interesującego użytkownika, jeśli dostępne jest skuteczne przeciwciało do immunoprecypitacji.
Rozwijanie komórek
<ol>
	<li>Rozwiń komórki FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 w pożywce wzrostowej. Jako punkt wyjścia zalecamy użycie6 komórek o wymiarach 100-400 x 10 (ok. 10-40 15 cm płytek do hodowli komórkowych). Wyhoduj je do około 80% zbieżności.</li>
 <li>14 godzin przed sieciowaniem dodać a) 4-tiourydynę do końcowego stężenia 100 μM (1:1000 v/v 1 M roztworu podstawowego 4-tiourydyny) bezpośrednio do pożywki do hodowli komórkowej i b) wywołać ekspresję FLAG/HA znakowanej IGF2BP1 przez dodanie 1 μg/ml doksycykliny (1:10 000 v/v 10 mg/ml roztworu podstawowego doksycykliny). UWAGA: zamiast 4-tiourydyny można również użyć 100 μM 6-tioguanozyny.</li>
</ol>
Sieciowanie UV
<ol>
	<li>Umyj komórki raz 10 ml lodowatego PBS na płytkę i całkowicie usuń PBS.</li>
 <li>Umieść płytki na tacy z lodem i naświetl odsłonięte światłem UV o długości fali 0,15 J/cm2 365 nm w urządzeniu Stratalinker 2400 (Stratagene) lub podobnym.</li>
 <li>Zeskrobać komórki gumowym policjantem w 1 ml PBS na płytkę, przenieść do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i zebrać przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C i wyrzucić supernatant. 100 x 106 komórek HEK293 (10 płytek 15 cm) da ok. 1 ml mokrego osadu komórkowego.</li>
 <li>(opcjonalnie) Jeśli nie chcesz kontynuować bezpośrednio lizy komórek, zamroź szokowo granulki komórkowe w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80°C. Granulki komórkowe można przechowywać przez co najmniej 12 miesięcy.</li>
</ol>
Liza komórek i trawienie RNaseT1
<ol>
	<li>Zebrać osad komórkowy usieciowanych komórek w 3 objętościach 1x buforu do lizy NP40 i inkubować na lodzie przez 10 minut.</li>
 <li>Lizat klarownych komórek przez odwirowanie w stężeniu 13 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Dalej oczyścić lizat, filtrując go przez membranowy filtr strzykawkowy 0,2 μm (Pall Acrodisc lub odpowiednik).</li>
 <li>Dodać RNazę T1 (fermenty, 10 000 U/μl) do końcowego stężenia 1 U/μl i inkubować w łaźni wodnej przez 15 minut w temperaturze 22°C. Następnie schłodzić reakcję przez 5 minut na lodzie przed kontynuacją.</li>
</ol>
Immunoprecypitacja i odzyskiwanie usieciowanych fragmentów docelowego RNA
Korzystanie z separatora magnetycznego
Postępuj zgodnie z tymi wskazówkami podczas przygotowywania próbki, aby zapobiec wysychaniu kulek magnetycznych.
<ol>
	<li>Umieść rurkę zawierającą koraliki na stojaku magnetycznym na 1 2 minuty.</li>
 <li>Dodaj bufor do probówki, gdy probówka znajduje się na separatorze magnetycznym.</li>
 <li>Zakryj rurkę, wyjmij ją z separatora magnetycznego i ponownie zawieś kulki. Możesz ponownie zawiesić koraliki, przesuwając rurkę palcem lub używając wirownika ustawionego na 5 6.</li>
 <li>Odwirować na krótko, aby zebrać wszelkie kulki, które mogą pozostać w nasadce probówki.</li>
 <li>W razie potrzeby powtórz kroki od 1 do 4.</li>
</ol>
Przygotowanie koralików magnetycznych
<ol>
	<li>Przenieś 10 μl cząstek magnetycznych Dynabeads Protein G (Invitrogen) na ml lizatu komórkowego (dla typowego eksperymentu powinno to być ok. 40 50 μl kulek) do probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml. Przemyć koraliki dwukrotnie 1 ml buforu cytrynianowo-fosforanowego.</li>
 <li>Zawiesić ponownie w podwójnej objętości buforu cytrynianowo-fosforanowego w stosunku do pierwotnej objętości zawiesiny kulek.</li>
 <li>Dodać 0,25 μg przeciwciała monoklonalnego anty-FLAG M2 (Sigma) na ml zawiesiny i inkubować na obracającym się kole przez 40 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przemyć kulki dwukrotnie w 1 ml buforu cytrynianowo-fosforanowego w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała.</li>
 <li>Ponownie zawiesić kulki w podwójnej objętości buforu cytrynianowo-fosforanowego w stosunku do pierwotnej objętości zawiesiny kulek.</li>
</ol>
Immunoprecypitacja (IP), trawienie drugiej RNazy T1 i defosforylacja
<ol>
	<li>Dodać 20 μl świeżo przygotowanych kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami na ml częściowego lizatu komórkowego poddanego działaniu RNazy T1 i inkubować w 15 ml probówkach wirówkowych na obracającym się kole przez 1 godzinę w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Zebrać kulki magnetyczne na magnetycznym kolektorze cząstek do probówek wirówkowych o pojemności 15 i 50 ml (Invitrogen) i przenieść do probówek do mikrofug o pojemności 1,5 ml.</li>
 <li>Umyj koraliki 3 razy w 1 ml buforu do płukania IP.</li>
 <li>Dodać RNazęT1 (fermenty, 10 000 U/μl) do końcowego stężenia 100 U/μl i inkubować zawiesinę kulek w łaźni wodnej przez 15 minut w temperaturze 22 °C. Następnie schłodzić na lodzie przez 5 minut.</li>
 <li>Umyj koraliki 3 razy w 1 ml buforu do płukania o wysokiej zawartości soli. </li>
 <li>Ponownie zawiesić kulki w 1 objętości buforu defosforylacyjnego</li>
 <li>Dodać fosfatazę alkaliczną jelit cieląt (, NEB) do końcowego stężenia 0,5 U/μl i inkubować zawiesinę przez 10 minut w temperaturze 37°C.</li>
 <li>Przemyć kulki dwukrotnie w 1 ml buforu do przemywania fosfatazy</li>
 <li>Przemyj koraliki dwukrotnie w buforze kinazy polinukleotydowej (PNK) bez DTT (stężenie DTT niezbędne do reakcji enzymatycznej jest wystarczająco wysokie, aby uszkodzić kulki magnetyczne).</li>
 <li>Zawieś ponownie koraliki w jednym oryginalnym woluminie ściegu bufora PNK</li>
</ol>
Radioznakowanie segmentów RNA usieciowanych z białkami immunoprecypitowanymi
<ol>
 <li>Do opisanej powyżej zawiesiny perełki dodać Υ-32P-ATP do końcowego stężenia 0,5 μCi/μl i T4 PNK (NEB) do 1 U/μl w jednej pierwotnej objętości kulki. Inkubować zawiesinę przez 30 minut w temperaturze 37°C.</li>
 <li>Dodać nieradioaktywny ATP do uzyskania końcowego stężenia 100 μM i inkubować przez kolejne 5 minut w temperaturze 37°C.</li>
 <li>Umyj kulki magnetyczne 5 razy 800 μl buforu PNK bez naziemnej telewizji cyfrowej.</li>
 <li>Zawieś koraliki w 70 μl bufora ładującego SDS-PAGE.</li>
</ol>
SDS-PAGE i elektroelucja usieciowanych kompleksów RNA-białko z plastrów żelu
<ol>
	<li>Inkubować znakowaną radioizotopem zawiesinę przez 5 minut w bloku grzewczym w temperaturze 95°C w celu denaturacji i uwolnienia immunoprecypitowanego RBP z usieciowanym RNA i wirem.</li>
 <li>Usuń kulki magnetyczne z separatora i przenieś supernatant do czystej probówki do mikronaftu o pojemności 1,5 ml.</li>
 <li>Załadować 40 μl supernatantu do studzienki prefabrykowanego żelu poliakryloamidowego Novex Bis-Tris 4-12% (Invitrogen) i uruchomić żel przez 55 minut przy napięciu 200 V.</li>
 <li>Zdemontuj komorę żelu i zdemontuj żel, pozostawiając go zamontowanego na jednej płycie. Aby ułatwić wyrównanie żelu z wydrukiem na papierze luminoskopowym, zalecamy asymetryczne wszczepienie trzech maleńkich kawałków żelu radioaktywnego w trzech z czterech rogów żelu. Radioaktywne kawałki żelu można pobrać z żeli, które wcześniej były używane do oczyszczania znakowanych radioaktywnie syntetycznych oligonukleotydów. Owiń żel w folię z tworzywa sztucznego (np. folię Saran), aby uniknąć zanieczyszczenia.</li>
 <li>Wystaw żel na wygaszony ekran phosphorimager na 1 godzinę i wizualizuj na phosphorimagerze.</li>
 <li>Wyrównaj żel na wydruku z luminoobrazurów, używając wszczepionych kawałków żelu w celu orientacji. Wytnij pasma, które odpowiadają oczekiwanej wielkości RBP (IGF2BP1, ok. 75 kDa) i przenieś do rurki D-Tube Dialyzer Midi Tube i dodaj 800 μl 1x bufor do pracy SDS.</li>
 <li>Usieciowany kompleks RNA-RBP należy poddać elektroelucji w buforze roboczym 1x SDS pod napięciem 100 V przez 2 godziny. wycięty z żelu i elektroeluowany w D-Tube Dialyzer Midi (Novagen) w buforze do pracy SDS o pojemności 800 μl zgodnie z instrukcją producenta.</li>
</ol>
Trawienie K proteinazy K
<ol>
 <li>Dodać równą objętość 2x buforu proteinazy K w stosunku do elektroeluatu, a następnie dodać proteinazę K (Roche) do końcowego stężenia 1,2 mg/ml. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 55°C.</li>
 <li>Odzyskać RNA przez ekstrakcję kwasowym fenolem/chloroformem/IAA (25:24:1, pH 4,0), a następnie ekstrakcję chloroformem. Dodać 1 μl glikogenu (10 mg/ml zapasu), wytrącić RNA, dodając 3 objętości etanolu. Rozpuść granulkę w 10,5 μl wody.</li>
</ol>
przygotowanie biblioteki cDNA i głębokie sekwencjonowanie
Przeprowadź odzyskane RNA przez standardowy protokół przygotowania biblioteki cDNA, pierwotnie opisany do klonowania małych regulatorowych RNA 19. Pierwszy etap, ligacja adaptera 3', przeprowadzono zgodnie z opisem w skali 20 μl przy użyciu 10,5 μl odzyskanego RNA. Użyj opisanych zestawów adapterów do sekwencjonowania Solexa. W zależności od ilości odzyskanego RNA, produkty 5'-adapter-3'-adapter bez insertów mogą być wykrywane po amplifikacji cDNA jako dodatkowe prążki PCR. W takich przypadkach należy wyciąć dłuższy produkt PCR o oczekiwanej wielkości z 3% żelu agarozowego NuSieve o niskiej temperaturze topnienia, wymyć produkt PCR z kawałków żelu za pomocą zestawu GelElute (Qiagen) i sekwencjonować przy użyciu technologii Solexa. Jedna seria sekwencjonowania Solexa zwykle zapewnia od 6 do 10 milionów odczytów sekwencji, które wystarczają do pokrycia transkryptomu miejsc wiązania białek wiążących RNA.
Analiza bioinformatyczna
Dokładna analiza bioinformatyczna odczytów sekwencji musi być przeprowadzona, aby uzyskać znaczący wgląd w miejsca wiązania RNA dla badanego RBP, takie jak element rozpoznający RNA, preferowane regiony wiązania RBP (egzoniczne vs. intronicowe, sekwencja kodująca vs. sekwencja nietranslowana). Odczyty sekwencji muszą być dostosowane do baz danych genomu i EST. Zwykle używamy mapowania odczytów w unikalny sposób do genomu z maksymalnie jednym niedopasowaniem, insercją lub usunięciem, aby zbudować klastry odczytów sekwencji, które można następnie dalej analizować. Częstość charakterystycznych mutacji w odczytach sekwencjonowanych klastrów, przejścia T do C przy użyciu 4-SU i przejścia G do A przy użyciu 6-SG, wskazują na pomyślnie usieciowane sekwencje. Z naszego doświadczenia wynika, że nieusieciowane RNA znakowane 4-SU wykazują wskaźnik mutacji tła wynoszący około 20%. Wskaźnik ten wzrasta do ok. 50-80% po usieciowaniu.
Szczegółowy opis analizy bioinformatycznej można znaleźć w materiałach uzupełniających do publikacji Hafnera i wsp.Rozdział 18
Opcjonalne kroki
Określenie poziomów włączenia 4-tiourydyny do całkowitego RNA
Wyizoluj całkowite RNA z linii komórkowej stabilnie wyrażającej RBP po wyhodowaniu na pożywce uzupełnionej 100 μM 4SU 16 godzin przed zbiorem. Jako kontrolę, zbieraj komórki wyhodowane bez dodatku 4SU. Wyizolować całkowite RNA przez dodanie 3 objętości odczynnika Trizol (Sigma) do przemytych granulek komórek zgodnie z instrukcjami producenta. było Dalsze oczyszczanie całkowitego RNA za pomocą Qiagen RNeasy zgodnie z protokołem producenta. Aby zapobiec utlenianiu 4SU podczas izolacji i analizy RNA, dodaj 0,1 mM ditiotreitolu (DTT) do płuczących i kolejnych etapów enzymatycznych. Trawienie i defosforylacja całkowitego RNA do pojedynczych nukleozydów do analizy HPLC, jak opisano wcześniej w pkt 20. Krótko, w objętości 30 μl, inkubuj 40 μg oczyszczonego całkowitego RNA przez 16 godzin w temperaturze 37 ° C z 0,4 U bakteryjną fosfatazą alkaliczną (Worthington Biochemical) i 0,09 U fosfodiesterazy jadu węża (Worthington Biochemical). Jako wzorzec odniesienia należy użyć syntetycznego RNA znakowanego 4SU (standardowo używamy CGUACGCGGAAUACUUCGA(4SU)U), a także poddać go całkowitemu trawieniu enzymatycznemu. Oddzielić powstałe mieszaniny rybonukleozydów za pomocą HPLC na kolumnie Supelco Discovery C18 (cząstka krzemionki 5 μM w fazie wiązanej, 250 x 4,6 mm) z odwróconymi fazami (Bellefonte PA, USA). HPLC to 0,1 M TEAA w 3% acetonitrylu (A) i 90% acetonitrylu w wodzie (B). Stosować gradient izokratyczny: 0% B przez 15 min, od 0 do 10% B przez 20 min, od 10 do 100% B przez 30 min. Zastosować 5-minutowe płukanie 100 % B stosowane między seriami w celu oczyszczenia kolumny HPLC.
Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2034/2034fig1.jpg" alt="Rysunek 1"> Rysunek 1 (prawy panel) pokazuje reprezentatywny wynik PAR-CliP przeprowadzonego na liniach komórkowych wyrażających IGF2BP1 oznaczone FLAG/HA z 4-SU i 6-SG. Zauważ, że skuteczność sieciowania 6-SG dla IGF2BP1 jest niższa niż skuteczność sieciowania dla 4-SU. Niższa skuteczność sieciowania spowoduje wyższe tło sekwencji pochodzących z fragmentów obfitych komórkowych RNA, dlatego należy rozważyć zwiększenie skali eksperymentu przy użyciu mniej wydajnych nukleozydów fotoreaktywnych. 
Lewy panel rysunku 1 pokazuje porównanie użycia różnych fotoreaktywnych analogów urydyny, które potencjalnie mogłyby być użyte do PAR-CliP w porównaniu z tradycyjnym sieciowaniem UV 254 nm. 
Intensywność radioaktywnego pasma o odpowiedniej długości daje Ci dobre pojęcie, czy eksperyment PAR-CliP zadziałał i wyizolowałeś wystarczającą ilość RNA do przeprowadzenia przez protokół sekwencjonowania małego RNA (opis krok po kroku przygotowania biblioteki cDNA do sekwencjonowania małych RNA można znaleźć w 19). Częstość występowania charakterystycznych mutacji w sekwencjonowanych odczytach, przejścia T do C w przypadku stosowania 4-SU i przejścia G do A w przypadku stosowania 6-SG, wskazują na pomyślnie usieciowane sekwencje. Z naszego doświadczenia wynika, że nieusieciowane RNA znakowane 4-SU wykazują wskaźnik mutacji tła wynoszący około 20%. Wskaźnik ten wzrasta do ok. 50-80% po usieciowaniu.

<ol><li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+regulons%3A+coordination+of+post-transcriptional+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat. Rev. Genet. 8 (7), 533-533 (2007).</li>
<li>Tenenbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 97 (26), 14085-14085 (2000).</li>
<li>Gerber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+mRNAs+associated+with+the+translational+regulator+PUMILIO+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of mRNAs associated with the translational regulator PUMILIO in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 103 (12), 4487-4487 (2006).</li>
<li>Lopez de Silanes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+target+RNA+motif+for+RNA-binding+protein+HuR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of a target RNA motif for RNA-binding protein HuR.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 101 (9), 2987-2987 (2004).</li>
<li>Greenberg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+light-induced+crosslinking+of+mRNA+to+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet light-induced crosslinking of mRNA to proteins.</a> Nucl. Acids Res. 6 (2), 715-715 (1979).</li>
<li>Wagenmakers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking+of+mRNA+to+proteins+by+irradiation+of+intact+cells+with+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Cross-linking of mRNA to proteins by irradiation of intact cells with ultraviolet light.</a> Eur. J. Biochem. 112 (2), 323-323 (1980).</li>
<li>Mayrand, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+nuclear+ribonucleoprotein%3A+identification+of+proteins+in+contact+with+poly%28A%29%2B+heterogeneous+nuclear+RNA+in+living+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure of nuclear ribonucleoprotein: identification of proteins in contact with poly(A)+ heterogeneous nuclear RNA in living HeLa cells.</a> The Journal of Cell Biology. 90 (2), 380-380 (1981).</li>
<li>Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+heterogeneous+nuclear+RNA-protein+complexes+in+vivo+with+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of heterogeneous nuclear RNA-protein complexes in vivo with monoclonal antibodies.</a> Mol. Cell. Biol. 4 (6), 1104-11 (1984).</li>
<li>Adam, S. A., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+proteins+associated+with+mRNA+and+hnRNA+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus proteins associated with mRNA and hnRNA in infected HeLa cells.</a> J. Virol. 61 (10), 3276-3276 (1987).</li>
<li>Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1212 (2003).</li>
<li>Licatalosi, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-464 (2008).</li>
<li>Yeo, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA+code+for+the+FOX2+splicing+regulator+revealed+by+mapping+RNA-protein+interactions+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 16 (2), 130-130 (2009).</li>
<li>Sanford, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+factor+SFRS1+recognizes+a+functionally+diverse+landscape+of+RNA+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Splicing factor SFRS1 recognizes a functionally diverse landscape of RNA transcripts.</a> Genome Res. 19 (3), 381-381 (2009).</li>
<li>Granneman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+binding+sites+on+U3+snoRNA+and+pre-rRNA+by+UV+cross-linking+and+high-throughput+analysis+of+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identification of protein binding sites on U3 snoRNA and pre-rRNA by UV cross-linking and high-throughput analysis of cDNAs.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. , (2009).</li>
<li>Guil, S., Caceres, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifunctional+RNA-binding+protein+hnRNP+A1+is+required+for+processing+of+miR-18a%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The multifunctional RNA-binding protein hnRNP A1 is required for processing of miR-18a.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14 (7), 591-591 (2007).</li>
<li>Chi, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute+HITS-CLIP+decodes+microRNA-mRNA+interaction+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps.</a> Nature. 460 (7254), 479-479 (2009).</li>
<li>Zisoulis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+discovery+of+endogenous+Argonaute+binding+sites+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive discovery of endogenous Argonaute binding sites in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. , (2010).</li>
<li>Hafner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. , (2010).</li>
<li>Hafner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+microRNAs+and+other+small+regulatory+RNAs+using+cDNA+library+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of microRNAs and other small regulatory RNAs using cDNA library sequencing.</a> Methods. 44 (1), 3-3 (2008).</li>
<li>Andrus, A., Kuimelis, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base+composition+analysis+of+nucleosides+using+HPLC%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Nucleic+Acid+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Base composition analysis of nucleosides using HPLC.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. Chapter 10 (Unit 10.6), (2001).</li>
</ol>

T.T. jest współzałożycielem i doradcą naukowym Alnylam Pharmaceuticals oraz doradcą Regulus Therapeutics.

<table><tbody><tr><td colspan="4">i odczynniki</td></tr><tr><td colspan="4">Pożywka wzrostowa HEK293 cells</td></tr><tr><td colspan="4"><ul> <li>DMEM</li> <li>10% FBS</li> <li>2 mM L-glutamina</li> <li>100 U/ml penicyliny</li> <li>100 U/ml streptomycyny</li> <li>100 &mu; g/ml higromycyny</li> <li>15 &g; g/ml blasticydyny</li> </ul></td></tr><tr><td colspan="4">4-tiourydyna roztwór podstawowy (1 M)</td></tr><tr><td colspan="4"><ul> <li>260.27 mg 4-tiourydyna</li> <li>1 ml DMSO</li> </ul></td></tr><tr><td colspan="4">Zapas doksycykliny (10 mg/ml)</td></tr><tr><td colspan="4"><ul> <li>10 mg doksycykliny</li> <li>1 ml DMSO</li> </ul></td></tr><tr><td colspan="4">1x bufor do lizy NP40</td></tr><tr><td colspan="4">Przygotuj zapas 5x buforu bez inhibitorów DTT i proteazy. Dodaj DTT i inhibitor proteazy bezpośrednio przed eksperymentem.</td></tr><tr><td colspan="4"><ul> <li>50 mM HEPES, pH 7,5</li> <li>150 mM KCl</li> <li>2 mM EDTA</li> <li>1 mM NaF</li> <li>0,5% (v/v) NP40</li> <li>0,5 mM DTT</li> <li> kompletny koktajl inhibitorów proteaz wolnych od EDTA (Roche)</li> </ul></td></tr><tr><td colspan="4">Bufor cytrynianowo-fosforanowy</td></tr><tr><td colspan="4"><ul> <li>4,7 g/l kwas cytrynowy</li> <li>9,2 g/l Na2HPO4</li> <li>pH 5,0</li> </ul></td></tr><tr><td colspan="4">bufor do mycia IP</td></tr><tr><td colspan="4"><ul> <li>50 mM HEPES-KOH, pH 7,5</li> <li>300 mM KCl</li> <li>0,05% (v/v) NP40</li> <li>0,5 mM DTT (dodać bezpośrednio przed eksperymentem)</li> <li>kompletny koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA (Roche) (dodać bezpośrednio przed eksperymentem)</li> </ul></td></tr><tr><td colspan="4">Bufor do płukania o wysokiej zawartości soli</td></tr><tr><td colspan="4"><ul> <li>50 mM HEPES-KOH, pH 7,5</li> <li>500 mM KCl</li> <li>0,05% (v/v) NP40</li> <li>0,5 mM DTT (dodać bezpośrednio przed eksperymentem)</li> <li>kompletny koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA (Roche) (dodać bezpośrednio przed eksperymentem)</li> </ul></td></tr><tr><td colspan="4">Bufor defosforylacyjny</td></tr><tr><td colspan="4"><ul> <li>50 mM Tris-HCl, pH 7,9</li> <li>100 mM NaCl</li> <li>10 mM MgCl2</li> <li>1 mM DTT</li> </ul></td></tr><tr><td colspan="4">Bufor do płukania fosfatazy</td></tr><tr><td colspan="4"><ul> <li>50 mM Tris-HCl, pH 7,5</li> <li>20 mM EGTA</li> <li>0,5% (v/v) NP40</li> </ul></td></tr><tr><td colspan="4">Bufor kinazy polinukleotydowej (PNK) bez DTT</td></tr><tr><td colspan="4"><ul> <li>50 mM Tris-HCl, pH 7,5</li> <li>50 mM NaCl</li> <li>10 mM MgCl2</li> </ul></td></tr><tr><td colspan="4">bufor PNK</td></tr><tr><td colspan="4"><ul> <li>50 mM Tris-HCl, pH 7,5</li> <li>50 mM NaCl</li> <li>10 mM MgCl2</li> <li>5 mM DTT</li> </ul></td></tr><tr><td colspan="4">bufor ładowania strony SDS</td></tr><tr><td colspan="4"><ul> <li>10% glicerolu (v/v)</li> <li>50 mM Tris-HCl, pH 6,8</li> <li>2 mM EDTA</li> <li>2% SDS (w/v)</li> <li>100 mM DTT</li> <li>0,1% błękit bromofenolowy</li> </ul></td></tr><tr><td colspan="4">2x bufor proteinazy K</td></tr><tr><td colspan="4"><ul> <li>100 mM Tris-HCl, pH 7,5</li> <li>150 mM NaCl</li> <li>12,5 mM EDTA</li> <li>2% (w/v) SDS</li> </ul></td></tr></tbody></table>

par-clip - metoda identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących rna w całym transkryptomie

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

Transkrypty RNA są poddawane potranskrypcyjnej regulacji genów poprzez interakcję z setkami białek wiążących RNA (RBP) i kompleksów rybonukleoprotein zawierających mikroRNA (miRNP), które często ulegają ekspresji w zależności od typu komórki. Aby zrozumieć, w jaki sposób wzajemne oddziaływanie tych czynników wiążących RNA wpływa na regulację poszczególnych transkryptów, niezbędne są mapy interakcji białko-RNA in vivo o wysokiej rozdzielczości 1.
Kombinacja podejść genetycznych, biochemicznych i obliczeniowych jest zazwyczaj stosowana do identyfikacji interakcji RNA-RBP lub RNA-RNP. Profilowanie mikromacierzy RNA związanych z immunooczyszczanymi RBP (RIP-Chip)2 definiuje cele na poziomie transkryptomu, ale jego zastosowanie ogranicza się do charakterystyki oddziaływań stabilnych kinetycznie i tylko w rzadkich przypadkach3,4 pozwala zidentyfikować element rozpoznający RBP (RRE) w obrębie długiego docelowego RNA. Bardziej bezpośrednie informacje o miejscu docelowym RBP uzyskuje się przez połączenie sieciowania in vivo UV5,6 z immunoprecypitacją7-9, a następnie izolacją usieciowanych segmentów RNA i sekwencjonowaniem cDNA (CLIP)10. CLIP wykorzystano do identyfikacji celów szeregu RBP11-17. Jednak CLIP jest ograniczony przez niską skuteczność sieciowania białka RNA UV 254 nm, a lokalizacja usieciowania nie jest łatwa do zidentyfikowania w sekwencjonowanych usieciowanych fragmentach, co utrudnia oddzielenie docelowych segmentów RNA usieciowanych promieniami UV od nieusieciowanych fragmentów RNA tła obecnych również w próbce.
Opracowaliśmy potężne podejście do sieciowania opartego na komórkach, aby określić w wysokiej rozdzielczości i dla całego transkryptomu miejsca wiązania komórkowych RBP i miRNP, które nazywamy PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (zobacz Rys. 1A dla zarysu metody). Metoda opiera się na włączaniu fotoreaktywnych analogów rybonukleozydów, takich jak 4-tiourydyna (4-SU) i 6-tioguanozyna (6-SG) do powstających transkryptów RNA przez żywe komórki. Naświetlanie komórek światłem UV o długości fali 365 nm indukuje skuteczne sieciowanie komórkowych RNA znakowanych fotoreaktywnymi nukleozydami do oddziałujących RBP. Po immunoprecypitacji interesującego RBP następuje izolacja usieciowanego i koimmunoprecypitowanego RNA. Wyizolowane RNA jest przekształcane w bibliotekę cDNA i głęboko sekwencjonowane przy użyciu technologii Solexa. Jedną z charakterystycznych cech bibliotek cDNA przygotowanych przez PAR-CliP jest to, że dokładne położenie sieciowania można zidentyfikować na podstawie mutacji znajdujących się w sekwencjonowanym cDNA. W przypadku stosowania 4-SU usieciowane sekwencjonuje przejście tymidyny do cytydyny, podczas gdy użycie 6-SG powoduje mutacje guanozyny do adenozyny. Obecność mutacji w sekwencjach usieciowanych umożliwia ich oddzielenie od tła sekwencji pochodzących z licznego komórkowego RNA.
Zastosowanie tej metody do wielu różnych białek wiążących RNA zostało opisane w Hafner et al.Rozdział 18

Transkrypty RNA podlegają rozległej regulacji potranskrypcyjnej, w której pośredniczy wiele trans-działających białek wiążących RNA (RBP). W tym miejscu przedstawiamy uogólnioną metodę precyzyjnej identyfikacji w skali całego transkryptomu miejsc wiązania RNA RBP.

PAR-CliP - metoda identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących RNA w całym transkryptomie

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Ogólnym celem tej procedury jest określenie szerokich miejsc wiązania transkryptomu białek wiążących RNA lub RVP. Osiąga się to poprzez pierwsze użycie fotoreaktywnych analogów nukleozydów do znakowania in vivo powstających transkryptów. Drugim etapem zabiegu jest sieciowanie RNA i białek wiążących RNA za pomocą światła UV o długości 365 nanometrów.Trzecim etapem zabiegu jest immunoprecyptacja badanego białka wiążącego RNA i odzyskanie usieciowania do RNA. Ostatnim krokiem procedury jest przekształcenie RNA w bibliotekę CD NA i głęboką sekwencję. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują szerokie miejsca wiązania transkryptomu RVP i umożliwiają określenie elementu rozpoznającego RNA i jego preferencji wiązania.Cześć, nazywam się Marcus Hoffner i pracuję w laboratorium Toma SEL na Uniwersytecie Rockefellera w Nowym Jorku. Dzisiaj pokażemy metodę zwaną par lip lub fotoowalnym analogiem nukleozydu żeber, wzmocnionym sieciowaniem i immunoprecypitacją. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do identyfikacji transkryptomu na podstawie jego skali, miejsc wiązania białek wiążących RNA oraz ich motywów wiążących i preferencji.Dobra, więc zacznijmy. Sieciowanie UV in vivo rozpoczyna się w okapie z przepływem laminarnym. W tym protokole użyjemy oznaczonych IGF dwóch komórek BP one jako przykładowego modelu przy użyciu techniki sterylnej.Rozwiń komórki HEK 2 93 stabilnie eksprymujące flagę HA, oznaczone IGF, dwa BP, jeden pod kontrolą represora Tet w pożywce do hodowli komórkowych HEK 2, 93, użyj od 100 do 400 razy 10 do szóstych komórek i wyhoduj je do około 80% płynności CO. Na 14 godzin przed usieciowaniem komórki miały fotoreaktywny analog rybozydu dla tiourydyny lub SU bezpośrednio do pożywki do hodowli komórkowej. Alternatywnie, sześć th guine lub sześć SG można zastosować po dodaniu fotoreaktywnego rybozydu, indukować ekspresję flagi HA znakowanej IGF, dwa BP, jeden przez dodanie komórek doksycykliny, są następnie inkubowane przez noc w inkubatorze komórkowym.Następnie zdekantować podłoże wzrostowe. Następnie umyj komórki raz 10 mililitrami lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem na płytkę. Następnie całkowicie usunąć PBS przez dekantację.Umieść odkryte płytki na tacy z lodem i naświetl je światłem UV o długości 365 nanometrów w łączniku bramowym 2, 400 UV crosslinker lub równoważnym po promieniowaniu UV, zeskrob komórki gumowym policjantem w jednym mililitrze PBS na płytkę. Przenieś komórki do 50-mililitrowych probówek wirówkowych i wiruj przy 500 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzuć super nazwę i zachowaj osad komórkowy.W tym momencie granulki komórkowe można błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze minus 80 przez co najmniej 12 miesięcy. Aby kontynuować procedurę, ponownie zawiesić osad w trzech objętościach jednego buforu do lizy X NP 40 i inkubować na lodzie przez 10 minut. Oczyścić lizat komórkowy przez odwirowanie w stężeniu 13 000 G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odwirowaniu należy dalej oczyścić lizat, filtrując go przez pięciomikronowy membranowy filtr strzykawkowy. Na koniec dodaj RNA T jeden do końcowego stężenia jednej jednostki na mikrolitr i inkubuj w łaźni wodnej w temperaturze 22 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie schłodzić reakcję na lodzie przez pięć minut.Po sieciowaniu UV in vivo. Przygotuj kulki magnetyczne do immunoprecypitacji. Przenieś 10 mikrolitrów cząstek magnetycznych białka G z kulkami dyna na jeden mil lizatu komórkowego do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej.Następnie umieść probówkę zawierającą koraliki na stojaku magnetycznym na jedną do dwóch minut. Usunąć supernatant i dodać jeden mililitr buforu fosforanowo-cytrynianowego do probówki, gdy znajduje się ona na separatorze magnetycznym. Następnie zakryj probówkę i zawiruj próbkę, aby ponownie zawiesić kulki.Odwirować na krótko, aby zebrać wszelkie kulki pozostałe w nasadce probówki. Powtórz to płukanie z dodatkowym jednym mililitrem buforu fosforanu cytrynianu. Po przepłukaniu zawiesić kulki i bufor fosforanu cytrynianu w objętości dwukrotnie większej niż pierwotna objętość zawiesiny buraków.Następnie dodać 0,25 miligrama przeciwciała monoklonalnego Anti-Flag M dwa na jeden mililitr zawiesiny do bicia. Po inkubacji inkubować zawiesinę na obracającym się kole przez 40 minut w temperaturze pokojowej, po inkubacji przemyć kulki dwukrotnie w jednym mililitrze buforu fosforanu cytrynianu, jak opisano poprzednio, przemywanie to służy do usunięcia wszelkich niezwiązanych przeciwciał po przemyciu Resus, zawiesić kulki i bufor fosforanu cytrynianu, jak przed czwartą. Aby rozpocząć immunoprecypitację, dodaj świeżo przygotowane kulki magnetyczne sprzężone z przeciwciałami do RNA T jeden litat komórkowy poddany działaniu przeciwciała.Przenieś mieszaninę do 15-mililitrowych probówek wirowych i obracaj przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji zebrać kulki magnetyczne, wyrzucić supernatant i zawiesić kulki w jednym mililitrze bufora do płukania IP i przenieść je do 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych. Umyj koraliki zgodnie z wcześniejszym opisem dwa razy w jednym mililitrze buforu do płukania IP.Po ostatnim praniu należy zawiesić kulki w pierwotnej objętości koralików bufora do płukania IP. Następnie dodaj RNAT jeden do końcowego stężenia 100 jednostek na mikrolitr. Zawiesinę kulek inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 22 stopni Celsjusza przez 15 minut.Następnie schłodzić zawiesinę na lodzie przez pięć minut. Następnie umyj kulki trzy razy w jednym mililitrze bufora do płukania o wysokiej zawartości soli. Następnie ponownie zawieś kulki w jednej oryginalnej objętości kulki buforu defosforylacyjnego.Dodać fosfatazę alkaliczną jelitową cielęcia do końcowego stężenia 0,5 jednostki na mikrolitr i inkubować zawiesinę przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przemyć kulki dwukrotnie w jednym mililitrze buforu do płukania fosfatazy, a następnie jeszcze dwa razy w kinazie polinukleotydowej lub buforze PNK bez DTT. Na koniec ponownie zawieś koraliki w jednej oryginalnej objętości koralików bufora PNK.Aby rozpocząć znakowanie radiowe usieciowanego RNA. Dodać gamma 32 PATP i T four PNK do jednej oryginalnej objętości świeżo przygotowanej zawiesiny perełek. Inkubować zawiesinę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie dodaj nieradioaktywny TP do zawiesiny i inkubuj go przez kolejne pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umyj kulki magnetyczne pięciokrotnie 800 mikrolitrami buforu PNK bez naziemnej telewizji cyfrowej. Na koniec ponownie zawieś koraliki w 70 mikrolitrach strony SDS.Bufor ładujący inkubuje zawiesinę etykiety radiowej przez pięć minut w bloku grzewczym w temperaturze 95 stopni Celsjusza w celu denaturacji i uwolnienia białek wiążących immunologicznie wytrącone RNA z usieciowanym RNA. Następnie usuń kulki magnetyczne z separatora i przenieś super natin do czystej 1,5 mililitrowej mikrorurki wirówkowej Załaduj 40 mikrolitrów suade na studzienkę Novox bis triss od czterech do 12% prefabrykowanego żelu poliakrylamidowego i uruchom żel przez 55 minut przy napięciu 200 woltów. Po wypłynięciu żelu należy zdemontować komorę żelu i zdemontować płytki, pozostawiając żel zamontowany na jednej płytce, aby ułatwić wyrównanie żelu z wydrukiem na papierze do obrazowania fosfonim.Wszczepić trzy maleńkie kawałki radioaktywnego żelu asymetrycznie w rogach żelu. Owiń żel w folię z tworzywa sztucznego, taką jak folia Saran, aby uniknąć zanieczyszczenia. Wystaw żel na pusty ekran imagera fosfonowego na godzinę, a następnie na obrazie fosfonowym.Następnie wyrównaj żel na wydruku z obrazowania fosfo, używając wszczepionych kawałków żelu w celu orientacji. Wytnij prążki, które odpowiadają oczekiwanemu rozmiarowi białka wiążącego RNA lub RBP. Przenieś pasma do rurki MIDI dializatora DTU i dodaj 800 mikrolitrów jednego bufora elektrycznego XSDS.Usieciowany kompleks R-N-A-R-B-P pod napięciem 100 woltów przez dwie godziny zgodnie z instrukcjami producenta. Po elucji elektrycznej. Dodać bufor proteinazy K i proteinazę K inkubować roztwór przez 30 minut w temperaturze 55 stopni Celsjusza.Odzyskaj RNA przez ekstrakcję kwasowym fenolowo-chloroformowym alkoholem izoamylowym, a następnie ekstrakcję chloroformem. Następnie dodaj jeden mikrolitr glikogenu i wytrącić RNA, dodając trzy objętości etanolu. Na koniec rozpuść powstały granulat w 10,5 mikrolitra wody.Po odzyskaniu RNA należy przeprowadzić go przez standardowy protokół przygotowania biblioteki CDNA i przeprowadzić staranną analizę bioinformatyczną odczytanej sekwencji. Reprezentatywne wyniki dla klipu par wykonanego z HK 2 93 komórkami wykazującymi ekspresję flagi H ha oznaczonej IGF dwa BP jeden pokazano z fotoreaktywnymi analogami nukleozydów czterema SU i sześcioma SG: skuteczność sieciowania alternatywnego fotoreaktywnego rybozydu sześć SG jest na ogół niższa niż dla czterech su. Niższa wydajność sieciowania może skutkować wyższym tłem sekwencji pochodzących z fragmentów obfitych komórkowych RNA, dlatego w eksperymencie należy początkowo użyć więcej komórek.Różne fotoreaktywne analogi urydyny par clip są porównywane z tradycyjnym sieciowaniem UV 2 54 nanometrowym lub klipsem, jak pokazano tutaj. Sieciowanie białek RNA UV 2 54 nanometrów ma ograniczoną skuteczność sieciowania. Intensywność odpowiednio dobranego pasma radioaktywnego wskazuje, czy eksperyment z klipem par clip zadziałał i czy wyizolowano wystarczającą ilość RNA, aby przeprowadzić przez protokół sekwencjonowania małego RNA.Częstość występowania charakterystycznych mutacji w sekwencjonowanych odczytach po analizie bioinformatycznej wskazuje na pomyślnie usieciowane sekwencje. Mutacje te to przejścia T, dwa, C przy użyciu czterech SU i przejścia G, dwa przejścia A przy użyciu sukcesu. G. Cechą charakterystyczną wargi parkowej jest możliwość wyznaczenia lokalizacji usieciowania krzyżowego poprzez punktację dla charakterystycznej mutacji rezydującej w bibliotekach CD NA przygotowanych z odzyskanych RNA.Pozwala to na łatwe oddzielenie sygnału pochodzącego ze specyficznie związanych RNA, od szumu sekwencji pochodzących z wyizolowanych fragmentów licznych komórkowych RNA. Pokazaliśmy wam dzisiaj, jak wyizolować segmenty RNA, specyficznie rozpoznawane przez białka wiążące RNA. Podczas wykonywania tej procedury.Ważne jest, aby pracować bez RNA. I to było to. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

par-clip-method-to-identify-transcriptome-wide-binding-sites-rna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Przestrzenne rozmieszczenie białek wiążących RNA na transkrypcie jest kluczowym czynnikiem regulacji potranskrypcyjnej. Opracowaliśmy zatem metodę sieciowania promieniami UV i immunoprecypitacji z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu (iCLIP), która umożliwia precyzyjne mapowanie w całym genomie miejsc wiązania białka wiążącego RNA.

iCLIP – Mapowanie oddziaływań białko-RNA w całym transkryptomie z rozdzielczością pojedynczych nukleotydów

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Opisujemy protokół do identyfikacji białek wiążących RNA i mapowania ich regionów wiążących RNA w żywych komórkach za pomocą fotosieciowania za pośrednictwem UV i spektrometrii mas.

Przygotowanie próbki do identyfikacji regionów wiążących RNA w oparciu o spektrometrię mas

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Przedstawiono szczegółowy protokół stosowania strategii CARIC (ang. click chemistry-assisted RNA-interactome capture) do identyfikacji białek wiążących się zarówno z kodującymi, jak i niekodującymi RNA.

Wychwytywanie i identyfikacja białek wiążących RNA za pomocą strategii wychwytywania interaktomu RNA wspomaganej chemią kliknięcia (CARIC)

Specyficzność sekwencji jest kluczowa dla regulacji genów. Białka regulatorowe, które rozpoznają określone sekwencje, są ważne dla regulacji genów. Zdefiniowanie funkcjonalnych miejsc wiązania dla takich białek jest trudnym problemem biologicznym. Iteracyjne podejście do identyfikacji miejsca wiązania białka wiążącego RNA jest opisane tutaj i ma zastosowanie do wszystkich białek wiążących RNA.

Badanie przestrzeni sekwencji w celu identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących regulatorowe RNA

Tutaj prezentujemy protokół eCLIP do określania głównych celów RNA kandydatów na RBP w jądrach.

Metoda ulepszonego sieciowania immunoprecypitacyjnego (eCLIP) do skutecznej identyfikacji RNA związanego z białkiem w jądrach myszy

Tutaj prezentujemy zmodyfikowany protokół CLIP-seq o nazwie FbioCLIP-seq z tandemowym oczyszczaniem FLAG-biotyna w celu określenia celów RNA białek wiążących RNA (RBP) w komórkach ssaków.

Profilowanie interakcji białko-RNA w całym transkryptomie poprzez sieciowanie krzyżowe i immunoprecypitację za pośrednictwem tandemowego oczyszczania FLAG-biotyna

Kinetyczne sieciowanie i analiza cDNA to metoda, która pozwala badać dynamikę interakcji białko-RNA w żywych komórkach w wysokiej rozdzielczości czasowej. Tutaj protokół jest szczegółowo opisany, w tym wzrost komórek drożdży, sieciowanie UV, zbieranie, oczyszczanie białek i etapy przygotowania biblioteki sekwencjonowania nowej generacji.

Monitorowanie dynamiki interakcji białko-RNA in vivo w wysokiej rozdzielczości czasowej przy użyciu χCRAC

Tutaj prezentujemy zoptymalizowaną metodę in vitro do odkrywania, ilościowego i walidacji interaktorów białkowych specyficznych sekwencji RNA, przy użyciu całkowitego ekstraktu białkowego z komórek ludzkich, kulek streptawidyny pokrytych biotynylowanym RNA oraz analizy spektrometrii mas.

Zoptymalizowana ilościowa analiza typu pull-down białek wiążących RNA przy użyciu krótkiego biotynylowanego RNA

Poznaj metodę PAR-CliP do identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących RNA w całym transkryptomie. Wykorzystuje analogi nukleozydów i UV do badania interakcji RNA-białko.

PAR-CliP - metoda identyfikacji miejsc wiązania białek wiążących RNA w całym transkryptomie

Przeglądaj więcej filmów