Immunofluorescencyjna detekcja dwóch analogów tymidyny (CldU i IdU) w tkance pierwotnej
7 grudnia 2010
Opracowaliśmy strategię wykrywania sekwencyjnego wbudowywania analogów tymydyny (CldU i IdU) w tkanki dorosłych myszy w celu ilościowego określenia dwóch następujących po sobie cykli podziałów komórkowych. Strategia ta jest przydatna do wykrywania wymiany komórkowej w tkankach długożyjących, transformacji onkogennej lub komórek wzmacniających przejście.
Witajcie w protokole barwienia metodą Calor D-U-I-D-U. Nasze dzisiejsze nagranie rozpoczyna się od kroku trzeciego: rehydratacji, permeabilizacji i odzyskiwania antygenów. Rozpocznij od umieszczenia preparatów w kasecie.
Po załadowaniu preparatów umieść je w kąpieli z ksylenem na pięć minut. Następnie przeprowadź drugą kąpiel w ksylenem, ponownie przez pięć minut.
Kontynuuj rehydratację preparatów, przenosząc je do roztworów etanolu, zaczynając od roztworu 100% i kończąc na 50%. Następnie zakończ rehydratację preparatów, umieszczając je na pięć minut w 1xPBS w celu permeabilizacji błon komórkowych. Zanurz preparaty w 0,2% roztworze Triton X na pięć minut. Przygotuj preparaty do mikrofalowej odzyskiwania antygenów z tkanek, umieszczając je w szklanym naczyniu z odpowiednią ilością 0,01 M buforu cytrynian sodu, tak aby roztwór zakrywał preparaty do wysokości pięciu centymetrów powyżej ich górnej krawędzi.
Aby zrekompensować straty wynikające z odparowania, mikrofalowo podgrzewaj preparaty, aż roztwór zacznie wrzeć. Powinno to zająć od 3 do 10 minut przy pełnej mocy. Sprawdź, czy preparaty wrząą.
Zmniejsz moc mikrofalówki do poziomu między 10 a 80% i kontynuuj powolne gotowanie preparatów przez kolejne 20 minut. Po gotowaniu umieść zlewkę z preparatami na blacie laboratoryjnym, aby powoli schłodziły się przez około dwie godziny, aż osiągną temperaturę pokojową. Potwierdź, że preparaty są w temperaturze pokojowej.
Zanurz preparaty w 1,5 naturalnym kwasie solnym na 40 minut w temperaturze pokojowej. Wyjmij preparaty z kwasu solnego i umieść je na pięć minut w pierwszym płukaniu 1x PBS. Następnie przeprowadź drugie płukanie 1x PBS.
Wyjmij preparaty z roztworu dostępu 1x PBS, używając woskowego pisaka do blokowania cieczy. Obrysuj każdą sekcję tkanki i włóż preparat z powrotem do PBS. Przygotuj wilgotną komorę inkubacyjną, umieszczając mokry ręcznik papierowy na dnie szczelnego pojemnika.
Przygotować roztwór blokujący składający się z 10% surowicy blokującej rozcieńczonej w 1x XPBS. W przypadku przekrojów tkanek o typowych wymiarach około 1x1,5 cm ważne jest, aby każdy z nich został całkowicie pokryty roztworem. Wystarczająca będzie objętość 50 µL roztworu blokującego.
Przygotować przeciwciało pierwotne anty-IDU poprzez rozcieńczenie antysera mysiego anty-BRDU w 5% serum osiołkowym. Zastosować rozcieńczenie od 1:1 do 1:250. Nanieść pipetą roztwór pierwotny na każdy przekrój na szkiełku.
Umieść preparaty na szkiełkach w lodówce w temperaturze 4°C. W przypadku inkubacji przez noc przygotuj bufor do płukania o wysokiej rygorystyczności. Dobrze sprawdza się TBST.
Ustawienie slajdów tyłem do siebie. Umieść slajdy w około 35 do 40 mililitrów roztworu TBST. Umieść probówki w inkubatorze do kultur bakteryjnych z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C.
Pozostaw próbki do wstrząsania przez 20 minut przy 225 RPM. Teraz umieść preparaty na szkiełkach w kasecie. Umieść szkiełka w jednym XPBS w celu pięciominutowego przemycia w PBS.
Następnie należy przeprowadzić drugie płukanie w XPBS przez pięć minut. Przygotować roztwór przeciwciał pierwszorzędowych CLDU poprzez rozcieńczenie przeciwciał szczurzych anty-BRDU w 5% serum osiołka. Dodać stężenie 1:250, położyć preparaty na ręczniku papierowym, a następnie obrysować je pisakiem woskowym.
Za pomocą pipety pokryj każdy przekrój tkanki roztworem pierwotnego przeciwciała CLDU. Użyj około 50 µL roztworu, aby upewnić się, że każdy przekrój tkanki jest całkowicie pokryty. Umieść preparaty w lodówce w temperaturze 4 °C w celu inkubacji przez noc.
Umieść preparaty na szkiełkach w kasecie, a następnie przełóż je do pierwszego roztworu płuczącego 1x PBS na pięć minut. Przenieś szkiełka do drugiego roztworu płuczącego 1x PBS na pięć minut. Przygotuj przeciwciała wtórne, rozcieńczając przeciwciała CY2 donkey anti-RAD oraz PS5 donkey anti-mouse w 5% surowicy osła. Do barwienia jąder komórkowych zostanie użyty DPI. Całkowicie pokryj przekroje tkankowe przeciwciałami wtórnymi.
50 µl roztworów powinno być wystarczających do całkowitego pokrycia tkanki. Umieść komorę rehydratacyjną w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej i inkubuj przez jedną godzinę. Umieść preparaty w kasecie, a następnie poddaj je jednokrotnemu przemywaniu w XPBS przez pięć minut.
Umieść preparaty w drugim roztworze do płukania 1x PBS na pięć minut. Odchyl nadmiar roztworu PBS na ręcznik papierowy. Następnie pobierz medium montażowe Prolong Gold Antifade i nanieś małą kroplę na każdy przekrój tkanki.
Pobierz szkiełko nakrywkę i delikatnie połóż ją na skrawkach preparatu. Użyj ręcznika papierowego jako docisku, aby usunąć nadmiar pęcherzyków powietrza, które mogły zostać uwięzione między skrawkami a szkiełkiem nakrywką. Na koniec, za pomocą końcówki pipety, usuń wszelkie pozostałe pęcherzyki powietrza. Wykonaj obrazowanie badanej tkanki, korzystając z mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w wysokoenergetyczne źródło światła oraz wiele kanałów fluorescencyjnych w celu ilościowego określenia wyników.
Rozpocznij od policzenia liczby komórek pozytywnych pod kątem Dabi. Policz liczbę komórek pozytywnych pod kątem CLDU, korzystając z dwukanałowego obrazu SI. Policz liczbę komórek pozytywnych pod kątem IDU, korzystając z pięciokanałowego obrazu SCI.
Na koniec należy policzyć komórki z podwójnym znakowaniem pozytywnym, przełączając się między plikami obrazów z kanału SCI two i SCI five.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę wykrywania sekwencyjnej inkorporacji analogów tymydyny (CldU i IdU) w tkankach dorosłych myszy, umożliwiającą kwantyfikację dwóch następujących po sobie rund podziałów komórkowych. Technika ta jest cenna w badaniach nad wymianą komórek w tkankach długożyjących, transformacją onkogenną oraz komórkami przejściowo amplifikującymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Neuronauka
- Onkologia
Wstęp
- Analogi tymidyny są wykorzystywane do znakowania dzielących się komórek.
- Zrozumienie procesu podziału komórkowego jest kluczowe dla badania regeneracji tkanek.
- Wymiana komórkowa ma istotne znaczenie zarówno w fizjologii prawidłowej, jak i w stanach chorobowych.
- Sekwencyjne znakowanie może dostarczyć informacji na temat dynamiki populacji komórkowych.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnej metody ilościowego oznaczania podziałów komórkowych w tkankach.
- Ocena wpływu wymiany komórkowej w różnych kontekstach biologicznych.
- Pogłębienie zrozumienia procesów onkogennych poprzez analizę podziałów komórkowych.
Zastosowane metody
- Sekwencyjne wbudowywanie CldU i IdU w tkankach mysich.
- Mikroskopia fluorescencyjna w celu wizualizacji znakowanych komórek.
- Kwantyfikacja komórek wykazujących pozytywną reakcję z DAB, CldU i IdU.
- Zastosowanie specyficznych przeciwciał do detekcji analogów tymidyny.
Główne wyniki
- Skuteczne wykrywanie sekwencyjnego podziału komórek w próbkach tkanek.
- Ilościowa analiza wskaźników wymiany komórkowej.
- Identyfikacja potencjalnych markerów transformacji onkogennej.
- Wgląd w zachowanie komórek wzmacniających przejścia (transit-amplifying cells).
Wnioski
- Opracowana metoda stanowi solidne podejście do badania podziałów komórkowych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia dynamiki tkanek w stanie zdrowia i choroby.
- Technikę tę można zastosować w różnych obszarach badawczych, w tym w onkologii i medycynie regeneracyjnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładna kwantyfikacja sekwencyjnego podziału komórek umożliwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka w procesie walidacji celu poprzez wyjaśnienie dynamiki proliferacyjnej w układach istotnych dla przebiegu choroby. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych, odróżniając przejściowe odpowiedzi proliferacyjne od odpowiedzi trwałych, co wspomaga identyfikację wiodących związków i selekcję projektów badawczych. Możliwość zastosowania tej metody w tkankach o długim czasie życia usprawnia odkrywanie biomarkerów translacyjnych w onkologii i medycynie regeneracyjnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez pomiar dwóch następujących po sobie rund podziałów komórkowych w tkance pierwotnej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośrednią wizualizację kinetyki proliferacyjnej w modelach chorobowych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez kwantyfikację tempa wymiany komórek, co pozwala określić wiarygodność celu oraz modulację szlaków.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszej oceny związków za pomocą zestandaryzowanych protokołów immunobarwienia.
- Wynik ilościowy: Generuje mierzalne liczby komórek wykazujących pozytywną reakcję na DAB, CldU i IdU w celu uzyskania powtarzalnych punktów końcowych przesiewu.
- Skalowalność: Zoptymalizowano pod kątem podawania niskich dawek analogów tymydyny poprzez wodę pitną, co umożliwia prowadzenie badań nad przewlekłym dawkowaniem w modelach przedklinicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Stosowane w celu identyfikacji transformacji onkogennej oraz oceny udziału komórek wzmacniających (transit-amplifying cells) we wzroście tkanki.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, dostarczając ilościowych danych o proliferacji w różnych typach tkanek.
- Decyzje dostosowane do ryzyka: Wspiera strategie rozwoju, wyjaśniając, czy obserwowany wzrost wynika z aktywności komórek macierzystych, czy z ekspansji komórek wzmacniających.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po badania przedkliniczne skuteczności – dostarczając wskaźników proliferacji, które wspierają decyzje typu go/no-go na każdym etapie.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez ilościowe określanie sekwencyjnej syntezy DNA w odpowiedzi na perturbacje farmakologiczne lub genetyczne.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy przekroje tkanek ze zestandaryzowaną detekcją wbudowania analogu tymydyny do badań przesiewowych związków.
- Analityka: Umożliwia porównywanie indeksów proliferacyjnych w różnych warunkach poprzez separację kanałów fluorescencyjnych i kwantyfikację komórek podwójnie dodatnich.
- Badania translacyjne: Łączy wczesną fazę odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez śledzenie dynamiki linii komórkowych w tkankach istotnych dla ludzkich chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do podłużnych badań proliferacji w wielu obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu, dostarczając bezpośrednich dowodów na historię podziałów komórkowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanym procesom permeabilizacji, odzyskiwania antygenów oraz wielokrotnego barwienia immunocytochemicznego.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów na podstawie ich potencjału proliferacyjnego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez odróżnianie efektów terapeutycznych w obrębie populacji komórek macierzystych i komórek progenitorowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie immunohistochemii i mikroskopii fluorescencyjnej w celu detekcji multipleksowej.
- Zależne od dostępu do infrastruktury do odzyskiwania antygenów (mikrofala, bufor cytrynianowy) oraz możliwości sekwencyjnej inkubacji przeciwciał.
- Wymaga standaryzacji protokołów blokowania, płukania i montowania między zespołami w celu zminimalizowania efektów serii.
- Adaptacja w różnych systemach modelowych wymaga walidacji specyficzności przeciwciał i przepuszczalności tkanek w każdym kontekście.
- Ograniczenia praktyczne obejmują potencjalne maskowanie epitopów oraz konieczność optymalizacji schematów dawkowania analogów w celu uniknięcia toksyczności.
