Wytwarzanie mikrotkanek z wykorzystaniem modułów żelu kolagenowego zawierającego komórki

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie modułowych mikrotkanek, które mogą być wykorzystane w eksperymentach z zakresu inżynierii tkankowej. Jest to osiągane poprzez najpierw zaciągnięcie roztworu kolagenu do rurki polietylenowej za pomocą strzykawki, a następnie żelowanie kolagenu. Drugim krokiem jest pocięcie rurki polietylenowej na odcinki o długości dwóch milimetrów w celu uformowania modułów mikrotkankowych.

Trzecim krokiem procedury jest oddzielenie modułów od rurek, a na koniec moduły są pokrywane komórkami śródbłonka. Ostatecznie powstałe mikrotkanki mogą być wykorzystane w testach komórkowych in vitro do badania interakcji komórek za pomocą komory mikrofluidycznej. Ponadto mikrotkanki mogą zostać zaimplantowane w celu wytworzenia tkanek do badania interakcji i przebudowy mikrotkanek in vivo.

Witajcie, nazywam się Brendan Long i reprezentuję laboratorium Sepan na Uniwersytecie w Toronto. Główną przeszkodą w tworzeniu dużych trójwymiarowych substytutów tkanek jest brak szybkiej waskularyzacji po implantacji. W tym filmie pokażemy Państwu, jak stworzyć modułową tkankę pokrytą komórkami śródbłonka, aby pomóc pokonać to ograniczenie.

Procedurę zaprezentuje Chamberlain, stażysta pooperacyjny z laboratorium Septin. Ilość kolagenu do neutralizacji będzie zależeć od długości rurki polietylenowej. W tym pokazie użyjemy dwumetrowej rurki polietylenowej o średnicy wewnętrznej 0,76 millimeter i średnicy zewnętrznej 1,22 millimeter.

Aby przygotować rurkę, wprowadź igłę 20 G do jednego z jej końców, a następnie umieść rurkę w samouszczelniającej torebce konwertora w celu sterylizacji gazowej. Ponieważ jeden mililitr kolagenu wypełnia około dwóch metrów rurki polietylenowej, zneutralizujemy jeden mililitr kolagenu. Umieść kolagen w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i przechowuj probówkę w lodzie.

Do probówki dodać 128 µL 10x alpha-MEM na każdy mililitr kolagenu i wymieszać poprzez wielokrotne pipetowanie roztworu. Należy uważać, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza; roztwór powinien zmienić barwę na żółtą w miarę mieszania się alpha-MEM z zakwaszonym kolagenem. Następnie zneutralizować kolagen, dodając 0,8 M wodorowęglanu sodu. Aby wstępnie oszacować pH, dodawać wodorowęglan sodu do momentu, aż żółty roztwór kolagenu zmieni kolor na jasnoróżowy.

Zazwyczaj potrzeba od 30 do 60 µL na mililitr kolagenu, aby uzyskać pH 7,4. Aby zapobiec żelowaniu zneutralizowanego kolagenu, należy przechowywać go w lodzie do momentu użycia. Aby rozpocząć procedurę żelowania kolagenu, należy przenieść worek zawierający wysterylizowaną rurkę polietylenową do komory z laminarnym przepływem powietrza i odciąć zamknięty koniec worka, pozostawiając rurkę wewnątrz.

Za pomocą wysterylizowanej pęsety przymocuj strzykawkę o pojemności 3 ml do igły o rozmiarze 20 G, która została wcześniej włożona do jednego końca rurki. Wprowadź drugi koniec rurki do zneutralizowanego kolagenu, aż końcówka znajdzie się na dnie probówki stożkowej, która jest utrzymywana w lodzie. Ten kolejny krok należy wykonać powoli, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do kolagenu.

Powoli cofnij tłok strzykawki, aby zassać kolagen do rurki polietylenowej. Po przeciągnięciu kolagenu przez rurkę wyjmij igłę o rozmiarze 20 G i włóż oba końce rurki z powrotem do worka. Po zaklejeniu worka taśmą inkubuj go w temperaturze 37 °C przez 60 minut.

Do przecięcia rurki zostanie użyte wcześniej zmontowane urządzenie tnące. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść rurkę w sterylnej kuwecie przed urządzeniem tnącym, a następnie wprowadź rurkę do urządzenia tnącego przez jego wylot; przygotuj probówkę stożkową o pojemności 50 ml zawierającą 25 ml pożywki dla komórek śródbłonka. Aby zebrać wycięte moduły, ustaw urządzenie tnące na długość cięcia 2 mm, a następnie przetnij rurkę.

Inkubować wycięte moduły w 50 ml probówce stożkowej w temperaturze 37 °C przez 60 minut. Aby usunąć moduły kolagenowe z probówki, poddać probówkę stożkową 50 ml zawierającą moduły wirowaniu w wortexie z umiarkowaną prędkością przez 10 sekund. Pozostawić moduły do osiadania na dnie probówki, co zajmuje około pięciu minut.

Na dnie probówki utworzy się luźny osad modułów, natomiast rurki utworzą warstwę na powierzchni medium. Po osiedleniu się modułów należy użyć szerokootworowej pipety serologicznej o pojemności 10 mililitrów, aby przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie należy wymieszać zawartość stożkowej probówki 15 mililitrów w wortexie i dwukrotnie powtórzyć proces osadzania modułów.

Osiadłe moduły z drugiego i trzeciego wiru są również przenoszone do probówki o pojemności 15 ml. Po usunięciu wszystkich modułów z rurek i ich połączeniu, należy uzupełnić objętość medium w probówce do 5 ml. Moduły są teraz gotowe do pokrycia komórkami śródbłonka; w kolejnym kroku zostanie przedstawione przygotowanie komórek śródbłonka do pokrycia modułów.

W pierwszej kolejności należy usunąć medium z komórek i przemyć je PBS. Po usunięciu PBS należy dodać 3 mL trypsyny z EDTA i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Następnie komórki należy resuspender w 7 mL medium i przenieść do probówki o pojemności 15 mL.

Policz komórki za pomocą hematocytometru; będziesz potrzebować 5 × 10⁶ komórek śródbłonka na mililitr upakowanych modułów na dnie probówki stożkowej. Odwirowuj komórki przy 300 G przez pięć minut. Resuspenduj osad komórkowy w pięciu mililitrach pożywki dla komórek śródbłonka.

Następnie do modułów należy dodać pięć mililitrów pożywki zawierającej komórki śródbłonka. Moduły inkubuje się z komórkami śródbłonka zarówno statycznie, jak i dynamicznie; w przypadku inkubacji statycznej moduły z komórkami śródbłonka należy wymieszać poprzez odwrócenie probówki, a następnie ustawić ją pionowo w temperaturze 37 °C na 15 minut. Po 15 minutach probówkę należy ponownie odwrócić i inkubować w temperaturze 37 °C przez kolejne 15 minut.

Aby inkubować moduły z komórkami śródbłonka dynamicznie, należy delikatnie kołysać probówką o pojemności 15 ml w temperaturze 37 °C przez 60 minut. Po zakończeniu inkubacji z komórkami śródbłonka przenieść moduły na płytkę nieprzystosowaną do hodowli tkanek i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia umieścić moduły na nowej płytce nieprzystosowanej do hodowli tkanek ze świeżą pożywką, aby usunąć nieprzytwierdzone komórki śródbłonka. Inkubować moduły pokryte komórkami śródbłonka w temperaturze 37 °C do momentu, aż komórki pokryją 100% powierzchni modułów.

Zazwyczaj trwa to około siedmiu dni. Bezpośrednio po wyjęciu z probówki moduły będą miały kształt cylindryczny. Jeśli są pokryte komórkami śródbłonka, ich objętość może zmniejszyć się do 50% poprzez skurcz, a one same mogą przybrać owalny kształt oraz stać się gęstsze i bardziej nieprzezroczyste w badaniu pod mikroskopem świetlnym.

Na tych obrazach średnica i długość modułów są oznaczone odpowiednio jako d i l. Kolejny obraz przedstawia komórki Hep G2 zatopione i równomiernie rozmieszczone w modułach w momencie ich wytwarzania. Komórki zachowały wysoką żywotność, co potwierdza zielony kolor żywych komórek.

Martwe komórki będą miały czerwony kolor, gdy komórki śródbłonka osiągną konfluencję. Na powierzchni modułów tworzą się połączenia ścisłe, co można zaobserwować za pomocą immunofluorescencji. Analiza transportu masy przy barwieniu na VE-kadherynę wykazała, że moduły są w stanie utrzymać wysoką gęstość komórek bez tworzenia się rdzenia nekrotycznego wynikającego z niewystarczającego transportu tlenu, co często stanowi problem w przypadku większych tkanek.

W tym przykładzie barwienie trójkolorowe typowych małych modułów wykazało, że moduły zachowały jednolity i wysoki rozkład żywych komórek siedem dni po wytworzeniu. W przeciwieństwie do nich, w rdzeniu dużych modułów powstała znaczna liczba martwych komórek, pozostawiając jedynie cienki pierścień żywotnych komórek. Wytworzono również moduły z mieszaniny kolagenu i polimeru syntetycznego lub zawierające mikrosfery uwalniające lek.

W tym przypadku, gdy komórki h hm EC są osadzone na modułach z kolagenu i PLGA, moduły zachowują swój cylindryczny kształt, a właściwości przylegania komórek są ograniczone w porównaniu z modułami składającymi się wyłącznie z kolagenu. Przedstawiony jest obraz z mikroskopu świetlnego modułu kolagenowego zawierającego biodegradowalne mikrosfery na bazie PLGA. Wykazano, że kilka testów in vitro jest kompatybilnych z modułami.

Na przykład w teście angiogenezy formacje przypominające kapilary na module zasiedlonym przez komórki śródbłonka można łatwo wykryć i skwantyfikować po pięciu dniach inkubacji z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej. W innym przykładzie obrazy z mikroskopii konfokalnej z testu żywotności komórek na modułach wykazują komórki żywe zabarwione na zielono oraz komórki martwe zabarwione na czerwono. Wreszcie moduły były stosowane w komorach mikrofluidycznych oraz implantowane myszom i szczurom w celu zbadania oddziaływań między różnymi typami komórek oraz sposobu przebudowy mikrotkanek w wyniku odpowiedzi organizmu gospodarza.

Po przeprowadzeniu procedury moduły można hodować w szalce Petriego lub w innych naczyniach, takich jak bioreaktor lub urządzenie mikroprzepływowe. Metodę tę można również dostosować do tworzenia różnych tkanek, stosując różne kombinacje typów komórek lub rurki o różnej średnicy. Dziękujemy za oglądanie.