Name: Wytwarzanie mikrotkanek przy użyciu modułów komórek zawierających żel kolagenowy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Naucz się wytwarzać modułowe mikrotkanki z żelu kolagenowego do badań inżynierii tkankowej. Ta metoda umożliwia pokrycie komórkami śródbłonka i zastosowanie w badaniach in vitro oraz in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zostało zapewnione przez National Institutes of Health (EB 001013), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada oraz Canadian Institutes of Health Research. Dziękujemy dr A. P. McGuigan za wiedzę ekspercką i pomoc w opracowaniu modułów.

1) Przygotowanie drenów
<ol>
<li>Odciąć odcinki rurki polietylenowej o długości od 2 do 3 m (średnica wewnętrzna 0,76 mm x średnica zewnętrzna 1,2 mm).</li>
<li>Wsunąć igłę 20 G1 w jeden z końców rurki.</li>
<li>Zwinąć rurkę w coil i umieścić w samouszczelniającej torebce do autoklawowania (7 1/2" x 13"). Oba końce rurki należy umieścić przy nieszczelnym końcu torebki i przymocować za pomocą taśmy do sterylizacji gazowej.</li>
<li>Zamknąć torebkę i poddać sterylizacji gazowej.</li>
</ol>
2) Neutralizacja kolagenu
Uwaga: 1 ml kolagenu wypełnia około 2 m rurki polietylenowej.
<ol>
<li> Umieść w stożkowatej probówce o pojemności 15 ml odpowiednią ilość kolagenu niezbędną do uzyskania pożądanej długości rurki i przechowuj na lodzie. </li>
<li> Do probówki dodaj 128 uL 10x α-MEM na każdy mL kolagenu i wymieszaj, wielokrotnie pipetując roztwór. Uwaga: (1) roztwór powinien zmienić kolor na żółty w miarę mieszania α-MEM z zakwaszonym kolagenem oraz (2) podczas mieszania należy starać się ograniczyć powstawanie pęcherzyków powietrza.</li>
<li> Zneutralizuj kolagen, dodając 0,8 M wodorowęglan sodu, aż kolagen osiągnie pH 7,4. Aby wstępnie oszacować pH, dodawaj wodorowęglan sodu, dopóki żółty roztwór kolagenu nie zmieni koloru na jasnoróżowy. Uwaga: zazwyczaj potrzeba od 30 do 60 μL na każdy mL kolagenu.</li>
<li> Przechowuj zneutralizowany kolagen na lodzie do momentu użycia, ponieważ w temperaturze powyżej 4°C zneutralizowany kolagen ulegnie żelowaniu.</li>
</ol>
3) Osadzanie komórek (opcjonalnie)
Uwaga: W zależności od typu komórek, można je zamykać w matrycy w stężeniu od 1 miliona komórek na mL do 20 milionów komórek na mL. Należy użyć pożywki wymaganej dla komórek, które mają zostać zamknięte w matrycy.
<ol>
<li>Usunąć medium z komórek i przemyć je 5 mL PBS.</li>
<li>Usunąć PBS i dodać 3 mL trypsyny-EDTA.</li>
<li>Inkubować komórki w trypsynie-EDTA przez 5 min w temperaturze 37°C.</li>
<li>Resuspendować komórki w 7 mL medium.</li>
<li>Policzyć komórki.</li>
<li>Przenieść wymaganą liczbę komórek do zatopienia do probówki stożkowej o pojemności 15 mL.</li>
<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 min.</li>
<li>Odssać medium znad osadu komórkowego.</li>
<li>Resuspendować komórki w zneutralizowanym kolagenie i przechowywać na lodzie.</li>
</ol>
4) Żelowanie kolagenu
<ol>
<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza odciąć zamknięty koniec worka zawierającego rurkę polietylenową.</li>
<li>Za pomocą sterylnej pęsety przymocować strzykawkę 3 ml do igły 20G znajdującej się na jednym końcu rurki. Rurkę należy pozostawić w worku.</li>
<li>Za pomocą sterylnej pęsety wprowadzić drugi koniec rurki do zneutralizowanego kolagenu, aż jej końcówka dotrze do dna probówki stożkowej. Probówkę stożkową należy przechowywać na lodzie.</li>
<li>Wciągnąć kolagen do rurki polietylenowej, powoli cofając tłok strzykawki. 
Uwaga: Zbyt szybkie wciąganie kolagenu do rurki spowoduje powstanie pęcherzyków powietrza w kolagenie.</li>
<li>Po przeciągnięciu kolagenu przez rurkę, wyjąć igłę 20G z rurki i włożyć oba jej końce z powrotem do worka. Zamknąć worek taśmą.</li>
<li>Inkubować worek w temperaturze 37°C przez 60 min. Jeśli kolagen zawiera komórki, należy odwracać worek co 15 min, aby zapobiec osiadaniu komórek na jednej stronie modułu.</li>
</ol>
5) Odcinanie rurek zawierających żelową kolagenową strukturę
<ol>
<li>Autoklawować głowice i ostrze urządzenia tnącego oraz tackę do rurek.</li>
<li>Złożyć urządzenie tnące.</li>
<li>Umieścić rurki w sterylnej tacce przed urządzeniem tnącym, a następnie załadować rurki do urządzenia.</li>
<li>Przygotować probówkę stożkową 50 mL zawierającą 25 mL pożywki na wylocie urządzenia tnącego, aby zebrać odcięte moduły. 
Uwaga: Należy stosować pożywkę zawierającą FBS nawet w przypadku modułów składających się wyłącznie z kolagenu, ponieważ bez FBS w pożywce moduły nie oddzielają się od rurek. Jeśli moduły zawierają komórki, należy użyć pożywki wymaganej dla wbudowanych komórek. W przypadku braku wbudowanych komórek w modułach należy użyć pożywki dla komórek śródbłonka.</li>
<li>Ustawić urządzenie tnące tak, aby odcinało odcinki rurek o długości 2 mm, i przeciąć rurki.</li>
<li>Inkubować odcięte moduły w temperaturze 37°C przez 60 min w probówce stożkowej 50 mL.</li>
</ol>
6) Usuwanie modułów kolagenowych z rurki
<ol>
<li> Przez 10 s wytrząśnij na vortexerze probówkę stożkową 50 mL zawierającą moduły w probówce. 
	Uwaga: Należy zachować ostrożność podczas rozdzielania modułów o wysokiej gęstości komórek, aby uniknąć ich uszkodzenia. </li>
<li> Pozostaw moduły do czasu, aż opadną na dno probówki. Zajmuje to około 5 min.</li>
<li> Za pomocą szerokootworowej pipety serologicznej 10 mL przenieś osadzone moduły do probówki stożkowej 15 mL.</li>
<li> Powtórz kroki od 6.1 do 6.3 dwukrotnie.</li>
<li> Przejdź do kroku 7, aby pokryć moduły komórkami śródbłonka, lub przenieś moduły na płytkę, która nie była poddana obróbce do hodowli tkanek.</li>
</ol>
7) Pokrywanie modułów komórkami śródbłonka
<ol>
<li> Umieść moduły na dnie probówki stożkowej o pojemności 15 mL z 5 mL pożywki dla zatopionych komórek.</li>
<li> Usuń pożywkę z komórek śródbłonka i przemyj je 5 mL PBS.</li>
<li> Usuń PBS i dodaj 3 mL trypsyny-EDTA.</li>
<li> Inkubuj komórki w trypsynie-EDTA przez 5 min w temperaturze 37°C.</li>
<li> Resuspenduj komórki w 7 mL pożywki.</li>
<li> Policz komórki. Wymagane jest 5x106 komórek śródbłonka na 1 mL upakowanych modułów na dnie probówki stożkowej.</li>
<li> Odwiruj komórki przy 30 x g przez 5 min i resuspenduj w 5 mL pożywki dla komórek śródbłonka.</li>
<li> Dodaj 5 mL pożywki zawierającej komórki śródbłonka do modułów. 
Uwaga: Zapewnia to stosunek 50:50 dwóch rodzajów pożywek, co według naszych obserwacji sprzyja przeżywalności i funkcji obu typów komórek. Przed zastosowaniem pożywki do kokultury sformułowanej w celu zapewnienia właściwego utrzymania fenotypów obu typów komórek, należy przetestować jej działanie.</li>
<li> Inkubuj moduły z komórkami śródbłonka zarówno statycznie, jak i dynamicznie.</li>
<li> W przypadku inkubacji statycznej wymieszaj moduły z komórkami śródbłonka poprzez odwrócenie probówki, a następnie ustaw ją pionowo w temperaturze 37°C na 15 min. Powtórz tę czynność.</li>
<li> Przeprowadź dynamiczny zasiew komórek śródbłonka, delikatnie kołysząc probówką w temperaturze 37°C przez 60 min.</li>
<li> Powtórz inkubację statyczną dwukrotnie.</li>
<li> Umieść moduły na płytce nieprzetraktowanej do hodowli tkanek i inkubuj przez noc w temperaturze 37°C.</li>
<li> Następnego dnia przenieś moduły na nową płytkę nieprzetraktowaną do hodowli tkanek ze świeżą pożywką (mieszanka 50:50 w przypadku systemu kokultury), aby usunąć nieprzytwierdzone komórki śródbłonka.</li>
<li> Inkubuj moduły pokryte komórkami śródbłonka, aż pokryją one 100% powierzchni modułów. Zazwyczaj zajmuje to około 7 dni.</li>
</ol>
8) Reprezentatywne wyniki:
Po wyjęciu z probówki moduły będą miały kształt cylindryczny. Jeśli moduły zawierają zatopione komórki i/lub są pokryte komórkami śródbłonka, mogą skurczyć się o maksymalnie 50% objętości i przyjąć kształt owalny (Rysunek 1). W badaniu pod mikroskopem świetlnym moduły staną się również gęstsze i bardziej nieprzezroczyste (Rysunek 1). Ponadto, gdy komórki śródbłonka osiągną konfluencję na powierzchni modułów, powstają połączenia ścisłe, co można zaobserwować poprzez barwienie immunofluorescence VE-Cadherin (Rysunek 2). Analiza transportu masy wykazała, że moduły są w stanie utrzymać wysoką gęstość komórkową (8x107 komórek/cm3) bez tworzenia się rdzenia nekrotycznego wynikającego z niewystarczającego transportu tlenu, co często stanowi problem w większych tkankach (np. w modułach o dużej średnicy, D = 1,4mm) (Rysunek 3).
<img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig1.jpg" alt="Mikroskopia: porównanie wzrostu modułu biofilmu, dzień 0 vs dzień 3, wskaźniki wielkości, markery fluorescencyjne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Wytwarzanie i kurczenie się modułu. Kurczenie się modułu wystąpiło w ciągu trzech dni po wysianiu komórek HUVEC-C (linia komórek śródbłonka), co skutkowało istotnie mniejszą średnicą i długością modułu (p &lt; 0,01) (A). Osadzone komórki HepG2 były rozmieszczone równomiernie w obrębie modułów w momencie wytwarzania i zachowały wysoką żywotność (B). [Komórki żywe – zielone; komórki martwe – czerwone] [zaadaptowano z Corstorphine 2010]

<img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig2.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej; wizualizacja struktury komórkowej; znakowanie zielonym białkiem fluorescencyjnym." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Barwienie immunofluorescencyjne VE-kadheryny w szczelnych złączach komórkowych EC 10 dni po naniesieniu RAEC na powierzchnię modułu. Pasek skali = 50 μm.

<img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig3.jpg" alt="Porównanie wzrostu hodowli komórkowych, obrazy mikroskopowe przedstawiające małe i duże moduły w kolejnych dniach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Barwienie trichromem Massona typowych modułów (początkowa średnica 0,76 mm) oraz dużych modułów (początkowa średnica 1,4 mm) wykazuje wpływ ograniczeń dyfuzji tlenu. Siedem dni po wytworzeniu w rdzeniu dużych modułów powstała znaczna liczba martwych komórek (panel w prawym dolnym rogu), pozostawiając jedynie cienką obwódkę (~200μm grube) żywych komórek. Odwrotnie, małe moduły zachowały jednolity i wysoki rozkład żywych komórek. [Moduły z zatopionymi komórkami HepG2 i pokryte komórkami śródbłonkowymi.] [Pobrano z Corstorphine 2010]

<img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig4.jpg" alt="Obrazy mikroskopowe tkanki; A: fluorescencja, B: pole ciemne; analiza struktury komórkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: (A) Komórki HMEC-1 wysiane na modułach poloksamina-kolagen. Po pierwszym dniu wysiewu moduły poloksamina-kolagen zachowują swój cylindryczny kształt, a właściwości przylegania komórek są ograniczone w porównaniu z modułami składającymi się z samego kolagenu. Pasek skali = 200 μm(B) Obraz z mikroskopu świetlnego modułu kolagenowego zawierającego biodegradowalne mikrosfery na bazie PLGA. Pasek skali = 500 μm.

<img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig5.jpg" alt="Morfologia wzrostu mikroorganizmów i mikroskopia fluorescencyjna w analizie tworzenia biofilmu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5: Przykłady in vitro analizy. (A) Analiza angiogenezy: formacje przypominające kapilary na module zasianym komórkami śródbłonka mogą być łatwo wykryte i ilościowo określone po 5 dniach inkubacji z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej. (B) Obrazy z mikroskopii konfokalnej z analizy żywotności komórek (live/dead assay) na modułach, gdzie barwienie komórek żywych jest zielone, a martwych czerwone.

<img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig6.jpg" alt="Obraz mikroskopowy histologiczny; analiza próbki tkanki; badanie struktury komórkowej; badanie patomorfologiczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rycina 6: Moduły kolagenowe zawierające zatopione mezenchymalne komórki macierzyste oraz powierzchniową warstwę komórek śródbłonka. Moduły poddano naprężeniom ścinającym (~0,64 dyn/cm²).2) przez 7 dni w komorze mikrofluidycznej i zaczynają wykazywać fuzję w punktach styku. Komórki śródbłonka są barwione na vWF (brązowy), a jądra mezenchymalnych komórek macierzystych mają kolor niebieski (H&amp;E). Pasek skali = 100μm.

<img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig7.jpg" alt="Obraz mikroskopowy tkanki wykazujący nieprawidłowy wzrost wskazujący na potencjalny rak." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Setki modułów kolagenowych zawierających mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) i pokrytych ludzkimi mikrovascularnymi komórkami śródbłonka (HMEC) zostają zaimplantowane pod skórę myszy w celu zbadania interakcji między ASC a HMEC in vivo do zastosowań w regeneracji tkanki tłuszczowej.

<ol><li>Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+vessel+tissue+engineering+driven+by+endothelialized+modules%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules.</a> , (2010).</li>
<li>Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+factor+and+diffusion+limitations+in+collagen+gel+modules+containing+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2010).</li>
<li>Gupta, R., Van Rooijen, N., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+endothelialized+modular+constructs+implanted+in+an+omental+pouch+in+nude+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Fate of endothelialized modular constructs implanted in an omental pouch in nude rats.</a> Tissue Eng. Part A 15, 2875-2887 (2009).</li>
<li>Leung, B. M., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+tissue+engineering+construct+containing+smooth+muscle+cells+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">A modular tissue engineering construct containing smooth muscle cells and endothelial cells.</a> Ann Biomed Eng. 35, 2039-2049 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Leung, B., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+cell-containing+gel+modules+to+assemble+modular+tissue-engineered+constructs+%5Bcorrected%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fabrication of cell-containing gel modules to assemble modular tissue-engineered constructs [corrected].</a> Nat Protoc. 1, 2963-2969 (2006).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+organoid+engineered+by+modular+assembly+enables+blood+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vascularized organoid engineered by modular assembly enables blood perfusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11461-11466 (2006).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+tissue+engineering%3A+fabrication+of+a+gelatin-based+construct%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Modular tissue engineering: fabrication of a gelatin-based construct.</a> J Tissue Eng Regen Med. 1, 136-145 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+fabrication+of+sub-mm-sized+modules+containing+encapsulated+cells+for+modular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Design and fabrication of sub-mm-sized modules containing encapsulated cells for modular tissue engineering.</a> Tissue Eng. 13, 1069-1078 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+criteria+for+a+modular+tissue-engineered+construct%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Design criteria for a modular tissue-engineered construct.</a> Tissue Eng. 13, 1079-1089 (2007).</li>
<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thrombogenicity+of+human+umbilical+vein+endothelial+cell+seeded+collagen+modules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The thrombogenicity of human umbilical vein endothelial cell seeded collagen modules.</a> Biomaterials. 29, 2453-2463 (2008).</li>
<li>Sosnik, A., Leung, B., McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen%2Fpoloxamine+hydrogels%3A+cytocompatibility+of+embedded+HepG2+cells+and+surface-attached+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Collagen/poloxamine hydrogels: cytocompatibility of embedded HepG2 cells and surface-attached endothelial cells.</a> Tissue Eng. 11, 1807-1816 (2005).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Wyprodukowaliśmy kilka różnych mikro-tkanek, wykorzystując moduły z zatopionymi różnymi typami komórek1-11. Z sukcesem zatopiliśmy pierwotne kardiomiocyty, wysepki trzustkowe, komórki macierzyste tkanki tłuszczowej i mezenchymalne komórki macierzyste, a także kilka linii komórkowych, w tym HepG2, NIH 3T3 i komórki wątroby klonu 9. Powlekliśmy moduły kilkoma typami komórek śródbłonka, w tym szczurzymi komórkami śródbłonka aorty, ludzkimi komórkami śródbłonka żyły pępowinowej oraz ludzkimi komórkami śródbłonka m...

<table><tbody><tr><td>Przewody Intramedic PE60</td><td>BD Biosciences</td><td>427416</td><td>W celu zmiany średnicy modułów można zastosować przewody o innej średnicy</td></tr><tr><td>Fosforanowo-buforowana sól fizjologiczna (PBS)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Zakwaszony kolagen Purcol, 3 mg/mL</td><td>Cedarlane Labs</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Igła 20G</td><td>BD Biosciences</td><td>305175</td><td>Średnica igły powinna być zbliżona do średnicy przewodu</td></tr><tr><td>Strzykawka 3 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 15 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 50 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Samouszczelniające opakowania Convertors 7 1/2&amp;#8221; x 13&amp;#8221;</td><td>Cardinal Health</td><td>92713</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna z szerokim końcem 10 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>357504</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 10 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>357543</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie mikrotkanek z wykorzystaniem modułów żelu kolagenowego zawierającego komórki

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

Niniejszy protokół opisuje wytwarzanie rodzaju mikrotkanek nazywanych modułami. Podejście modułowe pozwala na uzyskanie jednorodnych, skalowalnych i unaczynionych tkanek. Moduły mogą być wykonane z kolagenu, jak również z innych materiałów żelujących lub sieciujących. Bezpośrednio po wytworzeniu mają one długość około 2 mm i średnicę 0,7 mm, jednak ich rozmiar zmniejsza się w przypadku obecności zatopionych komórek lub gdy moduły zostaną pokryte komórkami śródbłonka. Pojedyncze moduły są na tyle małe, że zatopione w nich komórki znajdują się w granicach limitu dyfuzji tlenu i innych składników odżywczych, natomiast moduły mogą być łączone w celu utworzenia większych, perfuzyjnych tkanek. Tkanki te mają konstrukcję modułową, ponieważ przed ich połączeniem w złożone struktury tkankowe w modułach można zatopić lub na ich powierzchni osadzić różne typy komórek. Proces tworzenia modułów składa się z trzech głównych etapów: (1) neutralizacji kolagenu i zatopienia w nim komórek, (2) żelowania kolagenu w probówce i wycięcia modułów oraz (3) pokrycia modułów komórkami śródbłonka.

Tworzenie mikrotkanek przy użyciu cylindrycznych żeli kolagenowych, nazywanych modułami, które zawierają zatopione komórki, a ich powierzchnia jest pokryta komórkami śródbłonka.

Wytwarzanie mikrotkanek z wykorzystaniem modułów żelu kolagenowego zawierającego komórki

Niniejszy protokół opisuje wytwarzanie rodzaju mikro-tkanek zwanych modułami. Podejście modułowe pozwala na generowanie jednolitych, skalowalnych i unaczynionych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie modułowych mikrotkanek, które mogą być wykorzystywane w eksperymentach z zakresu inżynierii tkankowej. Osiąga się to poprzez najpierw zaciągnięcie roztworu kolagenu do rurki polietylenowej za pomocą strzykawki, a następnie żelowanie kolagenu. Drugim krokiem jest pocięcie rurki polietylenowej na odcinki o długości dwóch milimetrów w celu utworzenia modułów mikrotkanek.Trzecim krokiem procedury jest oddzielenie modułów od cewek, a na koniec moduły są pokrywane komórkami śródbłonka. Ostatecznie otrzymane mikro tkanki mogą być wykorzystane w testach komórkowych in vitro do badania interakcji komórek za pomocą komory mikrofluidycznej. Ponadto mikro tkanki mogą zostać zaimplantowane w celu wytworzenia tkanek do badania interakcji i przebudowy mikro tkanek in vivo.Witam, nazywam się Brendan Long i reprezentuję laboratorium Sepan na Uniwersytecie w Toronto. Główną przeszkodą w tworzeniu dużych trójwymiarowych substytutów tkanek jest brak szybkiej waskularyzacji po implantacji. W tym filmie pokażemy Państwu, jak stworzyć modularną tkankę pokrytą komórkami endotelialnymi, aby pomóc pokonać to ograniczenie.Procedurę zademonstruje Chamberlain, stażysta po studiach z laboratorium Septin. Ilość kolagenu do neutralizacji będzie zależała od długości rurki polietylenowej. W tej demonstracji użyjemy dwumetrowej rurki polietylenowej o średnicy wewnętrznej 0,76 millimeter i średnicy zewnętrznej 1,22 millimeter.Aby przygotować rurkę, wprowadź igłę 20 G do jednego z jej końców, a następnie umieść rurkę w samouszczelniającej torebce do konwertera w celu sterylizacji gazowej. Ponieważ jeden mililitr kolagenu wypełnia około dwóch metrów rurki polietylenowej, zneutralizujemy jeden mililitr kolagenu. Umieść kolagen w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i przechowuj probówkę w lodzie.Do probówki dodać 128 µL 10 x alpha-MEM na każdy mililitr kolagenu i wymieszać poprzez wielokrotne pipetowanie roztworu. Należy uważać, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza; roztwór powinien zmienić kolor na żółty w miarę mieszania się alpha-MEM z zakwaszonym kolagenem. Następnie zneutralizować kolagen, dodając wodorowęglan sodu o stężeniu 0,8 M. Aby w przybliżeniu ocenić pH, dodawać wodorowęglan sodu do momentu, aż żółty roztwór kolagenu przybierze jasnoróżowy kolor.Zazwyczaj potrzeba od 30 do 60 µL na mililitr kolagenu, aby osiągnąć pH 7,4. Aby zapobiec żelowaniu zneutralizowanego kolagenu, należy przechowywać go w lodzie do momentu użycia. Aby rozpocząć procedurę żelowania kolagenu, należy przenieść worek zawierający wysterylizowane rurki polietylenowe do komory z laminarnym przepływem powietrza i odciąć zamknięty koniec worka, pozostawiając rurki wewnątrz.Za pomocą wysterylizowanej pęsety przymocuj strzykawkę o pojemności 3 ml do igły 20 G, która została wcześniej wsunięta w jeden koniec rurki. Wprowadź drugi koniec rurki do zneutralizowanego kolagenu, aż jej końcówka dotknie dna probówki stożkowej, która powinna znajdować się w lodzie. Następny krok należy wykonać powoli, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza do kolagenu.Powoli wciągnij tłok strzykawki, aby pobrać kolagen do rurki polietylenowej. Po przetłoczeniu kolagenu przez rurkę wyjmij igłę o rozmiarze 20 G i włóż oba końce rurki z powrotem do worka. Po zaklejeniu worka taśmą inkubuj go w temperaturze 37 °C przez 60 minut.Do przecięcia rurki zostanie użyte wcześniej zmontowane urządzenie tnące. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść rurkę w sterylnej kuwecie przed urządzeniem tnącym, a następnie wprowadź rurkę do wylotu urządzenia; przygotuj probówkę stożkową o pojemności 50 ml zawierającą 25 ml pożywki dla komórek śródbłonka. Aby zebrać wycięte moduły, ustaw urządzenie na cięcie odcinków rurki o długości 2 mm, a następnie przetnij rurkę.Inkubować wycięte moduły w 50 ml probówce stożkowej w temperaturze 37°C przez 60 minut. Aby usunąć moduły kolagenowe z probówki, wymieszać zawartość 50 ml probówki stożkowej z modułami na wirówce typu vortex z średnią prędkością przez 10 sekund. Pozostawić moduły do osadzenia się na dnie probówki, co zajmuje około pięciu minut.Na dnie probówki utworzy się luźny osad modułów, natomiast rurki utworzą warstwę na powierzchni medium. Po osadzeniu się modułów, za pomocą szerokootworowej pipety serologicznej o pojemności 10 mililitrów, przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Wymieszaj zawiesinę w probówce stożkowej 15 mililitrów za pomocą wortexa, a następnie pozwól modułom osadzić się jeszcze dwukrotnie.Osiadłe moduły z drugiego i trzeciego wiru są również przenoszone do probówki o pojemności 15 mililitrów. Po usunięciu wszystkich modułów z rurek i ich połączeniu, należy uzupełnić objętość medium w probówce do pięciu mililitrów. Moduły są teraz gotowe do pokrycia komórkami śródbłonka; w kolejnym kroku zostanie przedstawione przygotowanie komórek śródbłonka do pokrycia modułów.Najpierw należy usunąć pożywkę z komórek i przemyć je PBS. Po usunięciu PBS dodać 3 ml trypsyny EDTA i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Następnie zawiesić komórki w 7 ml pożywki i przenieść do probówki o pojemności 15 ml.Policz komórki za pomocą cytometru hematologicznego; będziesz potrzebować 5×10⁶ komórek śródbłonka na mililitr upakowanych modułów na dnie probówki stożkowej. Odwirowaj komórki przy 300 G przez pięć minut. Resuspenduj osad komórkowy w pięciu mililitrach pożywki dla komórek śródbłonka.Następnie do modułów dodaje się 5 mL pożywki zawierającej komórki śródbłonka. Moduły inkubuje się z komórkami śródbłonka zarówno statycznie, jak i dynamicznie; w przypadku inkubacji statycznej mieszano moduły z komórkami śródbłonka poprzez odwracanie, a następnie ustawiono probówkę pionowo w temperaturze 37 °C na 15 minut. Po 15 minutach probówkę ponownie odwrócono i inkubowano w temperaturze 37 °C przez kolejne 15 minut.Aby przeprowadzić dynamiczną inkubację modułów z komórkami śródbłonka, należy delikatnie kołysać probówką o pojemności 15 ml w temperaturze 37°C przez 60 minut. Po zakończeniu inkubacji z komórkami śródbłonka przenieść moduły na płytkę nieprzystosowaną do hodowli tkanek i inkubować przez noc w temperaturze 37°C. Następnego dnia umieścić moduły na nowej płytce nieprzystosowanej do hodowli tkanek ze świeżą pożywką, aby usunąć nieprzylegające komórki śródbłonka. Inkubować moduły pokryte komórkami śródbłonka w temperaturze 37°C do momentu, aż komórki pokryją 100% powierzchni modułów.Zazwyczaj trwa to około siedmiu dni. Po wyjęciu z probówki moduły mają kształt cylindryczny. Jeśli są pokryte komórkami śródbłonka, ich objętość może zmniejszyć się o nawet 50%, a ich kształt może stać się owalny; dodatkowo, w badaniu pod mikroskopem świetlnym, mogą stać się gęstsze i bardziej nieprzezroczyste.Na tych obrazach średnica i długość modułów są oznaczone odpowiednio jako d i l. Kolejny obraz przedstawia komórki Hep G two zatopione i równomiernie rozmieszczone w modułach w momencie ich wytwarzania. Komórki zachowały wysoką żywotność, na co wskazuje zielony kolor żywych komórek.Martwe komórki będą miały czerwony kolor, gdy komórki śródbłonka osiągną konfluencję. Na powierzchni modułów tworzą się połączenia ścisłe, co można zaobserwować za pomocą immunofluorescencji. Analiza transferu masy z barwieniem na VE-kadherynę wykazała, że moduły są w stanie utrzymać wysoką gęstość komórek bez tworzenia się rdzenia nekrotycznego wynikającego z niewystarczającego transportu tlenu, co często stanowi problem w przypadku większych tkanek.W niniejszym przykładzie barwienie trichromowe typowych małych modułów pokazuje, że moduły zachowały jednorodny i wysoki rozkład żywych komórek siedem dni po wytworzeniu. W przeciwieństwie do nich, w rdzeniu dużych modułów utworzyła się znaczna liczba martwych komórek, pozostawiając jedynie cienki pierścień żywotnych komórek. Wytworzono również moduły z mieszaniny kolagenu i polimeru syntetycznego oraz moduły zawierające mikrosfery uwalniające lek.W tym przypadku, gdy komórki h hm EC osadzono na modułach z kolagenu i palin, moduły zachowują swój cylindryczny kształt, a właściwości przylegania komórek są ograniczone w porównaniu z modułami składającymi się wyłącznie z kolagenu. Przedstawiono tutaj obraz z mikroskopu świetlnego modułu kolagenowego zawierającego biodegradowalne mikrosfery na bazie PLGA. Wykazano, że kilka testów in vitro jest kompatybilnych z tymi modułami.Na przykład w teście angiogenezy formacje przypominające kapilary na module zasiedlonym komórkami śródbłonka można łatwo wykryć i określić ilościowo po pięciu dniach inkubacji z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej. W innym przykładzie obrazy z mikroskopii konfokalnej z testu żywotności komórek na modułach pokazują komórki żywe zabarwione na zielono i komórki martwe zabarwione na czerwono. Wreszcie moduły były wykorzystywane w komorach mikroprzepływowych oraz implantowane u myszy i szczurów w celu zbadania interakcji między różnymi typami komórek oraz sposobu, w jaki mikrotkanki są przebudowywane w wyniku reakcji organizmu gospodarza.Po przeprowadzeniu procedury moduły można hodować w szalce Petriego lub w innych naczyniach, takich jak bioreaktor lub urządzenie mikroprzepływowe. Metodę tę można również dostosować w celu stworzenia różnych tkanek, stosując różnorodne kombinacje typów komórek lub rurki o różnych średnicach. Dziękujemy za oglądanie.

fabrication-micro-tissues-using-modules-collagen-gel-containing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Produkcja mikro-tkanek z wykorzystaniem modułów żelu kolagenowego zawierającego komórki

W niniejszej pracy przedstawiamy sposób wytwarzania konstruktów tkankowych na bazie kolagenu zawierających mioblasty szkieletowe. Te trójwymiarowe konstrukty inżynieryjne mogą być wykorzystywane do zastępowania lub naprawy tkanek in vivo. Na potrzeby naszych badań zaprojektowaliśmy je jako przekaźnik elektryczny przedsionkowo-komorowy do leczenia całkowitego bloku serca[1].

Wytwarzanie inżynieryjnych konstruktów tkanki mięśniowej

Opisano metodę przygotowania trójwymiarowej macierzy składającej się z kolagenu typu I oraz pierwotnych ludzkich fibroblastów. Ten żel organotypowy służy jako przydatny substrat do oceny inwazyjnej migracji komórek, ponieważ naśladuje podstawowe cechy stromy tkanki i nadaje się do wielu form mikroskopii.

Organotypowy test z kolagenem typu I: elastyczna platforma do oceny zachowania komórek w kontekście trójwymiarowym

Ten system modelowy zaczyna się od wypełnionego miofibroblastami żelu fibrynowego, który może być używany do badania endogennej kolagenu (re)organizacji w czasie rzeczywistym w sposób nieniszczący. System modelowy jest bardzo przestrajalny, ponieważ może być używany z różnymi źródłami komórek, dodatkami do pożywek i może być łatwo dostosowany do konkretnych potrzeb.

Inżynieria konstruktów tkankowych na bazie fibryny z miofibroblastów oraz zastosowanie ograniczeń i szczepów do indukowania reorganizacji komórek i kolagenu

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Inżynieria tkankowa często obejmuje ekspansję in vitro w celu stworzenia autoprzeszczepów do regeneracji tkanek. W tym badaniu opracowano metodę rozbudowy, regeneracji i rekonstrukcji tkanek in vivo w celu zminimalizowania przetwarzania komórek i materiałów biologicznych poza organizmem.

Tkanka mielona w skompresowanym kolagenie: bioprzeszczep zawierający komórki do jednoetapowej naprawy rekonstrukcyjnej

Tworzenie funkcjonalnych mikrotkanek w urządzeniach mikroprzepływowych wymaga stabilizacji fenotypów komórek poprzez dostosowanie tradycyjnych technik hodowli komórkowych do ograniczonych wymiarów przestrzennych w mikrourządzeniach. Modyfikacja kolagenu umożliwia osadzanie się warstwa po warstwie ultracienkich zespołów kolagenowych, które mogą stabilizować komórki pierwotne, takie jak hepatocyty, jako mikroprzepływowe modele tkankowe.

Osadzanie kolagenu warstwa po warstwie w urządzeniach mikroprzepływowych do stabilizacji mikrotkanek

Kolagen jest kluczowym składnikiem ECM i dostarcza niezbędnych wskazówek dla kilku procesów komórkowych, począwszy od migracji, a skończywszy na różnicowaniu i proliferacji. Poniżej przedstawiono protokół osadzania komórek w hydrożelach kolagenowych 3D oraz bardziej zaawansowaną technikę generowania losowych lub wyrównanych matryc kolagenowych przy użyciu mikrokanałów PDMS.

Przygotowanie żeli kolagenowych 3D i mikrokanalików do badania oddziaływań 3D in vivo

Ten manuskrypt opisuje technikę opartą na miękkiej litografii, polegającą na inżynierii jednolitych układów trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonej geometrii otoczonych macierzą zewnątrzkomórkową. Metoda ta jest dostosowana do szerokiej gamy typów komórek i kontekstów eksperymentalnych oraz pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe identycznych kontrprób.

Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

Ten protokół opisuje wytwarzanie elastycznych makroporowatych mikrokriożeli 3D poprzez integrację mikrofabrykacji z technologią kriożelacji. Po załadowaniu komórkami generowane są mikrotkanki 3D, które można łatwo wstrzyknąć in vivo w celu ułatwienia terapii regeneracyjnej lub złożyć w matryce do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków in vitro.

Mikrotkanki 3D do iniekcyjnej terapii regeneracyjnej i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków

Ten protokół demonstruje użycie kanału mikroprzepływowego o zmieniającej się geometrii wzdłuż kierunku przepływu płynu do generowania naprężeń rozciągających (rozciągających) w celu wyrównania włókien w hydrożelu kolagenowym 3D (&lt;250 μm grubości). Wynikowe wyrównanie rozciąga się na kilka milimetrów i ma na nie wpływ szybkość odkształcania rozciągającego.

Mikroinżynieryjne hydrożele kolagenowe 3D z wyrównaniem włókien dalekiego zasięgu

Poniższy protokół przedstawia metodę wytłaczania opartą na ścinaniu do produkcji hydrożeli kolagenowych z nanoskalowymi wzorzystymi włókienkami, które mogą być stosowane w szerokim zakresie zastosowań inżynierii tkankowej.

Produkcja kolagenu o wzorzystym kształcie nanofibrylarnym dla inżynierii tkankowej

Naucz się wytwarzać modułowe mikrotkanki z żelu kolagenowego do badań inżynierii tkankowej. Ta metoda umożliwia pokrycie komórkami śródbłonka i zastosowanie w badaniach in vitro oraz in vivo.

Wytwarzanie mikrotkanek z wykorzystaniem modułów żelu kolagenowego zawierającego komórki

Przeglądaj więcej filmów