Wytwarzanie mikrotkanek przy użyciu modułów komórek zawierających żel kolagenowy

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie modułowych mikrotkanek, które można wykorzystać do eksperymentów inżynierii tkankowej. Osiąga się to poprzez najpierw wciągnięcie roztworu kolagenu do rurki polietylenowej za pomocą strzykawki, a następnie żelowanie kolagenu. Drugim krokiem jest przecięcie rurki polietylenowej na dwa milimetry długości, aby utworzyć moduły mikrotkankowe.

Trzecim krokiem procedury jest oddzielenie modułów od rurek, a na koniec moduły są pokryte komórkami śródbłonka. Ostatecznie uzyskane mikrotkanki można wykorzystać do testów komórkowych in vitro w celu zbadania interakcji komórek za pośrednictwem komory mikroprzepływowej. Ponadto mikrotkanki mogą być wszczepiane w celu wytworzenia tkanek do badania interakcji i przebudowy mikrotkanek in vivo.

Cześć, nazywam się Brendan Long i pracuję w Sepan Lab na Uniwersytecie w Toronto. Główną przeszkodą w tworzeniu dużych substytutów tkanek 3D jest brak szybkiego unaczynienia po implantacji. W tym filmie pokażemy, jak stworzyć modułową tkankę pokrytą komórkami śródbłonka, aby pomóc przezwyciężyć to ograniczenie.

Za demonstrację procedury zostanie uznany Chamberlain, pracownik naukowy z laboratorium Septin. Ilość kolagenu do zneutralizowania będzie zależeć od długości rurki polietylenowej. W tej demonstracji użyjemy dwumetrowej rurki polietylenowej o średnicy wewnętrznej 0,76 milimetra i średnicy zewnętrznej 1,22 milimetra.

Aby przygotować rurkę, wkręć jedną igłę o wadze 20 G w jeden koniec rurki, a następnie umieść rurkę w woreczku samoregenerującym konwertera w celu sterylizacji gazowej. Ponieważ jeden mililitr kolagenu wypełnia około dwóch metrów rurki polietylenowej, zneutralizujemy jeden mililitr kolagenu. Umieść kolagen w stożkowej tubie o pojemności 15 mililitrów i trzymaj probówkę na lodzie.

Dodać 128 mikrolitrów 10 x alfa, MEM na mililitr kolagenu do probówki i wymieszać, wielokrotnie pipetując roztwór. Dbając o zminimalizowanie powstawania pęcherzyków, roztwór powinien zmienić kolor na żółty, gdy alfa MEM zostanie zmieszany z zakwaszonym kolagenem. Następnie zneutralizuj kolagen, dodając 0,8 molowego wodorowęglanu sodu Aby ogólnie oszacować pH, dodawaj wodorowęglan sodu, aż żółty roztwór kolagenu zmieni kolor na jasnoróżowy.

Zwykle potrzeba od 30 do 60 mikrolitrów na mililitr kolagenu, aby osiągnąć pH 7,4. Aby zapobiec żelowaniu zneutralizowanego kolagenu, trzymaj go na lodzie, aż będzie gotowy do użycia. Aby rozpocząć procedurę galaretki kolagenowej, zanieś worek zawierający wysterylizowaną rurkę polietylenową do szafki bezpieczeństwa biologicznego i odetnij szczelny koniec worka, trzymając rurkę w torbie.

Użyj wysterylizowanej pęsety, aby przymocować trzymililitrową strzykawkę do igły o rozmiarze 20, która została wcześniej włożona do jednego końca rurki. Włóż drugi koniec rurki do zneutralizowanego kolagenu, aż końcówka znajdzie się na dnie stożkowej rurki, która jest utrzymywana na lodzie. Ten kolejny krok musisz wykonać powoli, w przeciwnym razie wprowadzisz pęcherzyki powietrza do kolagenu.

Powoli cofnąć tłok strzykawki, aby wciągnąć kolagen do rurki polietylenowej. Gdy kolagen zostanie przeciągnięty przez rurkę, wyciągnij igłę o rozmiarze 20 i włóż oba końce rurki z powrotem do torby. Po zaklejeniu worka taśmą inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut.

Do przecięcia rurki zostanie użyte wstępnie zmontowane urządzenie tnące. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść rurkę w sterylnej tacy przed urządzeniem tnącym i załaduj rurkę do urządzenia tnącego na wylocie urządzenia tnącego, ustaw 50-mililitrową stożkową rurkę zawierającą 25 mililitrów pożywki z komórek śródbłonka. Aby zebrać pocięte moduły, ustaw urządzenie tnące tak, aby przecięło rurkę o długości dwóch milimetrów, a następnie przeciąć rurkę.

Inkubować pocięte moduły w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut. Aby usunąć moduły kolagenu z rurki, wywiruj, 50-litrową stożkową rurkę zawierającą moduły ze średnią prędkością. Przez 10 sekund pozwól modułowi osiąść na dnie rurki, co zajmuje około pięciu minut.

Na dnie rurki utworzy się luźna osada modułów, podczas gdy rurka utworzy warstwę na wierzchu mediów. Po ustabilizowaniu się modułów użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej o szerokich otworach, aby przenieść je do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Wiruj, 15-mililitrową stożkową rurkę, a następnie pozwól modułom osiąść jeszcze dwa razy.

Osadzone moduły z drugiego i trzeciego wiru są również przenoszone do rurki o pojemności 15 mililitrów. Po wyjęciu wszystkich modułów z rurki i zebraniu ich w pulę, doprowadź objętość mediów w rurce do pięciu mililitrów. Moduły są teraz gotowe do pokrycia komórkami śródbłonka, które zostaną pokazane w następnej kolejności, aby przygotować komórki śródbłonka do powlekania modułów.

Najpierw usuń pożywkę z komórek i umyj PBS. Po usunięciu PBS dodaj trzy mililitry trypsyny EDTA i inkubuj przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie resus, zawieś komórki w siedmiu mililitrach pożywki i przenieś do 15-mililitrowej probówki.

Policz komórki za pomocą hemocytometru, będziesz potrzebować pięć razy 10 do szóstych komórek śródbłonka na mililitr upakowanych modułów na dnie stożkowej rurki. Osadzać komórki w masie 300 G przez pięć minut. Ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach pożywki z komórek śródbłonka.

Teraz dodaj do modułów pięć mililitrów pożywki zawierającej komórki śródbłonka. Moduły są inkubowane z komórkami śródbłonka, zarówno statycznie, jak i dynamicznie do inkubacji statycznej, miesza moduły z komórkami śródbłonka przez inwersję, a następnie ustawia rurkę pionowo w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 minut. Po 15 minutach ponownie odwróć probówkę i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kolejne 15 minut.

Aby dynamicznie inkubować moduły z komórkami śródbłonka, delikatnie kołysz 15-mililitrową rurkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut. Po zakończeniu inkubacji z komórkami śródbłonka przenieś moduły na płytkę niepoddaną hodowli tkankowej i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza następnego dnia, umieść moduły na nowej płytce poddanej działaniu kultury nietkankowej ze świeżą pożywką w celu usunięcia nieprzyłączonych komórek śródbłonka. Moduły pokryte komórkami śródbłonka należy inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż komórki pokryją 100% powierzchni modułów.

Zwykle trwa to około siedmiu dni. Moduły będą wyglądały na cylindryczne, gdy zostaną po raz pierwszy wyjęte z tuby. Jeśli są pokryte komórkami śródbłonka, mogą skurczyć się do 50% objętości i rozwinąć owalny kształt, a także stać się gęstsze i bardziej nieprzezroczyste, gdy są oglądane pod mikroskopem świetlnym.

Na tych obrazach średnica i długość modułów są oznaczone odpowiednio przez d i l. Następny obraz pokazuje osadzone komórki Hep G dwie równomiernie rozmieszczone w modułach w momencie produkcji. Komórki zachowały wysoką żywotność, na co wskazuje zielony kolor żywych komórek.

Martwe komórki miałyby czerwony kolor, gdy komórki śródbłonka zlewają się. Na powierzchni modułów tworzą się ścisłe połączenia, które można zobaczyć za pomocą immunofluorescencji. Barwienie kadheryny w analizie transferu masy kadheryny wykazało, że moduły są w stanie utrzymać wysoką gęstość komórek bez tworzenia martwiczego rdzenia z powodu niewystarczającego transportu tlenu, co jest często problematyczne w większych tkankach.

W tym przykładzie masowe barwienie Tri chro typowych małych modułów pokazuje, że moduły zachowały równomierny i wysoki rozkład żywych komórek siedem dni po wyprodukowaniu. W przeciwieństwie do tego, duża liczba martwych komórek utworzyła się w rdzeniu dużych modułów, pozostawiając tylko cienką obwódkę żywotnych komórek. Wyprodukowano również moduły z mieszaniną kolagenu i polimeru ine lub zawierające mikrosfery uwalniające leki.

Tutaj, gdy komórki h hm EC one są osadzone na modułach kolagenu palinowego, moduły zachowują swój cylindryczny kształt i mają ograniczone właściwości przylegania komórek w porównaniu z modułami zawierającymi tylko kolagen. Pokazano tutaj obraz z mikroskopu świetlnego modułu kolagenowego zawierającego biodegradowalne mikrosfery na bazie PLGA. Wykazano, że kilka testów in vitro jest kompatybilnych z modułami.

Na przykład w teście angiogenezy formacje przypominające naczynia włosowate na module osadzonym z komórkami śródbłonka można łatwo wykryć i określić ilościowo po pięciu dniach inkubacji z komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej. W innym przykładzie, obrazy z mikroskopii konfokalnej żywego martwego testu na modułach pokazują żywe komórki zabarwione na zielono i martwe komórki zabarwione na czerwono. Moduły wykorzystano również w komorach mikroprzepływowych i wszczepiono myszom i szczurom w celu zbadania interakcji między różnymi typami komórek oraz sposobu przebudowy mikrotkanek przez odpowiedź gospodarza.

Zgodnie z procedurą, moduły mogą być hodowane na szalce Petriego lub w innych naczyniach, takich jak bioreaktor lub urządzenie mikroprzepływowe. Metodę tę można również dostosować do tworzenia różnych tkanek przy użyciu różnych kombinacji typów komórek lub przy użyciu rurek o różnej średnicy. Dzięki za oglądanie.