Name: Amplifikacja i ilościowe oznaczanie RNA HIV-1 u osób zakażonych wirusem HIV z wiremią poniżej granicy wykrywalności za pomocą standardowych testów klinicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: Poznaj metodę amplifikacji i ilościowego oznaczania RNA HIV-1 u pacjentów z niską wiremią. Technika umożliwia wykrycie poziomu wirusa już od 0,3 kopii/ml, co wspiera badania nad dynamiką wirusa i odpowiedzią na leczenie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować pacjentom, którzy wzięli udział w licznych badaniach nad HIV-1.
J.M.C. był profesorem badawczym American Cancer Society przy wsparciu F.M. Kirby Foundation.

<ol><li>Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., O'Neil, S. P., Staprans, S. I., Montefiori, D. C., Xu, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+a+mucosal+challenge+and+prevention+of+AIDS+by+a+multiprotein+DNA%2FMVA+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine.</a> Vaccine. 20, 1949-1955 (2002).</li>
<li>Dinoso, J., Kim, S., Blankson, J., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Dynamics+of+Elite+Suppressors+in+HIV-1+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Conference+on+Retroviruses+and+Opportunistic+Infections%22%5BJournal%5D)">Viral Dynamics of Elite Suppressors in HIV-1 Infection.</a> Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. , (2008).</li>
<li>Dinoso, J. B., Kim, S. Y., Wiegand, A. M., Palmer, S. E., Gange, S. J., Cranmer, L., O'Shea, A., Callender, M., Spivak, A., Brennan, T., Kearney, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+intensification+does+not+reduce+residual+HIV-1+viremia+in+patients+on+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Treatment intensification does not reduce residual HIV-1 viremia in patients on highly active antiretroviral therapy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9403-9408 (2009).</li>
<li>Doria-Rose, N. A., Klein, R. M., Manion, M. M., O'Dell, S., Phogat, A., Chakrabarti, B., Hallahan, C. W., Migueles, S. A., Wrammert, J., Ahmed, R., Nason, M., Wyatt, R. T., Mascola, J. R., Connors, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+and+phenotype+of+human+immunodeficiency+virus+envelope-specific+B+cells+from+patients+with+broadly+cross-neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Frequency and phenotype of human immunodeficiency virus envelope-specific B cells from patients with broadly cross-neutralizing antibodies.</a> J. Virol. 83, 188-199 (2009).</li>
<li>Dornadula, G., Zhang, H., Uitert, B. V. an, Stern, J., Livornese, L., Ingerman, M. J., Witek, J., Kedanis, R. J., Natkin, J., DeSimone, J., Pomerantz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+HIV-1+RNA+in+blood+plasma+of+patients+taking+suppressive+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Residual HIV-1 RNA in blood plasma of patients taking suppressive highly active antiretroviral therapy.</a> JAMA. 282, 1627-1632 (1999).</li>
<li>Gandhi, R. T., Zheng, L., Bosch, R. J., Chan, E. S., Margolis, D. M., Read, S., Kallungal, B., Palmer, S., Medvik, K., Lederman, M. M., Alatrakchi, N., Jacobson, J. M., Wiegand, A., Kearney, M., Coffin, J. M., Mellors, J. W., Eron, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+raltegravir+intensification+on+low-level+residual+viremia+in+HIV-infected+patients+on+antiretroviral+therapy%3A+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+medicine%22%5BJournal%5D)">The effect of raltegravir intensification on low-level residual viremia in HIV-infected patients on antiretroviral therapy: a randomized controlled trial.</a> PLoS medicine. 7, (2010).</li>
<li>Gay, C., Dibben, O., Anderson, J. A., Stacey, A., Mayo, A. J., Norris, P. J., Kuruc, J. D., Salazar-Gonzalez, J. F., Li, H., Keele, B. F., Hicks, C., Margolis, D., Ferrari, G., Haynes, B., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+detection+of+acute+HIV+infection%3A+timing+of+transmission%2C+inflammation+and+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional detection of acute HIV infection: timing of transmission, inflammation and antiretroviral therapy.</a> PLoS One. 6, 19617-19617 (2011).</li>
<li>Hatano, H., Delwart, E. L., Norris, P. J., Lee, T. H., Dunn-Williams, J., Hunt, P. W., Hoh, R., Stramer, S. L., Linnen, J. M., McCune, J. M., Martin, J. N., Busch, M. P., Deeks, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+persistent+low-level+viremia+in+individuals+who+control+human+immunodeficiency+virus+in+the+absence+of+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Evidence for persistent low-level viremia in individuals who control human immunodeficiency virus in the absence of antiretroviral therapy.</a> J. Virol. 83, 329-335 (2009).</li>
<li>Havlir, D. V., Bassett, R., Levitan, D., Gilbert, P., Tebas, P., Collier, A. C., Hirsch, M. S., Ignacio, C., Condra, J., Gunthard, H. F., Richman, D. D., Wong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+predictive+value+of+intermittent+viremia+with+combination+hiv+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Prevalence and predictive value of intermittent viremia with combination hiv therapy.</a> JAMA. 286, 171-179 (2001).</li>
<li>Jordan, M. R., Kearney, M., Palmer, S., Shao, W., Maldarelli, F., Coakley, E. P., Chappey, C., Wanke, C., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+standard+PCR%2Fcloning+to+single+genome+sequencing+for+analysis+of+HIV-1+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of standard PCR/cloning to single genome sequencing for analysis of HIV-1 populations.</a> J Virol Methods. 168, 114-120 (2010).</li>
<li>Kaufmann, D. E., Kavanagh, D. G., Pereyra, F., Zaunders, J. J., Mackey, E. W., Miura, T., Palmer, S., Brockman, M., Rathod, A., Piechocka-Trocha, A., Baker, B., Zhu, B., Gall, S. L. e, Waring, M. T., Ahern, R., Moss, K., Kelleher, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+CTLA-4+by+HIV-specific+CD4%2B+T+cells+correlates+with+disease+progression+and+defines+a+reversible+immune+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Upregulation of CTLA-4 by HIV-specific CD4+ T cells correlates with disease progression and defines a reversible immune dysfunction.</a> Nat Immunol. 8, 1246-1254 (2007).</li>
<li>Kearney, M., Maldarelli, F., Shao, W., Margolick, J. B., Daar, E. S., Mellors, J. W., Rao, V., Coffin, J. M., Palmer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Population+Genetics+and+Adaptation+in+Newly+Infected+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Population Genetics and Adaptation in Newly Infected Individuals.</a> J. Virol. 83, 2715-2727 (2008).</li>
<li>Kearney, M., Palmer, S., Maldarelli, F., Shao, W., Polis, M. A., Mican, J., Rock-Kress, D., Margolick, J. B., Coffin, J. M., Mellors, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+polymorphism+at+drug+resistance+sites+in+HIV-1+protease+and+reverse+transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Frequent polymorphism at drug resistance sites in HIV-1 protease and reverse transcriptase.</a> AIDS. 22, 497-501 (2008).</li>
<li>Kearney, M., Spindler, J., Shao, W., Maldarelli, F., Palmer, S., Hu, S. L., Lifson, J. D., Kewal Ramani, V. N., Mellors, J. W., Coffin, J. M., Ambrose, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+of+simian+immunodeficiency+virus+encoding+HIV-1+reverse+transcriptase+persists+in+macaques+despite+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity of simian immunodeficiency virus encoding HIV-1 reverse transcriptase persists in macaques despite antiretroviral therapy.</a> Journal of Virology. 85, 1067-1076 (2011).</li>
<li>Keele, B. F., Giorgi, E. E., Salazar-Gonzalez, J. F., Decker, J. M., Pham, K. T., Salazar, M. G., Sun, C., Grayson, T., Wang, S., Li, H., Wei, X., Jiang, C., Kirchherr, J. L., Gao, F., Anderson, J. A., Ping, L. H., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+transmitted+and+early+founder+virus+envelopes+in+primary+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 105-7552 (2008).</li>
<li>Liu, S. L., Rodrigo, A. G., Shankarappa, R. G., Learn, H., Hsu, L., Davidov, O., Zhao, L. P., Mullins, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+quasispecies+and+resampling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HIV quasispecies and resampling.</a> Science. 273, 415-416 (1996).</li>
<li>Mahalanabis, M., Jayaraman, P., Miura, T., Pereyra, F., Chester, E. M., Richardson, B., Walker, B., Haigwood, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+viral+escape+and+selection+by+autologous+neutralizing+antibodies+in+drug-naive+human+immunodeficiency+virus+controllers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Continuous viral escape and selection by autologous neutralizing antibodies in drug-naive human immunodeficiency virus controllers.</a> J. Virol. 83, 662-672 (2009).</li>
<li>Migueles, S. A., Connors, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+CD4%28%2B%29+and+CD8%28%2B%29+T+Cells+in+Controlling+HIV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Infect.+Dis.+Rep%22%5BJournal%5D)">The Role of CD4(+) and CD8(+) T Cells in Controlling HIV Infection.</a> Curr. Infect. Dis. Rep. 4, 461-467 (2002).</li>
<li>Palmer, S., Kearney, M., Maldarelli, F., Halvas, E. K., Bixby, C. J., Bazmi, H., Rock, D., Falloon, J., Davey, R. T., Dewar, R. L., Metcalf, J. A., Hammer, S., Mellors, J. W., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple%2C+linked+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+mutations+in+treatment-experienced+patients+are+missed+by+standard+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 406-413 (2005).</li>
<li>Palmer, S., Wiegand, A. P., Maldarelli, F., Bazmi, H., Mican, J. M., Polis, M., Dewar, R. L., Planta, A., Liu, S., Metcalf, J. A., Mellors, J. W., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+real-time+reverse+transcriptase-initiated+PCR+assay+with+single-copy+sensitivity+for+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNA+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 4531-4536 (2003).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Osoby zakażone HIV-1 przyjmujące złożoną terapię antyretrowirusową (cART) lub naturalnie kontrolujące infekcję wykazują bardzo niską wiremię, zazwyczaj około 1 kopii na ml osocza4, 11, 12, 17, 18. Wiremia u pacjentów z naturalną kontrolą często fluktuuje wokół indywidualnego punktu nastawczego1, 2, 17. Czułość opisanych tutaj testów jest w dużym stopniu zależna od objętości użytego osocza. Zazwyczaj pracujemy z 7 ml osocza, jednak w zależności od rzeczywistej wiremii w osoczu, pozytywne wyniki można...

<table><tbody><tr><td>Losowe heksamery (500 µg/ml)</td><td>Promega Corp.</td><td>C118A</td><td></td></tr><tr><td>bufor TaqMan A</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304441</td><td></td></tr><tr><td>RNAsin (40 U/μl)</td><td>Promega Corp.</td><td>N211B</td><td></td></tr><tr><td>enzym RT (200 J/µl) </td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>600107-51</td><td></td></tr><tr><td>polimeraza DNA Amplitaq Gold</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311814</td><td>opakowanie 6 sztuk</td></tr><tr><td>bufor PCR Amplitaq 10X Gold PCR buffer II</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311814</td><td>dołączony do enzymu</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu 25 mM</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311814</td><td>zawiera enzym</td></tr><tr><td>bufor Tris-HCl 1 M, pH 8,0, 5 mM</td><td>Invitrogen</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>enzym odwrotna transkryptaza Superscript III, 200 U/ul </td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>bufor 10X Superscript III</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>dołączony do enzymu</td></tr><tr><td>DTT 100 mM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>dołączony do enzymu</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Platinum Taq High Fidelity 5 U/ul</td><td>Invitrogen</td><td>11304-102</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do PCR o wysokiej wierności 10X</td><td>Invitrogen</td><td>11304-102</td><td>dołączony do enzymu</td></tr><tr><td>Proteinaza K 20 mg/ml</td><td>Ambion</td><td>2546</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór tiocyjanianu guanidynium 6M</td><td>Fluka</td><td>50983</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen 20 mg/ml</td><td>Grupa Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19516</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E702-3</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy molekularnej </td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>dNTP (po 25 mmol każdego) </td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe Easy Seal (16x73 mm)</td><td>Seaton Scientific</td><td>6041</td><td></td></tr><tr><td>Korony z białego Delrinu </td><td>Seaton Scientific</td><td>4020</td><td>Nakrętki do probówek Easy Seal</td></tr><tr><td>Statyw na probówki Optiseal Bell-Top, 8,9 ml</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>361642</td><td></td></tr><tr><td>Klucz imbusowy &amp;frac12; otwarcie nacięcia</td><td>Seaton Scientific</td><td>4013</td><td></td></tr><tr><td>probówka z nakrętką do usunięcia</td><td>Seaton Scientific</td><td>4014</td><td></td></tr><tr><td>pipety serologiczne 5 ml</td><td>Costar</td><td>4051</td><td></td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe 15 ml </td><td>ISC Bioexpress</td><td>P-5005-7</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety transferowe 5,8 ml, z cienką końcówką</td><td>VWR international</td><td>14670-329</td><td></td></tr><tr><td>probówki wirówkowe 15 ml</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>probówki do wirówki o pojemności 1 ml</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tabletki soli buforu Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5030-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka i rotor </td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>90SE i T-1270</td><td></td></tr><tr><td>płytki PCR 96-dołkowe</td><td>Bio-Rad</td><td>HSS-9601</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik na odczynniki 50 ml </td><td>Costar</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>Optyczna płytka reakcyjna Microamp z 96 dołkami</td><td>Applied Biosystems</td><td>N801-0560</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywy do płytek optycznych </td><td>Applied Biosystems</td><td>4333183</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka kompresyjna MicroAmp Optical</td><td>Applied Biosystems</td><td>4312639</td><td></td></tr><tr><td>folia Microseal A</td><td>Bio-Rad</td><td>MSA-5001</td><td></td></tr><tr><td>probówki do wirowania o pojemności 2 ml </td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>żele agarozy 1% (E-gel, Invitrogen)</td><td>Invitrogen</td><td>G-7008-01</td><td></td></tr><tr><td>E-base (Invitrogen)</td><td>Invitrogen</td><td>EB-M03</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Probówki do pobierania krwi z EDTA dowolnej marki</td></tr></tbody></table>

amplifikacja i kwantyfikacja rna hiv-1 u osób zakażonych hiv z ładunkiem wirusowym poniżej granicy wykrywalności standardowych testów klinicznych

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifikacja genów wirusowych oraz ilościowe oznaczanie RNA HIV-1 u osób zakażonych HIV-1, u których miano wirusa znajduje się poniżej granicy wykrywalności standardowych testów (poniżej 50-75 kopii/ml), jest niezbędne do zrozumienia dynamiki wirusa oraz interakcji wirus-gospodarz u pacjentów, którzy naturalnie kontrolują infekcję, a także u osób przyjmujących złożoną terapię antyretrowirusową (cART).
W niniejszej pracy opisujemy sposób amplifikacji genomów wirusowych za pomocą sekwencjonowania pojedynczych genomów (protokół SGS) 13, 19 oraz metodę dokładnego oznaczania ilości RNA HIV-1 u pacjentów z niską wiremią (protokół testu pojedynczej kopii (SCA)) 12, 20. 
Test jednej kopii (single-copy assay) jest testem real-time PCR, którego czułość zależy od objętości analizowanej plazmy. Jeśli w 7 ml plazmy zostanie wykryty pojedynczy genom wirusa, liczba kopii RNA jest raportowana jako 0,3 kopii/ml. Test posiada kontrolę wewnętrzną sprawdzającą wydajność ekstrakcji RNA oraz kontrole pod kątem możliwej amplifikacji z DNA lub kontaminacji. Próbki pacjentów są mierzone w trzech powtórzeniach.
Analiza sekwencjonowania pojedynczego genomu (SGS), obecnie powszechnie stosowana i uznawana za mało pracochłonną 3, 7, 12, 14, 15, jest analizą ograniczającego rozcieńczenia, w której produkt cDNA rozcieńczony do punktu końcowego jest rozprowadzany na płytce 96-dołkowej. Zgodnie z rozkładem Poissona, gdy mniej niż 1/3 dołków wykazuje obecność produktu, istnieje 80% prawdopodobieństwa, że produkt PCR jest wynikiem amplifikacji z pojedynczej cząsteczki cDNA. Przewagą SGS nad klonowaniem jest brak podatności na ponowne próbkowanie oraz brak błędu wynikającego z rekombinacji wprowadzonej przez PCR 19. Jednakże sukces amplifikacji w SCA i SGS zależy od projektu starterów. Obie analizy zostały opracowane dla HIV-1 podtypu B, ale mogą zostać dostosowane do innych podtypów i innych regionów genomu poprzez zmianę starterów, sond i standardów.

Ilościowe oznaczenie poziomu RNA HIV-1 w osoczu oraz sekwencjonowanie pojedynczych genomów HIV-1 u osób z wiremią poniżej granicy wykrywalności (50-75 kopii/ml) jest trudne. W niniejszym materiale opisujemy sposób izolacji i oznaczania ilościowego wirusowego RNA z osocza przy użyciu testu real-time PCR, który wiarygodnie mierzy poziom RNA HIV-1 aż do 0,3 kopii/ml, a także metodę amplifikacji genomów wirusowych poprzez sekwencjonowanie pojedynczych genomów z próbek o bardzo niskiej ładunku wirusowym.

Amplifikacja i kwantyfikacja RNA HIV-1 u osób zakażonych HIV z ładunkiem wirusowym poniżej granicy wykrywalności standardowych testów klinicznych

Amplifikacja genów wirusowych i kwantyfikacja RNA HIV-1 u osób zakażonych HIV-1 z wiremią poniżej granicy wykrywalności standardowych testów (poniżej...

W tym filmie zaprezentowano metody ilościowego oznaczania i sekwencjonowania pojedynczych genomów HIV u osób z wiremią poniżej 50 kopii na mililitr osocza. Najpierw probówkę zawierającą siedem mililitrów osocza wiruje się w celu ułożenia osadu. Następnie ekstrahuje się RNA wirusa, aby określić poziom HIV 1.Przeprowadza się analizę pojedynczej kopii, w której RNA poddawane jest odwrotnej transkrypcji, a następnie nanosi się je na płytkę 96-dołkową wraz ze standardami i kontrolami i poddaje ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Poziom wiremii oblicza się następnie na podstawie objętości wprowadzonej plazmy. W celu charakterystyki populacji wirusa możliwe jest wykrycie nawet 0,3 kopii na mililitr.Przeprowadza się pojedynczy test sekwencjonowania genomu, w którym cDNA przetranskrybowane z wirusowego RNA rozlewa się na płytkę 96-dołkową do uzyskania rozcieńczenia końcowego. Następnie wykonuje się zagnieżdżoną reakcję PCR w celu amplifikacji genomów wirusowych. Jeśli 30% lub mniej reakcji PCR jest pozytywnych dla danej próbki, wskazuje to na amplifikację pojedynczej kopii cDNA.Następnie próbki te poddaje się sekwencjonowaniu w celu poznania sekwencji nukleotydowej poszczególnych

amplifying-quantifying-hiv-1-rna-hiv-infected-individuals-with-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wzmacnianie i ilościowa ocena RNA wirusa HIV-1 u osób zakażonych wirusem HIV z obciążeniem wirusowym poniżej granicy wykrywalności w standardowych badaniach klinicznych

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Źródło: Claiborne, D. T. et al. A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses. J. Vis. Exp. (2014)Niniejszy film prezentuje ocenę zdolności replikacyjnej wirusa z wykorzystaniem radioznakowanego testu odwrotnej transkryptazy. Nadnadczynki hodowlane zawierające wiriony potomne dodaje się do mieszaniny odwrotnej transkrypcji zawierającej radioznakowany nukleotyd. Wbudowany sygnał odzwierciedla ilość wytworzonych...

Ocena zdolności replikacyjnej wirusa za pomocą radioznakowanego testu odwrotnej transkryptazy

Dostarczony jest protokół do opracowania testu amplifikacji polimerazy rekombinazy w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia początkowego stężenia próbek DNA za pomocą termocyklera lub mikroskopu i podgrzewacza scenicznego. Opisano również rozwój wewnętrznej kontroli pozytywnej. Dostępne są skrypty do przetwarzania surowych danych fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym.

Opracowanie ilościowego testu amplifikacji polimerazy rekombinazy z wewnętrzną kontrolą pozytywną

Opisujemy tutaj prostą i szybką metodę ekstrakcji DNA prowirusa HIV z pełnej krwi, wykrywaną metodą ilościowego PCR. Protokół ten może zostać rozszerzony do wykorzystania w wykrywaniu innych markerów genetycznych lub przy użyciu alternatywnych metod amplifikacji.

Filtracja izolacji kwasów nukleinowych: prosta i szybka metoda ekstrakcji DNA

Opisano metody oceny skuteczności i toksyczności cząsteczek RNA ukierunkowanych na etapy postintegracyjne cyklu replikacji HIV-1. Metody te są przydatne do badań przesiewowych nowych cząsteczek i optymalizacji formatu istniejących.

Ocena skuteczności i toksyczności RNA ukierunkowanych na produkcję HIV-1 do stosowania w terapii genowej lub lekowej

Opisana jest metodologia ilościowego oznaczania ekspresji 96 genów i 18 białek powierzchniowych przez pojedyncze komórki ex vivo, pozwalająca na identyfikację genów i białek o zróżnicowanej ekspresji w komórkach zakażonych wirusem w stosunku do komórek niezainfekowanych. Stosujemy podejście do badania limfocytów T CD4 + zakażonych SIV wyizolowanych od makaków rezusów.

Kwantyfikacja mRNA i ekspresji białek powierzchniowych w pojedynczych komórkach w limfocytach T CD4 + zakażonych małpim wirusem niedoboru odporności wyizolowanych od makaków rezusów

Indywidualne sekwencjonowanie prowirusowe o pełnej długości (FLIPS) zapewnia efektywną i wysokoprzepustową metodę amplifikacji i sekwencjonowania pojedynczych, prawie pełnej długości (nienaruszonych i wadliwych) prowirusów HIV-1 i pozwala na określenie ich potencjalnej zdolności replikacyjnej. Projekt FLIPS pozwala przezwyciężyć ograniczenia poprzednich testów zaprojektowanych do sekwencjonowania utajonego rezerwuaru HIV-1.

Amplifikacja prowirusów HIV-1 o niemal pełnej długości do sekwencjonowania nowej generacji

Ilościowa analiza łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym w połączeniu z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) jest szeroko stosowana do pomiaru poziomu infekcji wirusem RNA. W tym miejscu przedstawiamy bezpośredni test RT-qPCR, który nie wymaga etapu oczyszczania RNA, opracowany do oznaczania ilościowego kilku wirusów RNA, w tym wirusa dengi.

Pomiar RNA wirusa dengi w supernatancie hodowli zakażonych komórek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym

Tutaj prezentujemy podejście do głębokiego sekwencjonowania, które zapewnia bezstronne określenie powstających 3'-końców, jak również profili mutacyjnych jednoniciowych cząsteczek DNA. Głównym zastosowaniem jest charakterystyka powstających retrowirusowych komplementarnych DNA (cDNA), produktów pośrednich powstających w procesie retrowirusowej odwrotnej transkrypcji.

Oznaczanie 3'-końców i sekwencji powstających jednoniciowych cząsteczek wirusowego DNA podczas odwrotnej transkrypcji HIV-1 w zakażonych komórkach

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Poznaj metodę amplifikacji i ilościowego oznaczania RNA HIV-1 u pacjentów z niską wiremią. Technika umożliwia wykrycie poziomu wirusa już od 0,3 kopii/ml, co wspiera badania nad dynamiką wirusa i odpowiedzią na leczenie.

Amplifikacja i ilościowe oznaczanie RNA HIV-1 u osób zakażonych wirusem HIV z wiremią poniżej granicy wykrywalności za pomocą standardowych testów klinicznych (Wideo) | JoVE Journal

Amplifikacja i kwantyfikacja RNA HIV-1 u osób zakażonych HIV z ładunkiem wirusowym poniżej granicy wykrywalności standardowych testów klinicznych

Przeglądaj więcej filmów