Name: Amplifikacja i ilościowe oznaczanie RNA HIV-1 u osób zakażonych wirusem HIV z wiremią poniżej granicy wykrywalności za pomocą standardowych testów klinicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: Poznaj metodę amplifikacji i ilościowego oznaczania RNA HIV-1 u pacjentów z niską wiremią. Technika umożliwia wykrycie poziomu wirusa już od 0,3 kopii/ml, co wspiera badania nad dynamiką wirusa i odpowiedzią na leczenie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować pacjentom, którzy wzięli udział w licznych badaniach nad HIV-1.
J.M.C. był profesorem badawczym American Cancer Society przy wsparciu F.M. Kirby Foundation.

<ol><li>Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., O'Neil, S. P., Staprans, S. I., Montefiori, D. C., Xu, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+a+mucosal+challenge+and+prevention+of+AIDS+by+a+multiprotein+DNA%2FMVA+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine.</a> Vaccine. 20, 1949-1955 (2002).</li>
<li>Dinoso, J., Kim, S., Blankson, J., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Dynamics+of+Elite+Suppressors+in+HIV-1+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Conference+on+Retroviruses+and+Opportunistic+Infections%22%5BJournal%5D)">Viral Dynamics of Elite Suppressors in HIV-1 Infection.</a> Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. , (2008).</li>
<li>Dinoso, J. B., Kim, S. Y., Wiegand, A. M., Palmer, S. E., Gange, S. J., Cranmer, L., O'Shea, A., Callender, M., Spivak, A., Brennan, T., Kearney, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+intensification+does+not+reduce+residual+HIV-1+viremia+in+patients+on+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Treatment intensification does not reduce residual HIV-1 viremia in patients on highly active antiretroviral therapy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9403-9408 (2009).</li>
<li>Doria-Rose, N. A., Klein, R. M., Manion, M. M., O'Dell, S., Phogat, A., Chakrabarti, B., Hallahan, C. W., Migueles, S. A., Wrammert, J., Ahmed, R., Nason, M., Wyatt, R. T., Mascola, J. R., Connors, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+and+phenotype+of+human+immunodeficiency+virus+envelope-specific+B+cells+from+patients+with+broadly+cross-neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Frequency and phenotype of human immunodeficiency virus envelope-specific B cells from patients with broadly cross-neutralizing antibodies.</a> J. Virol. 83, 188-199 (2009).</li>
<li>Dornadula, G., Zhang, H., Uitert, B. V. an, Stern, J., Livornese, L., Ingerman, M. J., Witek, J., Kedanis, R. J., Natkin, J., DeSimone, J., Pomerantz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+HIV-1+RNA+in+blood+plasma+of+patients+taking+suppressive+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Residual HIV-1 RNA in blood plasma of patients taking suppressive highly active antiretroviral therapy.</a> JAMA. 282, 1627-1632 (1999).</li>
<li>Gandhi, R. T., Zheng, L., Bosch, R. J., Chan, E. S., Margolis, D. M., Read, S., Kallungal, B., Palmer, S., Medvik, K., Lederman, M. M., Alatrakchi, N., Jacobson, J. M., Wiegand, A., Kearney, M., Coffin, J. M., Mellors, J. W., Eron, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+raltegravir+intensification+on+low-level+residual+viremia+in+HIV-infected+patients+on+antiretroviral+therapy%3A+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+medicine%22%5BJournal%5D)">The effect of raltegravir intensification on low-level residual viremia in HIV-infected patients on antiretroviral therapy: a randomized controlled trial.</a> PLoS medicine. 7, (2010).</li>
<li>Gay, C., Dibben, O., Anderson, J. A., Stacey, A., Mayo, A. J., Norris, P. J., Kuruc, J. D., Salazar-Gonzalez, J. F., Li, H., Keele, B. F., Hicks, C., Margolis, D., Ferrari, G., Haynes, B., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+detection+of+acute+HIV+infection%3A+timing+of+transmission%2C+inflammation+and+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional detection of acute HIV infection: timing of transmission, inflammation and antiretroviral therapy.</a> PLoS One. 6, 19617-19617 (2011).</li>
<li>Hatano, H., Delwart, E. L., Norris, P. J., Lee, T. H., Dunn-Williams, J., Hunt, P. W., Hoh, R., Stramer, S. L., Linnen, J. M., McCune, J. M., Martin, J. N., Busch, M. P., Deeks, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+persistent+low-level+viremia+in+individuals+who+control+human+immunodeficiency+virus+in+the+absence+of+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Evidence for persistent low-level viremia in individuals who control human immunodeficiency virus in the absence of antiretroviral therapy.</a> J. Virol. 83, 329-335 (2009).</li>
<li>Havlir, D. V., Bassett, R., Levitan, D., Gilbert, P., Tebas, P., Collier, A. C., Hirsch, M. S., Ignacio, C., Condra, J., Gunthard, H. F., Richman, D. D., Wong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+predictive+value+of+intermittent+viremia+with+combination+hiv+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Prevalence and predictive value of intermittent viremia with combination hiv therapy.</a> JAMA. 286, 171-179 (2001).</li>
<li>Jordan, M. R., Kearney, M., Palmer, S., Shao, W., Maldarelli, F., Coakley, E. P., Chappey, C., Wanke, C., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+standard+PCR%2Fcloning+to+single+genome+sequencing+for+analysis+of+HIV-1+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of standard PCR/cloning to single genome sequencing for analysis of HIV-1 populations.</a> J Virol Methods. 168, 114-120 (2010).</li>
<li>Kaufmann, D. E., Kavanagh, D. G., Pereyra, F., Zaunders, J. J., Mackey, E. W., Miura, T., Palmer, S., Brockman, M., Rathod, A., Piechocka-Trocha, A., Baker, B., Zhu, B., Gall, S. L. e, Waring, M. T., Ahern, R., Moss, K., Kelleher, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+CTLA-4+by+HIV-specific+CD4%2B+T+cells+correlates+with+disease+progression+and+defines+a+reversible+immune+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Upregulation of CTLA-4 by HIV-specific CD4+ T cells correlates with disease progression and defines a reversible immune dysfunction.</a> Nat Immunol. 8, 1246-1254 (2007).</li>
<li>Kearney, M., Maldarelli, F., Shao, W., Margolick, J. B., Daar, E. S., Mellors, J. W., Rao, V., Coffin, J. M., Palmer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Population+Genetics+and+Adaptation+in+Newly+Infected+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Population Genetics and Adaptation in Newly Infected Individuals.</a> J. Virol. 83, 2715-2727 (2008).</li>
<li>Kearney, M., Palmer, S., Maldarelli, F., Shao, W., Polis, M. A., Mican, J., Rock-Kress, D., Margolick, J. B., Coffin, J. M., Mellors, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+polymorphism+at+drug+resistance+sites+in+HIV-1+protease+and+reverse+transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Frequent polymorphism at drug resistance sites in HIV-1 protease and reverse transcriptase.</a> AIDS. 22, 497-501 (2008).</li>
<li>Kearney, M., Spindler, J., Shao, W., Maldarelli, F., Palmer, S., Hu, S. L., Lifson, J. D., Kewal Ramani, V. N., Mellors, J. W., Coffin, J. M., Ambrose, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+of+simian+immunodeficiency+virus+encoding+HIV-1+reverse+transcriptase+persists+in+macaques+despite+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity of simian immunodeficiency virus encoding HIV-1 reverse transcriptase persists in macaques despite antiretroviral therapy.</a> Journal of Virology. 85, 1067-1076 (2011).</li>
<li>Keele, B. F., Giorgi, E. E., Salazar-Gonzalez, J. F., Decker, J. M., Pham, K. T., Salazar, M. G., Sun, C., Grayson, T., Wang, S., Li, H., Wei, X., Jiang, C., Kirchherr, J. L., Gao, F., Anderson, J. A., Ping, L. H., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+transmitted+and+early+founder+virus+envelopes+in+primary+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 105-7552 (2008).</li>
<li>Liu, S. L., Rodrigo, A. G., Shankarappa, R. G., Learn, H., Hsu, L., Davidov, O., Zhao, L. P., Mullins, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+quasispecies+and+resampling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HIV quasispecies and resampling.</a> Science. 273, 415-416 (1996).</li>
<li>Mahalanabis, M., Jayaraman, P., Miura, T., Pereyra, F., Chester, E. M., Richardson, B., Walker, B., Haigwood, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+viral+escape+and+selection+by+autologous+neutralizing+antibodies+in+drug-naive+human+immunodeficiency+virus+controllers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Continuous viral escape and selection by autologous neutralizing antibodies in drug-naive human immunodeficiency virus controllers.</a> J. Virol. 83, 662-672 (2009).</li>
<li>Migueles, S. A., Connors, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+CD4%28%2B%29+and+CD8%28%2B%29+T+Cells+in+Controlling+HIV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Infect.+Dis.+Rep%22%5BJournal%5D)">The Role of CD4(+) and CD8(+) T Cells in Controlling HIV Infection.</a> Curr. Infect. Dis. Rep. 4, 461-467 (2002).</li>
<li>Palmer, S., Kearney, M., Maldarelli, F., Halvas, E. K., Bixby, C. J., Bazmi, H., Rock, D., Falloon, J., Davey, R. T., Dewar, R. L., Metcalf, J. A., Hammer, S., Mellors, J. W., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple%2C+linked+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+mutations+in+treatment-experienced+patients+are+missed+by+standard+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 406-413 (2005).</li>
<li>Palmer, S., Wiegand, A. P., Maldarelli, F., Bazmi, H., Mican, J. M., Polis, M., Dewar, R. L., Planta, A., Liu, S., Metcalf, J. A., Mellors, J. W., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+real-time+reverse+transcriptase-initiated+PCR+assay+with+single-copy+sensitivity+for+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNA+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 4531-4536 (2003).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Osoby zakażone HIV-1 przyjmujące złożoną terapię antyretrowirusową (cART) lub naturalnie kontrolujące infekcję wykazują bardzo niską wiremię, zazwyczaj około 1 kopii na ml osocza4, 11, 12, 17, 18. Wiremia u pacjentów z naturalną kontrolą często fluktuuje wokół indywidualnego punktu nastawczego1, 2, 17. Czułość opisanych tutaj testów jest w dużym stopniu zależna od objętości użytego osocza. Zazwyczaj pracujemy z 7 ml osocza, jednak w zależności od rzeczywistej wiremii w osoczu, pozytywne wyniki można...

<table><tbody><tr><td>Losowe heksamery (500 µg/ml)</td><td>Promega Corp.</td><td>C118A</td><td></td></tr><tr><td>bufor TaqMan A</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304441</td><td></td></tr><tr><td>RNAsin (40 U/μl)</td><td>Promega Corp.</td><td>N211B</td><td></td></tr><tr><td>enzym RT (200 J/µl) </td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>600107-51</td><td></td></tr><tr><td>polimeraza DNA Amplitaq Gold</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311814</td><td>opakowanie 6 sztuk</td></tr><tr><td>bufor PCR Amplitaq 10X Gold PCR buffer II</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311814</td><td>dołączony do enzymu</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu 25 mM</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311814</td><td>zawiera enzym</td></tr><tr><td>bufor Tris-HCl 1 M, pH 8,0, 5 mM</td><td>Invitrogen</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>enzym odwrotna transkryptaza Superscript III, 200 U/ul </td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>bufor 10X Superscript III</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>dołączony do enzymu</td></tr><tr><td>DTT 100 mM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>dołączony do enzymu</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Platinum Taq High Fidelity 5 U/ul</td><td>Invitrogen</td><td>11304-102</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do PCR o wysokiej wierności 10X</td><td>Invitrogen</td><td>11304-102</td><td>dołączony do enzymu</td></tr><tr><td>Proteinaza K 20 mg/ml</td><td>Ambion</td><td>2546</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór tiocyjanianu guanidynium 6M</td><td>Fluka</td><td>50983</td><td></td></tr><tr><td>Glikogen 20 mg/ml</td><td>Grupa Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19516</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E702-3</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy molekularnej </td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>dNTP (po 25 mmol każdego) </td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe Easy Seal (16x73 mm)</td><td>Seaton Scientific</td><td>6041</td><td></td></tr><tr><td>Korony z białego Delrinu </td><td>Seaton Scientific</td><td>4020</td><td>Nakrętki do probówek Easy Seal</td></tr><tr><td>Statyw na probówki Optiseal Bell-Top, 8,9 ml</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>361642</td><td></td></tr><tr><td>Klucz imbusowy &amp;frac12; otwarcie nacięcia</td><td>Seaton Scientific</td><td>4013</td><td></td></tr><tr><td>probówka z nakrętką do usunięcia</td><td>Seaton Scientific</td><td>4014</td><td></td></tr><tr><td>pipety serologiczne 5 ml</td><td>Costar</td><td>4051</td><td></td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe 15 ml </td><td>ISC Bioexpress</td><td>P-5005-7</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety transferowe 5,8 ml, z cienką końcówką</td><td>VWR international</td><td>14670-329</td><td></td></tr><tr><td>probówki wirówkowe 15 ml</td><td>Falcon BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>probówki do wirówki o pojemności 1 ml</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tabletki soli buforu Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5030-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka i rotor </td><td>Sorvall, Thermo Scientific</td><td>90SE i T-1270</td><td></td></tr><tr><td>płytki PCR 96-dołkowe</td><td>Bio-Rad</td><td>HSS-9601</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik na odczynniki 50 ml </td><td>Costar</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>Optyczna płytka reakcyjna Microamp z 96 dołkami</td><td>Applied Biosystems</td><td>N801-0560</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywy do płytek optycznych </td><td>Applied Biosystems</td><td>4333183</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka kompresyjna MicroAmp Optical</td><td>Applied Biosystems</td><td>4312639</td><td></td></tr><tr><td>folia Microseal A</td><td>Bio-Rad</td><td>MSA-5001</td><td></td></tr><tr><td>probówki do wirowania o pojemności 2 ml </td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>żele agarozy 1% (E-gel, Invitrogen)</td><td>Invitrogen</td><td>G-7008-01</td><td></td></tr><tr><td>E-base (Invitrogen)</td><td>Invitrogen</td><td>EB-M03</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Probówki do pobierania krwi z EDTA dowolnej marki</td></tr></tbody></table>

amplifikacja i kwantyfikacja rna hiv-1 u osób zakażonych hiv z ładunkiem wirusowym poniżej granicy wykrywalności standardowych testów klinicznych

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifikacja genów wirusowych oraz ilościowe oznaczanie RNA HIV-1 u osób zakażonych HIV-1, u których miano wirusa znajduje się poniżej granicy wykrywalności standardowych testów (poniżej 50-75 kopii/ml), jest niezbędne do zrozumienia dynamiki wirusa oraz interakcji wirus-gospodarz u pacjentów, którzy naturalnie kontrolują infekcję, a także u osób przyjmujących złożoną terapię antyretrowirusową (cART).
W niniejszej pracy opisujemy sposób amplifikacji genomów wirusowych za pomocą sekwencjonowania pojedynczych genomów (protokół SGS) 13, 19 oraz metodę dokładnego oznaczania ilości RNA HIV-1 u pacjentów z niską wiremią (protokół testu pojedynczej kopii (SCA)) 12, 20. 
Test jednej kopii (single-copy assay) jest testem real-time PCR, którego czułość zależy od objętości analizowanej plazmy. Jeśli w 7 ml plazmy zostanie wykryty pojedynczy genom wirusa, liczba kopii RNA jest raportowana jako 0,3 kopii/ml. Test posiada kontrolę wewnętrzną sprawdzającą wydajność ekstrakcji RNA oraz kontrole pod kątem możliwej amplifikacji z DNA lub kontaminacji. Próbki pacjentów są mierzone w trzech powtórzeniach.
Analiza sekwencjonowania pojedynczego genomu (SGS), obecnie powszechnie stosowana i uznawana za mało pracochłonną 3, 7, 12, 14, 15, jest analizą ograniczającego rozcieńczenia, w której produkt cDNA rozcieńczony do punktu końcowego jest rozprowadzany na płytce 96-dołkowej. Zgodnie z rozkładem Poissona, gdy mniej niż 1/3 dołków wykazuje obecność produktu, istnieje 80% prawdopodobieństwa, że produkt PCR jest wynikiem amplifikacji z pojedynczej cząsteczki cDNA. Przewagą SGS nad klonowaniem jest brak podatności na ponowne próbkowanie oraz brak błędu wynikającego z rekombinacji wprowadzonej przez PCR 19. Jednakże sukces amplifikacji w SCA i SGS zależy od projektu starterów. Obie analizy zostały opracowane dla HIV-1 podtypu B, ale mogą zostać dostosowane do innych podtypów i innych regionów genomu poprzez zmianę starterów, sond i standardów.

Ilościowe oznaczenie poziomu RNA HIV-1 w osoczu oraz sekwencjonowanie pojedynczych genomów HIV-1 u osób z wiremią poniżej granicy wykrywalności (50-75 kopii/ml) jest trudne. W niniejszym materiale opisujemy sposób izolacji i oznaczania ilościowego wirusowego RNA z osocza przy użyciu testu real-time PCR, który wiarygodnie mierzy poziom RNA HIV-1 aż do 0,3 kopii/ml, a także metodę amplifikacji genomów wirusowych poprzez sekwencjonowanie pojedynczych genomów z próbek o bardzo niskiej ładunku wirusowym.

Amplifikacja i kwantyfikacja RNA HIV-1 u osób zakażonych HIV z ładunkiem wirusowym poniżej granicy wykrywalności standardowych testów klinicznych

Amplifikacja genów wirusowych i kwantyfikacja RNA HIV-1 u osób zakażonych HIV-1 z wiremią poniżej granicy wykrywalności standardowych testów (poniżej...

W tym filmie zaprezentowano metody ilościowego oznaczania i sekwencjonowania pojedynczych genomów HIV u osób z wiremią poniżej 50 kopii na mililitr osocza. Najpierw probówkę zawierającą siedem mililitrów osocza wiruje się w celu ułożenia osadu. Następnie ekstrahuje się RNA wirusa, aby określić poziom HIV 1.Przeprowadza się analizę pojedynczej kopii, w której RNA poddawane jest odwrotnej transkrypcji, a następnie nanosi się je na płytkę 96-dołkową wraz ze standardami i kontrolami i poddaje ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Poziom wiremii oblicza się następnie na podstawie objętości wprowadzonej plazmy. W celu charakterystyki populacji wirusa możliwe jest wykrycie nawet 0,3 kopii na mililitr.Przeprowadza się pojedynczy test sekwencjonowania genomu, w którym cDNA przetranskrybowane z wirusowego RNA rozlewa się na płytkę 96-dołkową do uzyskania rozcieńczenia końcowego. Następnie wykonuje się zagnieżdżoną reakcję PCR w celu amplifikacji genomów wirusowych. Jeśli 30% lub mniej reakcji PCR jest pozytywnych dla danej próbki, wskazuje to na amplifikację pojedynczej kopii cDNA.Następnie próbki te poddaje się sekwencjonowaniu w celu poznania sekwencji nukleotydowej poszczególnych genomów wirusowych. Wysoka czułość tych technik pozwala nam monitorować poziom wirusa u pacjentów z niewykrywalną ilością HIV RNA w standardowych badaniach oraz zrozumieć mechanizmy naturalnej kontroli. Choć metody te wykorzystujemy do badania HIV przy użyciu różnych starterów i wewnętrznego standardu jonowego, ta sama metoda może być stosowana do badania innych wirusów.Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta jest wymagająca, ponieważ izolacja wirusa z dużych objętości osocza jest trudna, a aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich, niezbędne jest środowisko wolne od DNA. Należy rozpocząć tę procedurę od ekstrakcji RNA z próbek osocza pacjentów. Przenieś 7 ml osocza do czystej probówki o pojemności 15 ml.Jeśli RNA ma zostać wyekstrahowane do analizy pojedynczej kopii, na tym etapie dodaje się 200 µL wewnętrznej kontroli wirionowej zawierającej 30 000 kopii wirusa RCA. Następnie, aby uniknąć obecności lipidów i szczątków komórkowych, które mogą zakłócać oznaczanie ilości RNA, plazmę wiruje się bez wypełnienia wirówki (free-spin) przy 2 600 ×g przez 15 minut. Po zakończeniu wirowania należy zaznaczyć jedną stronę probówki wirówkowej z łatwym zamknięciem (easy seal) markerem wodoodpornym, omijając wszelkie szczątki komórkowe i lub lipidy. Za pomocą pipety należy przenieść plazmę do zaznaczonej probówki.Następnie zapisz objętość wprowadzonej plazmy. Napełnij probówki buforem TBS do dolnej krawędzi gwintu szyjki. Upewnij się, że nie powstały pęcherzyki powietrza.Zakręć probówki. Umieść próbki z oznaczeniami skierowanymi na zewnątrz w schłodzonym wcześniej rotorze ultrawirówki. Wirować przy 170 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.Po wirowaniu osad nie będzie widoczny. Usunąć nadsącz, a następnie dodać 90 µl wody klasy molekularnej oraz 10 µL białka ACE K do osadu wirusowego. Następnie upewnić się, że probówka znajduje się pod kątem, a osad jest zanurzony w mieszaninie wody z białkiem ACE K.Umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C i inkubuj przez 30 minut. Po inkubacji krótko wiruj probówkę, aby osadzić próbkę na jej dnie. Następnie, po dodaniu 10 µL glikogenu o stężeniu 20 mg/mL oraz 315 µL 6 M roztworu tiocyjanianu guanidyny, wymieszaj całość na wirówce typu vortex.Ostrożnie przenieś zawartość probówki do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml zawierającej 495 µL izopropanolu klasy molekularnej i mieszaj w wirówce typu vortex przez 10 sekund. Następnie wiruj przy 21 000 ×g przez 30 minut w temperaturze pokojowej, odlej nadsącz i dodaj do probówki 500 µL 70% etanolu, mieszaj w vortexie przez 10 sekund i wiruj przy 21 000 ×g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Za pomocą dużej pipety transferowej usuń etanol, ponownie odwiruj próbkę, aby usunąć resztki etanolu, a następnie susz osad na powietrzu przez 10 minut.Jeśli planowane jest wykonanie analizy pojedynczej kopii, rozpuścić osad w 55 µL buforu do RNA i umieścić probówkę na lodzie. Jeśli planowane jest sekwencjonowanie pojedynczego genomu, rozpuścić RNA w 40 µL chlorku trysu o pH 8.0 i pozostawić probówki w temperaturze pokojowej w celu przeprowadzenia analizy pojedynczej kopii.Krzywe standardowe dla HIV one oraz RCAs przygotowuje się poprzez wykonanie półlogarytmicznych rozcieńczeń seryjnych transkryptów RNA HIV one i RCAs w buforze do RNA. Po opisaniu probótek o pojemności 1,5 ml, do każdej z nich należy dodać 54 µL buforu do RNA. Następnie wykonuje się rozcieńczenia do stężenia 0,3 kopii RNA na 10 µL dla HIV one oraz 100 kopii RNA na 10 µL dla RCAs.Mieszaj za pomocą wibratora po każdym rozcieńczeniu. Po dodaniu 54 µL buforu do RNA do każdej probówki, zacznij od dodania 25 µL transkryptu do pierwszej probówki, krótko wymieszaj wibratorem, odwiruj i przeniesion kolejno do następnej probówki, kontynuując proces aż do ostatniej opisanej probówki.Po przygotowaniu rozcieńczeń połączyć odwrotną transkryptazę lub koktajl RT do syntezy cDNA. Przygotować ilość wystarczającą dla 96 reakcji RT-PCR, w tym dla ośmiu reakcji kontrolnych bez odwrotnej transkryptazy (NRT), aby kontrolować amplifikację z DNA. Następnie przygotować optyczną płytkę 96-dołkową, w której znajdzie się osiem próbek pacjentów, wliczając standardy i kontrole.Do ośmiu otworów przeznaczonych na reakcję NRT należy dodać 20 µL mieszaniny reakcyjnej NRT, a do pozostałych 88 otworów dodać 20 µL mieszaniny reakcyjnej RT. Po dodaniu mieszanin RT i NRT na płytkę, do otworów oznaczonych jako kontrole negatywne należy dodać 10 µL wody. Następnie do otworów oznaczonych jako HIV należy dodać 10 µL transkryptyrów HIV w stężeniach wskazanych w towarzyszącym protokole pisanym, a do dwóch otworów oznaczonych jako RCA.Do ośmiu zestawów po trzy sąsiednie studzienki oznaczone jako „próbka” (sample) na płytce dodaj po 10 µL transkryptów RCA w odpowiednich stężeniach, a następnie dodaj 10 µL wspomnianej próbki. Dodaj również 10 µL tej próbki do ośmiu studzienek oznaczonych jako NRT, a następnie do studzienek oznaczonych jako kontrola wewnętrzna (internal control). Po zakończeniu dodaj 5 µL próbki i 5 µL wody.Płytkę 96-dołkową przygotowuje się zgodnie z przedstawionym schematem. Płytkę należy szczelnie zamknąć i inkubować w termocyklerze zgodnie z następującymi parametrami: 25 °C przez 15 minut, 42 °C przez 40 minut, 85 °C przez 10 minut, 25 °C przez 30 minut, a następnie przechowywać w temperaturze 5 °C.Przygotuj mieszaniny reakcyjne (master mixy) do PCR dla HIV oraz RCA, podczas gdy trwa synteza cDNA. Po zakończeniu syntezy cDNA przenieś płytkę do wyznaczonej strefy poza pomieszczeniem czystym, przeznaczonej do pracy z cDNA.Do każdej z studni zaznaczonych na zielono na tej rycinie dodaj 20 µL master mixu H-I-V-P-C-R do QPCR. Następnie do studni zaznaczonej na szaro na tej rycinie dodaj 20 µL master mixu PCR RCAs. Po wykonaniu tych czynności odwiruj płytkę z prędkością 2 600 ×g.Umieść płytkę w urządzeniu do PCR w czasie rzeczywistym i przeprowadź qPCR zgodnie z następującymi warunkami: 95°C przez 10 minut, a następnie 45 cykli obejmujących 95°C przez 15 sekund i 60°C przez jedną minutę. Po uzyskaniu wyników wymagana jest oddzielna analiza RCAs oraz HIV w celu przeprowadzenia sekwencjonowania pojedynczych genomów.Proces należy rozpocząć od syntezy cDNA, wykorzystując jako matrycę RNA zawieszone w trójchlorowodorku TRIS o pH 8,0. W pierwszej kolejności, w 96-dołkowej płytce PCR, należy połączyć 5 µL 10 mM dNTP, 5 µL 2 mM startera specyficznego dla genu (pole lub en) oraz 40 µL wyekstrahowanego RNA. Płytkę należy zamknąć folią uszczelniającą MicroSeal z firmy BioRad.Następnie inkubować reakcję przez 10 minut w temperaturze 65 °C w celu denaturacji mieszaniny RNA. W czasie denaturacji RNA przygotować mieszaninę reakcyjną RT.Należy pamiętać, że jest to inny skład mieszaniny reakcyjnej RT niż ten stosowany w teście jednej kopii. Po etapie denaturacji należy umieścić płytkę PCR w lodzie, aby utrzymać RNA w formie zdenaturowanej. Następnie do każdej próbki należy dodać 50 µL świeżo przygotowanej mieszaniny reakcyjnej RT i inkubować płytkę PCR w termocyklerze według następujących ustawień: 45 °C przez 50 minut, 85 °C przez 10 minut oraz 4 °C do czasu zakończenia procesu.Na tym etapie RNA jest odwrotnię transkrybowane do cDNA podczas syntezy cDNA. Należy przygotować mieszaninę reakcyjną PCR z użyciem starterów RT dla P6 lub dla białka otoczki. Należy pamiętać, że jest to inna mieszanina reakcyjna PCR niż ta stosowana w teście pojedynczej kopii. Do każdej z 73 studzienek nowej płytki PCR 96-dołkowej, obejmujących 70 próbek i trzy kontrole negatywne, należy nanieść 8,0 µL świeżo przygotowanej mieszaniny reakcyjnej PCR.Po zakończeniu syntezy CD NA przenieś płytkę do obszaru poza pomieszczeniem czystym, przeznaczonego do pracy z CD NA. Następnie dodaj 40 µL chlorku trisu o pH 8,0 do próbki CD NA, aby uzyskać objętość końcową 140 µL. Następnie dodaj 2,0 µL próbki do każdego z 70 dołków oraz 2,0 µL wody do każdej z kontrol ujemnych. Zamknij płytkę PCR i przeprowadź reakcję PCR zgodnie z przedstawionym tutaj programem.Następnie przeprowadź nested PCR zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym tekście pisanym. Po zakończeniu reakcji PCR przeprowadź elektroforezę próbek w 1% żelu agarozowym. Przeanalizuj wyniki.Jeśli nie więcej niż 30% studzienek jest pozytywnych, większość produktów PCR jest wynikiem pojedynczej cząsteczki cDNA. Analizę pojedynczej kopii przeprowadzono zgodnie z opisem w tym filmie. Rysunek ten przedstawia wyniki qPCR uzyskane od niektórych elitarnych kontrolerów.Jak widać tutaj, krzywe amplifikacji dla próbek oraz rozcieńczonego standardu HIV wyglądają prawidłowo. Odzysk wewnętrznego standardu wirionowego przekroczył 1500 kopii dla większości próbek, z wyjątkiem zaznaczonej okręgiem próbki numer siedem. Wyniki dla próbki numer trzy, wyróżnione na czerwono, potwierdzają wydajną ekstrakcję RNA.Liczba kopii w trzech dołkach wynosiła odpowiednio zero, jedną i zero kopii. Kontrola NRT zaznaczona na pomarańczowo oraz kontrola negatywna zaznaczona na żółto okazały się negatywne, co potwierdza, że amplifikacja nie została zaburzona przez kontaminację z innych próbek; przy pomyślnym przejściu kontroli pozytywnej i negatywnej można teraz obliczyć liczbę kopii. Średnią liczbę kopii wynoszącą 0,3 należy pomnożyć przez współczynnik 5,5, aby uzyskać całkowitą liczbę kopii w eluacie RNA: 0,3 razy 5,5 równa się 1,65, a następnie podzielić przez całkowitą objętość analizowanej osocza, która wynosiła 7,3 ml, co daje wynik 0,2 kopii RNA HIV 1 na ml.Analizę sekwencjonowania pojedynczego genomu przeprowadzono zgodnie z opisem w filmie. Na tej rycinie przedstawiono żel AROS jednego z niekontrolerów HIV-1 biorących udział w badaniu. Kontrole ujemne w dołkach H1 i H2 są ujemne.Mniej niż jedna trzecia studzienek uległa amplifikacji, co potwierdza, że jest to rozcieńczenie końcowe, a większość tych amplifikacji pochodzi z pojedynczej kopii cDNA. Tutaj przedstawiono dopasowanie sekwencji z SGS. Brak miejsc niejednoznacznych potwierdza, że amplifikacja pochodziła z pojedynczej kopii cDNA podczas próby ekstrakcji RNA z dużych objętości osocza.Ważne jest, aby pamiętać o wykonaniu wirowania wstępnego (pre-spin), aby uniknąć obecności komórek i lipidów, które mogą zakłócać wydajność analizy po jej opracowaniu. Technika ta była stosowana do badania dynamiki wirusów w szerokim zakresie grup pacjentów z ładunkiem wirusowym poniżej granicy wykrywalności standardowymi metodami analizy.

amplifying-quantifying-hiv-1-rna-hiv-infected-individuals-with-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wzmacnianie i ilościowa ocena RNA wirusa HIV-1 u osób zakażonych wirusem HIV z obciążeniem wirusowym poniżej granicy wykrywalności w standardowych badaniach klinicznych

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Dostarczony jest protokół do opracowania testu amplifikacji polimerazy rekombinazy w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia początkowego stężenia próbek DNA za pomocą termocyklera lub mikroskopu i podgrzewacza scenicznego. Opisano również rozwój wewnętrznej kontroli pozytywnej. Dostępne są skrypty do przetwarzania surowych danych fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym.

Opracowanie ilościowego testu amplifikacji polimerazy rekombinazy z wewnętrzną kontrolą pozytywną

Opisujemy tutaj prostą i szybką metodę ekstrakcji DNA prowirusa HIV z pełnej krwi, wykrywaną metodą ilościowego PCR. Protokół ten może zostać rozszerzony do wykorzystania w wykrywaniu innych markerów genetycznych lub przy użyciu alternatywnych metod amplifikacji.

Filtracja izolacji kwasów nukleinowych: prosta i szybka metoda ekstrakcji DNA

Opisano metody oceny skuteczności i toksyczności cząsteczek RNA ukierunkowanych na etapy postintegracyjne cyklu replikacji HIV-1. Metody te są przydatne do badań przesiewowych nowych cząsteczek i optymalizacji formatu istniejących.

Ocena skuteczności i toksyczności RNA ukierunkowanych na produkcję HIV-1 do stosowania w terapii genowej lub lekowej

Opisana jest metodologia ilościowego oznaczania ekspresji 96 genów i 18 białek powierzchniowych przez pojedyncze komórki ex vivo, pozwalająca na identyfikację genów i białek o zróżnicowanej ekspresji w komórkach zakażonych wirusem w stosunku do komórek niezainfekowanych. Stosujemy podejście do badania limfocytów T CD4 + zakażonych SIV wyizolowanych od makaków rezusów.

Kwantyfikacja mRNA i ekspresji białek powierzchniowych w pojedynczych komórkach w limfocytach T CD4 + zakażonych małpim wirusem niedoboru odporności wyizolowanych od makaków rezusów

Indywidualne sekwencjonowanie prowirusowe o pełnej długości (FLIPS) zapewnia efektywną i wysokoprzepustową metodę amplifikacji i sekwencjonowania pojedynczych, prawie pełnej długości (nienaruszonych i wadliwych) prowirusów HIV-1 i pozwala na określenie ich potencjalnej zdolności replikacyjnej. Projekt FLIPS pozwala przezwyciężyć ograniczenia poprzednich testów zaprojektowanych do sekwencjonowania utajonego rezerwuaru HIV-1.

Amplifikacja prowirusów HIV-1 o niemal pełnej długości do sekwencjonowania nowej generacji

Ilościowa analiza łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym w połączeniu z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) jest szeroko stosowana do pomiaru poziomu infekcji wirusem RNA. W tym miejscu przedstawiamy bezpośredni test RT-qPCR, który nie wymaga etapu oczyszczania RNA, opracowany do oznaczania ilościowego kilku wirusów RNA, w tym wirusa dengi.

Pomiar RNA wirusa dengi w supernatancie hodowli zakażonych komórek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym

Tutaj prezentujemy podejście do głębokiego sekwencjonowania, które zapewnia bezstronne określenie powstających 3'-końców, jak również profili mutacyjnych jednoniciowych cząsteczek DNA. Głównym zastosowaniem jest charakterystyka powstających retrowirusowych komplementarnych DNA (cDNA), produktów pośrednich powstających w procesie retrowirusowej odwrotnej transkrypcji.

Oznaczanie 3'-końców i sekwencji powstających jednoniciowych cząsteczek wirusowego DNA podczas odwrotnej transkrypcji HIV-1 w zakażonych komórkach

Spinki i pętle RNA mogą funkcjonować jako startery do odwrotnej transkrypcji (RT) w przypadku braku starterów specyficznych dla sekwencji, zakłócając badanie nakładających się na siebie transkryptów antysensownych. Opracowaliśmy technikę zdolną do identyfikacji swoistego dla nici RNA i wykorzystaliśmy ją do badania białka antysensownego HIV-1 ASP.

Wykrywanie transkryptów RNA białka antysensownego (ASP) ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) u pacjentów za pomocą RT-PCR swoistego dla nici

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Poznaj metodę amplifikacji i ilościowego oznaczania RNA HIV-1 u pacjentów z niską wiremią. Technika umożliwia wykrycie poziomu wirusa już od 0,3 kopii/ml, co wspiera badania nad dynamiką wirusa i odpowiedzią na leczenie.

Amplifikacja i ilościowe oznaczanie RNA HIV-1 u osób zakażonych wirusem HIV z wiremią poniżej granicy wykrywalności za pomocą standardowych testów klinicznych (Wideo) | JoVE Journal

Amplifikacja i kwantyfikacja RNA HIV-1 u osób zakażonych HIV z ładunkiem wirusowym poniżej granicy wykrywalności standardowych testów klinicznych

Przeglądaj więcej filmów