Name: Podawanie środków terapeutycznych przez wstrzyknięcie domózgowo-komorowe (ICV) i dożylne (IV) u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Naucz się technik wstrzyknięć domózgowo-komorowych i dożylnych u myszy noworodkowych. Metody te umożliwiają precyzyjne podawanie środków terapeutycznych do układu nerwowego w badaniach nad rozwojem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Johnowi Marstonowi za ekspercką opiekę nad zwierzętami oraz dr. Marco A. Passiniemu za pomoc techniczną we wczesnych etapach projektu. Praca ta została sfinansowana z grantów National Institutes of Health przyznanych C.L.L. (R01NS41584; R01HD054413).

1. Iniekcja do komór mózgu
<ol>
<li>Pierwszym krokiem jest przygotowanie roztworów zapasowych do iniekcji; są to roztwory wektora wirusowego, plazmidowego DNA oraz leków, które należy wstrzykiwać w warunkach sterylnych.</li> 
<li>Wymieszać pożądany miano wektora wirusowego (łącznie 5-7 μL) z 0,05% w/v błękitem trypanowym w PBS w celu wizualizacji miejsca iniekcji.</li>
<li>Roztwór plazmidowego DNA (łącznie 5 μL) zawiera D-(+)-glukozę 20% (w/v) (1 μL), błękit trypanowy (0,05%) w PBS (1 μL), plazmid (˜5 μg/μL) (2 μL) oraz liniowy homopolimer PEI 2,5 kDa (150 mM) (1 μL).</li> 
<li>Unieruchomić noworodki w dniu PND 2 poprzez krioanestezję przez 1-2 minuty.</li>
<li>Igłą używaną do tej iniekcji jest wysterylizowana szklana mikropipeta z kalibracją mikrolitrową, przymocowana do strzykawki Hamilton 3 mL za pomocą długiej rurki.</li> 
<li>Odłamać końcówkę igły (za pomocą szpatułki), aby dostosować ją do penetracji czaszki na głębokość 2 mm. Umieścić igłę ukośnie w probówce do mikrocentryfugi zawierającej roztwór do iniekcji. Nabrać roztwór do igły, ostrożnie odciągając tłok strzykawki.</li>
<li>Po pobraniu roztworu oddzielić strzykawkę od probówki, odciągnąć tłok nieco wyżej, a następnie ponownie połączyć go z igłą.</li>
<li>Trzymać igłę w prawej ręce między kciukiem a palcem wskazującym, a strzykawkę umieścić między palcem środkowym a serdecznym tak, aby tłok dotykał wnętrza dłoni prawej ręki.</li>
<li>Mocno chwycić unieruchomioną mysz lewą ręką za skórę za głową i umieścić ją na świetle światłowodowym, aby oświetlić odpowiednie struktury anatomiczne, które mogą służyć jako punkty orientacyjne.</li>
<li>Wprowadzić igłę na głębokość 2 mm, prostopadle do powierzchni czaszki, w miejscu oddalonym o około 0,25 mm bocznie od szwu strzałkowego i 0,50–0,75 mm rostralnie od noworodkowego szwu wieńcowego (Ryc. 1A). Następnie, bardzo powoli i ostrożnie pchnąć tłok wnętrzem dłoni prawej ręki. Monitorować pod kątem pęknięcia naczyń lub obrzęku twarzy.</li>
<li>Wyjąć igłę 15 sekund po zaprzestaniu ruchu tłoka, aby zapobiec cofaniu się roztworu.</li>
<li>W celu rekonwalescencji trzymać myszy przez 5–10 minut w ogrzewanym pojemniku, aż do czasu powrotu ruchomości i ogólnej responsywności.</li>
</ol>
2. Iniekcja dożylna poprzez żyłę skroniową/twarzową
<ol>
<li>Roztwór do wstrzyknięcia należy przygotować i uzupełnić przefiltrowanym zielonym barwnikiem spożywczym w rozcieńczeniu 1:100, a następnie wstrzyknąć w warunkach sterylnych.</li>
<li>Do końca szklanej strzykawki Hamiltona o pojemności 100 μL przymocować mały plastikowy łącznik luer. Do łącznika luer przymocować igłę hipodermiczną o rozmiarze 33 gauge i długości 0,25 cala. Należy upewnić się, że wszystkie elementy są szczelnie połączone.</li> 
<li>Napełnić strzykawkę objętością do wstrzyknięcia, upewniając się, że w strzykawce nie ma powietrza, ponieważ wstrzyknięcie powietrza do naczynia jest śmiertelne. Często pomocne jest nanieienie pipetą objętości do wstrzyknięcia na kawałek parafilmu. Pozwala to na wyraźną wizualizację pobierania roztworu do strzykawki.</li>
<li>Do łatwej wizualizacji powierzchownej żyły skroniowej lub żyły twarzowej u noworodka stosuje się transluminator Wee Sight (rycina 2A). Przed wstrzyknięciem należy przymocować noworodka do transluminatora za pomocą taśmy chirurgicznej. Między noworodka a taśmę należy umieścić gazę, aby zapobiec uszkodzeniu skóry zwierzęcia przez taśmę. Zwierzę należy przymocować do transluminatora na boku, dbając o to, aby taśma nie utrudniała oddychania. Szyję noworodka należy delikatnie obrócić tak, aby żyła twarzowa była łatwo widoczna, a nos przykleić taśmą w celu stabilizacji głowy.</li>
<li>Używając powiększalnika na opasce o powiększeniu 2,25X w celu łatwiejszej wizualizacji, powoli wprowadzić igłę do żyły. Żyła jest bardzo powierzchowna, więc igła powinna pozostać widoczna pod skórą.</li>
<li>Powoli wprowadzić objętość roztworu do żyły. Zielony barwnik umożliwia łatwą wizualizację wstrzyknięcia.</li>
<li>Odczekać 15 sekund przed wyjęciem igły, ponieważ ze względu na ekstremalnie wąski światło igły występuje opóźnienie między pełnym wciśnięciem tłoka strzykawki a wypchnięciem pozostałego roztworu.</li>
<li>Po wyjęciu igły użyć gazy, aby wywrzeć ucisk w miejscu wstrzyknięcia, aż do ustąpienia krwawienia.</li>
<li>Monitorować noworodka pod kątem oznak stresu. Po prawidłowym wstrzyknięciu nie powinny być obserwowane żadne wyraźne oznaki stresu. Noworodkowi należy dać około 5 minut na regenerację przed powrotem do klatki.</li>
<li>Między wstrzyknięciami przemyć zestaw igła/strzykawka roztworem PBS, ponieważ krew w igle szybko ją zapcha ze względu na małe światło.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki:
Iniekcja ICV: Mózg można pobrać w różnych punktach czasowych po iniekcji i poddać wizualizacji, aby zademonstrować poprawność techniki wstrzykiwania. Jeśli do roztworu do iniekcji nie zostanie dodany barwnik, trudne będzie sprawdzenie precyzji podania. Prawidłowa iniekcja do jednego z komór pozwoli na rozprowadzenie błękitu trypanu po wstrzykniętej stronie mózgu około 10-15 minut po iniekcji (Rycina 1B). Jednolity rozkład błękitu trypanu w prawej i lewej półkuli mózgu oraz w opuszkach węchowych będzie widoczny około 60 minut po iniekcji (Rycina 1C). Wynika to z połączenia komór mózgu, co umożliwia rozprzestrzenienie się niebieskiego barwnika do sąsiedniej komory. Precyzyjne iniekcje można również zweryfikować poprzez rozproszenie niebieskiego barwnika w rostralnej części centralnego kanału rdzeniowego w ciągu około 12 godzin po iniekcji (Rycina 1D). Nieprawidłowe iniekcje można rozpoznać po braku niebieskiego zabarwienia w półkulach mózgu. W takim przypadku głębokość wprowadzenia igły była niewystarczająca i roztwór do iniekcji prawdopodobnie rozprzestrzenił się pod skórą. Inną możliwością jest zbyt głębokie wprowadzenie igły do mózgu, co spowodowało przejście poza komorę i wylanie roztworu pod komory mózgu.
Iniekcja dożylna (IV): Prawidłowe i efektywne wstrzyknięcie do żyły skroniowej/twarzowej można zwizualizować bezpośrednio po wykonaniu zabiegu. W miarę wstrzykiwania roztworu, zielony barwnik pozwala na obserwację wprowadzania i przepływu cieczy przez żyłę twarzową (Rycina 2A). Dodatkowo, po iniekcji zaobserwowana zostanie zmiana koloru skóry myszy. Naturalny różowy kolor noworodka zmienia się w zielony ze względu na obecność zielonego barwnika spożywczego w roztworze wstrzykiwanym (Rycina 2B). Stopień zaobserwowanej zmiany koloru noworodka na zielony zależy od zastosowanego stężenia barwnika. W celu prostej wizualizacji iniekcji oraz w okresie ćwiczeń zaleca się rozcieńczenie 1:50. Jednakże, gwałtowna zmiana koloru skóry często prowadzi do odrzucenia szczeniaka przez matkę, dlatego podczas procedur eksperymentalnych należy rozważyć rezygnację z barwnika lub znaczne zmniejszenie jego stężenia. Nieprawidłowa iniekcja spowoduje gromadzenie się zielonego barwnika pod skórą w miejscu wkłucia. Niepełna iniekcja, która występuje, gdy otwór igły nie jest całkowicie wprowadzony do żyły, objawia się przepływem części roztworu do żyły i gromadzeniem się pozostałej części pod skórą. W takim przypadku igłę należy wprowadzić głębiej do naczynia.
<img src="/files/ftp_upload/2968/2968fig1.jpg" alt="Schemat miejsc iniekcji w mózgu myszy; obrazy proceduralne 15 min, 60 min i 12 godzin po iniekcji." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Demonstracja pomyślnych iniekcji I.C.V. u myszy PDN2. A) Schemat miejsc iniekcji wykorzystanych podczas iniekcji I.C.V. do komór mózgu. B) Mózg szczenięcia po iniekcji I.C.V. błękitu trypanu w PBS do lewej komory, zdjęcie wykonane 15 minut po iniekcji. C) Mózg szczenięcia po iniekcji I.C.V. błękitu trypanu w PBS do lewej komory, zdjęcie wykonane 60 minut po iniekcji. D) Przednia część centralnego kanału kręgowego pokazana u szczenięcia po iniekcji I.C.V. błękitu trypanu w PBS do lewej komory, zdjęcie wykonane 12 godzin po iniekcji.
<img src="/files/ftp_upload/2968/2968fig2.jpg" alt="Schemat miejsca wstrzyknięcia oraz wynik laboratoryjny przedstawiające procedurę eksperymentalną na myszy, z wyszczególnieniem żył twarzy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Demonstracja prawidłowego wykonywania wstrzyknięć dożylnych u myszy PDN2. A) Schemat żyły twarzowej wykorzystywanej do iniekcji dożylnych. B) Szczenię z dożylnym wtryskiem zielonego barwnika w PBS w porównaniu z niewtryśniętym rówieśnikiem z tego samego miotu. Zdjęcie wykonane bezpośrednio po wtryśnięciu.

<ol><li>Blanchette, M., Fortin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+disruption+in+the+treatment+of+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier disruption in the treatment of brain tumors.</a> Methods Mol. Biol. 686, 447-463 (2011).</li>
<li>Foust, K. D., Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over+the+barrier+and+through+the+blood%3A+to+CNS+delivery+we+go%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Over the barrier and through the blood: to CNS delivery we go.</a> Cell Cycle. 24, 4017-4018 (2009).</li>
<li>Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cell+engraftment+corrects+lysosomal+storage+throughout+the+MPS+VII+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MPS VII mouse brain.</a> Nature. 374, 367-370 (1995).</li>
<li>Passini, M. A., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+gene+delivery+and+structure-specific+patterns+of+expression+in+the+brain+after+intraventricular+injections+of+neonatal+mice+with+an+adeno-associated+virus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Widespread gene delivery and structure-specific patterns of expression in the brain after intraventricular injections of neonatal mice with an adeno-associated virus vector.</a> J. Virol. 24, 12382-12392 (2001).</li>
<li>Kienstra, K. A., Freysdottir, D., Gonzales, N. M., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+neonatal+intravascular+injections%3A+modeling+newborn+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Murine neonatal intravascular injections: modeling newborn disease.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 46, 50-54 (2007).</li>
<li>Sands, M. S., Barker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Percutaneous+intravenous+injection+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Percutaneous intravenous injection in neonatal mice.</a> Lab. Anim. Sci. 49, 328-330 (1999).</li>
<li>Foust, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+the+spinal+muscular+atrophy+phenotype+in+a+mouse+model+by+early+postnatal+delivery+of+SMN%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rescue of the spinal muscular atrophy phenotype in a mouse model by early postnatal delivery of SMN.</a> Nat. Biotechnol. 28, 271-274 (2010).</li>
<li>Foust, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).</li>
<li>Passini, M. A., Watson, D. J., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+to+the+mouse+brain+with+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene delivery to the mouse brain with adeno-associated virus.</a> Methods Mol. Biol. 246, 225-236 (2004).</li>
<li>Coady, T. H., Lorson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-splicing-mediated+improvement+in+a+severe+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Trans-splicing-mediated improvement in a severe mouse model of spinal muscular atrophy.</a> J. Neurosci. 30, 126-130 (2010).</li>
<li>Baughan, T. D., Dickson, A., Osman, E. Y., Lorson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+bifunctional+RNAs+that+target+an+intronic+repressor+and+increase+SMN+levels+in+an+animal+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Delivery of bifunctional RNAs that target an intronic repressor and increase SMN levels in an animal model of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 18, 1600-1611 (2009).</li>
<li>Coady, T. H., Baughan, T. D., Shababi, M., Passini, M. A., Lorson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+single+vector+system+that+enhances+trans-splicing+of+SMN2+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of a single vector system that enhances trans-splicing of SMN2 transcripts.</a> PLoS One. 3, e3468-e3468 (2008).</li>
<li>Dickson, A., Osman, E., Lorson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negatively-Acting+Bifunctional+RNA+Increases+Survival+Motor+Neuron+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Negatively-Acting Bifunctional RNA Increases Survival Motor Neuron in vitro and in vivo.</a> Hum. Gene. Ther. 19, 1307-1315 Forthcoming.</li>
<li>Mattis, V. B., Ebert, A. D., Fosso, M. Y., Chang, C. W., Lorson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+a+read-through+inducing+compound%2C+TC007%2C+lessens+the+severity+of+a+spinal+muscular+atrophy+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Delivery of a read-through inducing compound, TC007, lessens the severity of a spinal muscular atrophy animal model.</a> Hum. Mol. Genet. 18, 3906-3913 (2009).</li>
<li>Williams, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-mediated+survival+of+motor+neuron+protein+expression+in+CNS+improves+phenotype+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-mediated survival of motor neuron protein expression in CNS improves phenotype in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> J. Neurosci. 29, 7633-7638 (2009).</li>
<li>Passini, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS-targeted+gene+therapy+improves+survival+and+motor+function+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> J. Clin. Invest. 120, 1253-1264 (2010).</li>
<li>Shababi, M., Glascock, J., Lorson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+SMN+Trans-Splicing+and+a+Neurotrophic+Factor+Increases+the+Life+Span+and+Body+Mass+in+a+Severe+Model+of+Spinal+Muscular+Atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene.+Ther%22%5BJournal%5D)">Combination of SMN Trans-Splicing and a Neurotrophic Factor Increases the Life Span and Body Mass in a Severe Model of Spinal Muscular Atrophy.</a> Hum. Gene. Ther. 22, 1-10 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Badania z wykorzystaniem mysich modeli chorób często wymagają podawania leków lub innych substancji noworodkom. W tym filmie prezentujemy krok po kroku procedury obejmujące dwie strategie iniekcji, które można zastosować w celu ukierunkowania na OUN: 1) bezpośrednią iniekcję do OUN z wykorzystaniem iniekcji dokomorowej (ICV) lub 2) iniekcję IV z wykorzystaniem żyły skroniowej/twarzowej. Czas wykonania tych iniekcji ma ogromne znaczenie. Ponieważ iniekcje ICV są wykonywane bez prowadnic, czaszka musi być stosunkowo plasty...

<table><tbody><tr><td>Zielony barwnik spożywczy</td><td>McCormick &amp;amp; Co.</td><td>n/a</td><td>Musi zostać przefiltrowany</td></tr><tr><td>Szklana strzykawka Hamiltona (100 &amp;mu;L)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20702</td><td></td></tr><tr><td>Nylonowy element białego gwintu LuerMxF</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>VPLF-LC78-1-25</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie igły podskórne</td><td>Popper &amp;amp; Sons, Inc.</td><td>7111</td><td>Rozmiar: 33(SWG) x &amp;#188;&quot; (6.35 MM)</td></tr><tr><td>Transiluminator Wee Sight</td><td>Respironics</td><td>1017920</td><td></td></tr><tr><td>Opaska z powiększeniem 2,25X</td><td>MagEyes</td><td>Model No. 5</td><td>Wybierz powiększenie zgodnie z indywidualnymi preferencjami</td></tr></tbody></table>

podawanie substancji terapeutycznych poprzez wstrzyknięcia dopłaczkowe (icv) i dożylne (iv) u myszy

Delivery of Therapeutic Agents Through Intracerebroventricular (ICV) and Intravenous (IV) Injection in Mice

Mimo ochronnej roli, jaką pełni bariera krew-mózg w osłanianiu mózgu, ogranicza ona dostęp do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), co najczęściej prowadzi do niepowodzeń w przypadku potencjalnych terapii opracowanych w celu leczenia schorzeń neurodegeneracyjnych 1,2. Choroby neurodegeneracyjne, takie jak rdzeniowy zanik mięśni (SMA), w których dotknięte są dolne motoneurony, mogą przynieść znaczne korzyści dzięki wprowadzeniu środków terapeutycznych do OUN. Celem niniejszego filmu jest zaprezentowanie dwóch różnych schematów iniekcji w celu dostarczenia materiałów terapeutycznych do noworodkowych myszy wkrótce po urodzeniu. Jedną z tych metod jest wstrzykiwanie bezpośrednio do bocznych komór mózgowia (dojamaszkowo), co skutkuje dostarczeniem materiałów do OUN poprzez płyn mózgowo-rdzeniowy 3,4. Drugą metodą jest iniekcja do żyły skroniowej (dożylnie), która pozwala na wprowadzenie różnych środków terapeutycznych do układu krwionośnego, prowadząc do dostarczenia systemowego, w tym do OUN 5. Szeroka transdukcja OUN jest możliwa do osiągnięcia przy zastosowaniu odpowiedniego wektora wirusowego i serotypu wirusa. Wizualizacja i wykorzystanie żyły skroniowej do iniekcji jest wykonalne do 6. dnia po urodzeniu. Jednakże, jeśli dostarczany materiał ma dotrzeć do OUN, iniekcje te powinny odbyć się w czasie, gdy bariera krew-mózg jest bardziej przepuszczalna ze względu na jej niedojrzałość, najlepiej przed 2. dniem po urodzeniu. W pełni rozwinięta bariera krew-mózg znacznie ogranicza skuteczność dostarczania dożylnego. Oba systemy dostarczania są proste i skuteczne po osiągnięciu odpowiedniej sprawności chirurgicznej. Nie wymagają one żadnych rozbudowanych urządzeń chirurgicznych i mogą być wykonane przez jedną osobę. Niemniej jednak techniki te nie są pozbawione trudności. Mały rozmiar szczeniąt w 2. dniu po urodzeniu i wynikające z tego małe obszary docelowe mogą sprawić, że iniekcje będą trudne do wykonania i początkowo trudne do powtórzenia.

W niniejszym artykule zaprezentowano dwie bardzo różne metody iniekcji: 1) do mózgu (do komór mózgu) oraz 2) systemową (dożylną), w celu wprowadzenia czynników terapeutycznych do ośrodkowego układu nerwowego noworodków myszy.

Podawanie substancji terapeutycznych poprzez wstrzyknięcia dopłaczkowe (ICV) i dożylne (IV) u myszy

Mimo ochronnej roli, jaką pełni bariera krew-mózg w zabezpieczaniu mózgu, ogranicza ona dostęp do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), co w większości...

W tym filmie zostaną zaprezentowane metody wstrzykiwania dokomorowego i dożylnego u noworodków myszy. W przypadku wstrzykiwania dokomorowego znieczuloną mysz umieszcza się najpierw na źródle światła światłowodowego w celu oświetlenia zatoki strzałkowej i zatok poprzecznych. Następnie inokulum jest ostrożnie wstrzykiwane w punkcie bocznym względem szwu strzałkowego i rostralnie względem szwu wieńcowego.Przy prawidłowym wykonaniu inokulum zostanie rozprowadzone najpierw w wstrzykniętej komorze, a następnie dotrze do drugiej komory w celu podania dożylnego. Myszy zabezpiecza się na transluminatorze w taki sposób, aby żyła twarzowa była odsłonięta. Następnie inokulum powoli wstrzykuje się bezpośrednio do żyły, co pozwala na jego systemiczne rozprowadzenie.Znaczenie tych technik wykracza poza ramy badawcze i obejmuje terapię wielu chorób oraz zaburzeń, ponieważ umożliwiają one optymalne podanie środków terapeutycznych. Technika ICV zapewnia sposób na pokonanie bariery krew-mózg, natomiast technika IV pozwala na systemiczne dostarczenie terapeutyków. W pierwszej kolejności należy przygotować roztwór do iniekcji w probówce do mikrocentryfugi.W niniejszym przykładzie szczepionki zawierają barwnik triam blue w celu lepszej wizualizacji miejsca wstrzyknięcia. Do iniekcji u myszy należy użyć wysterylizowanej i skalibrowanej szklanej igły mikropipety przymocowanej do zestawu plastikowych rurek o stopniowo zwiększającej się średnicy, zakończonych plastikową strzykawką o pojemności trzech mililitrów. Za pomocą pęsety o płaskich końcach należy odłamać czubek szklanej igły tak, aby jej długość wynosiła trzy milimetry.Pozwoli to na penetrację mózgu na głębokość co najmniej dwóch milimetrów. Ostrożnie nabierz roztwór do wstrzyknięcia do szklanej igły mikropipety, umieszczając ją ukośnie w probówce do mikrocentryfugi i pociągając tłok strzykawki. Przestań pociągać tłok natychmiast po zakończeniu napełniania igły.Aby uniknąć zanieczyszczenia przewodów, należy wyjąć strzykawkę z układu przewodów przymocowanego do szklanej mikropipety. Całkowicie wysuń tłok i ponownie mocno przymocuj igłę. Przytrzymaj szklaną igłę mikropipety kciukiem i palcem wskazującym.Umieść strzykawkę między palcem serdecznym a małym, tak aby tłok dotykał dłoni ręki wykonującej wstrzyknięcie, i przeprowadź krioanestezję dwudniowej myszy. Następnie mocno chwyć krioanestetyzowaną mysz za skórę u podstawy głowy i umieść ją na źródle światła światłowodowego, aby oświetlić zatokę strzałkową górną oraz zatoki przenoszące. Miejsce wstrzyknięcia znajduje się około ćwierć milimetra bocznie po każdej stronie zbiegu tych zatok, przy zachowaniu prostopadłego ustawienia strzykawki względem powierzchni czaszki.Wprowadź igłę, penetrując tkankę na głębokość dwóch milimetrów. Dociskając dłonią ręki wykonującej iniekcję, powoli przesuń tłok w dół, aby wstrzyknąć roztwór. Odczekaj 15 sekund przed wyjęciem igły, aby zapobiec cofaniu się płynu, i monitoruj mysz pod kątem obrzęku czaszki lub oznak przerwania naczyń.Po wstrzyknięciu preparatu mysz należy umieścić w wcześniej ogrzanym pojemniku na 5 do 10 minut, aby mogła dojść do siebie. Następnie należy porównać wstrzykniętą mysz z myszą niewstrzykniętą. Procedurę tę wykonuje się od 10 do 15 minut po wewnątrzkomorowym wstrzyknięciu inokulum zawierającego triam blue.Płyn powinien rozprowadzić się w wstrzykniętej części mózgu po 60 minutach dzięki połączeniu komór mózgu; widoczna powinna być jednolita dystrybucja błękitu triam w obu półkulach mózgu oraz w cebulkach węchowych. Ostatecznie, po 12 godzinach, inokulum będzie widoczne w przedniej części centralnego kanału rdzeniowego. Przygotować roztwór do wstrzyknięcia i dodać zielony barwnik spożywczy w rozcieńczeniu 1:100.Aby zwizualizować wtryskiwanie, przymocuj małą plastikową przynętę do końcówki szklanej strzykawki Hamiltona o pojemności 100 µL. Wyposaż strzykawkę w igłę hipodermiczną 33G o długości 0,25 cala i upewnij się, że wszystkie elementy są bezpiecznie połączone. Napełnij strzykawkę objętością przeznaczoną do wstrzyknięcia.Należy upewnić się, że z inokulum usunięto wszystkie pęcherzyki powietrza, ponieważ wstrzyknięcie powietrza dożylnie jest śmiertelne. Do przymocowania noworodka do transluminatora należy użyć plastra chirurgicznego i gazy. W pierwszej kolejności należy przymocować przedramię i ciało do transluminatora, a następnie zabezpieczyć głowę tak, aby żyła twarzowa była widoczna.Upewnij się, że taśma jest na tyle luźna, aby zwierzę mogło nadal oddychać. Korzystając z lupy Headman o powiększeniu 2,25x w celu lepszej wizualizacji, powoli wprowadź igłę do żyły. Ze względu na to, że żyła jest powierzchowna, igła pozostanie widoczna pod skórą.Powoli wstrzyknij inokulum do żyły. Przed wyjęciem igły odczekaj 15 sekund, aby umożliwić całkowite wypłukanie płynu. Po wyjęciu igły użyj gazy, aby uciskać miejsce wstrzyknięcia do czasu zatrzymania krwawienia.Przenieś noworodka w ciepłe miejsce i odczekaj pięć minut, aby mógł dojść do siebie. Monitoruj go pod kątem objawów stresu. Jeśli zastrzyk został wykonany prawidłowo, zwierzę nie powinno wykazywać oznak dyskomfortu.Gdy mysz odzyska przytomność, należy przenieść ją z powrotem do klatki. Jeśli wtryskiwanie dożylne zostało wykonane prawidłowo, noworodek przybierze zielony kolor. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać odpowiednią wiedzę na temat sposobu podawania iniekcji ICV i IV u noworodków myszy.Techniki te mogą być stosowane jako sposób podawania wybranego przez Państwa środka terapeutycznego.

delivery-therapeutic-agents-through-intracerebroventricular-icv

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wprowadzenie substancji terapeutycznych drogą wstrzyknięcia dokomorowego (ICV) i dożylnej (IV) u myszy

Ten film pokazuje wstrzyknięcie domózgowo-komorowe za pośrednictwem ommaya na modelu mysim. Metoda umożliwia miejscowe dostarczanie potencjalnych kandydatów na leki i omija barierę krew-mózg.

Wstrzyknięcie do komory mózgowej u myszy: metoda bezpośredniego podawania leków za pośrednictwem firmy Ommaya w celu dostarczania leków do komór mózgowych mózgu myszy

W tym filmie opisujemy metodę wszczepienia cewnika do żyły szyjnej modelu myszy, przez który eksperymentalne środki, takie jak leki i barwniki znacznikowe, mogą być dostarczane dożylnie in vivo. Taki układ po połączeniu z innymi systemami może być również wykorzystywany do monitorowania hemodynamiki i pobierania krwi.

Dożylne wstrzykiwanie środków eksperymentalnych za pomocą cewnika: technika dostarczania środków eksperymentalnych dożylnie przez żyłę szyjną w modelu mysim

Źródło: Li, D., et al. Bezpośrednie wstrzyknięcie dooponowe rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusami u dorosłych myszy. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę dokanałowego wstrzykiwania wirusów związanych z adenowirusem (AAV) do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) obudzonej myszy, obejmującą przygotowanie strzykawki, wyrównanie kręgosłupa i precyzyjne wprowadzenie igły. Metoda ta weryfikuje celowane dostarczanie genów, potwierdzając jej potencjał w terapiach OUN.

Dokanałowe podawanie wirusów w modelu mysim w leczeniu chorób ośrodkowego układu nerwowego

Zwierzęce modele chorób dziecięcych mogą doświadczyć wczesnego początku i agresywnego postępu choroby. Klinicznie istotne podanie terapii młodym modelom myszy może być technicznie trudne. Protokół ten opisuje nieinwazyjną metodę wstrzykiwań dożylnych dla nowonarodzonych myszy w ciągu pierwszych dwóch dni życia po urodzeniu.

Wstrzyknięcia dożylne u nowonarodzonych myszy

Tutaj opisujemy prostą metodę domózgowego i wewnątrznaczyniowego wstrzykiwania cząsteczek wirusa lub fluorescencyjnych mikrogranulek do mózgu noworodka myszy. Wzorzec lokalizacji wirusa i nanocząstek można wykryć za pomocą oceny mikroskopowej lub hybrydyzacji in situ.

Domózgowo-komorowe i wewnątrznaczyniowe wstrzykiwanie cząstek wirusowych i mikrogranulek fluorescencyjnych do mózgu noworodka

Zgłaszana jest metoda dostarczania nerwowych komórek macierzystych, przystosowanych do wstrzykiwania roztworów lub zawiesin, przez wspólną tętnicę szyjną (mysz) lub tętnicę szyjną zewnętrzną (szczur) po udarze niedokrwiennym. Wstrzyknięte komórki są szeroko rozmieszczone w miąższu mózgu i można je wykryć do 30 dni po porodzie.

Dotętnicze dostarczanie nerwowych komórek macierzystych do mózgu szczura i myszy: zastosowanie do niedokrwienia mózgu

Tutaj opisane jest proste i szybkie podejście do wykonywania iniekcji domózgowo-komorowych u myszy metodą wolnej ręki (czyli bez urządzenia stereotaktycznego).

Iniekcje domózgowo-komorowe z wolnej ręki u myszy

Obecny protokół przedstawia instrukcje krok po kroku dotyczące wykonywania iniekcji dokanałowych u noworodków myszy w celu edycji genów i dostarczania leków.

Wstrzyknięcie dooponowe nowonarodzonej myszy w celu edycji genomu i dostarczania leków

Naprawa tętnicy wewnątrzszyjnej w modelu mysim po wstrzyknięciu przywraca przepływ krwi do tętnicy bez negatywnego wpływu na dystrybucję wstrzykniętego materiału. Naprawa miejsca wstrzyknięcia ułatwia kolejne wstrzyknięcia przez tę samą tętnicę i zapobiega niedokrwieniu mózgu u szczepów myszy, które nie mają pełnego koła Willisa.

Ułatwienie powtórnych iniekcji do tętnicy szyjnej w modelach mysich za pomocą nowatorskiej techniki naprawy miejsca wstrzyknięcia

Wstrzyknięcie dooponowe lędźwiowe stanowi translacyjnie istotną drogę podania dla dostarczania terapii genowej do ośrodkowego układu nerwowego. Ten kompleksowy, ustandaryzowany protokół wstrzyknięć dooponowych w odcinek lędźwiowy u noworodków, młodych i dorosłych myszy i szczurów ma na celu pomóc naukowcom w przyjęciu tej techniki do przedklinicznych badań nad terapią genową.

Lędźwiowe wstrzyknięcie dooponowe wektorów terapii genowej do celowania w ośrodkowy układ nerwowy u myszy i szczurów

Naucz się technik wstrzyknięć domózgowo-komorowych i dożylnych u myszy noworodkowych. Metody te umożliwiają precyzyjne podawanie środków terapeutycznych do układu nerwowego w badaniach nad rozwojem.

Podawanie substancji terapeutycznych poprzez wstrzyknięcia dopłaczkowe (ICV) i dożylne (IV) u myszy

Przeglądaj więcej filmów