Przygotowanie wysokiej jakości pirofosforanów inozytolu

Ogólnym celem niniejszej procedury jest otrzymanie i oczyszczenie wysokiej jakości pirofosforanu nool. Osiąga się to najpierw poprzez wykorzystanie IP six jako substratu dla kinazy IP six, enzymu generującego IP seven. Następnie produkty reakcji enzymatycznych nanosi się na żel poliamidowy, a prążek odpowiadający IP seven zostaje wycięty.

Następnie IP seven jest izolowany poprzez kolejne cykle odwodnienia i nawodnienia. Ostatnim krokiem procedury jest potwierdzenie czystości produktu oraz oznaczenie jego stężenia. W końcowym etapie można uzyskać wyniki wykazujące aktywność biologiczną IP seven poprzez jego inkubację.

W obecności jednej kinazy VIP oraz jednej fosfatazy DDP IP siedem, reakcje te generują odpowiednio IP osiem i IP sześć. Metoda ta może dostarczyć wglądu w sygnalizację IP siedem. Może być ona również zastosowana w innych układach, takich jak w przypadku fosforanów typu IP osiem lub IP pięć pochodzącego z PPIP cztery.

Niniejszy protokół rozpoczyna się od przygotowania reakcji enzymatycznych, w których kinaza IP6-1 lub VIP1 przekształca IP6 w izoformy piro-fosfo. Na potrzeby tej demonstracji enzymy IP6-kinaza 1 z tagiem histydynowym oraz VIP1 z tagiem GST zostały oczyszczone z E. coli zgodnie z wcześniej opisaną procedurą. W pierwszej kolejności należy przygotować od 10 do 20 niezależnych reakcji enzymatycznych zawierających IP6 oraz His-IP6-kinazę 1 lub GST-VIP1, zgodnie z opisem w protokole pisemnym.

Uzupełnij objętość do 50 µL wody dwukrotnie destylowanej milli Q. Po krótkim wirowaniu probówek inkubuj reakcje w temperaturze 37 °C przez noc w warunkach rotacji. Przygotuj aparat do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, używając szklanych płytek o długości 24 cm i szerokości 18 cm, odstępów o szerokości 1,5 mm oraz grzebienia 16-dołkowego.

Następnie wlej wcześniej przygotowany roztwór żelu pomiędzy odlane wcześniej szklane płytki, stosując objętość 50 mililitrów na żel. Włóż grzebień i pozostaw żel do polimeryzacji na 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej. Po spolimeryzowaniu żelu przenieś aparat do pomieszczenia chłodniczego.

Przeprowadź wstępną elektroforezę żelu w buforze TBE 1× przez około 30 do 60 minut przy napięciu od 200 do 300 V, stosując w międzyczasie barwnik Orange G 1×. Dla każdej reakcji przygotuj standardową próbkę kontrolną zawierającą 2 mol IP6. Po wstępnej elektroforezie dokładnie wypłucz każdą studzienkę buforem do elektroforezy.

Użyj strzykawki z igłą 21G, aby usunąć wszelkie osady. Następnie nanieś próbki na żel, pomijając dwie pierwsze i dwie ostatnie studzienki. Na koniec prowadź elektroforezę przez noc przy natężeniu 7 mA na żel, aż prążek pomarańczowego barwnika G znajdzie się w obrębie ostatnich 10 cm od dolnej krawędzi żelu.

Aby rozpocząć izolację IP seven, należy rozmontować aparat do elektroforezy i ostrożnie wyjąć jedną płytkę szklaną, pozostawiając żel na drugiej. Wyciąć niewielki fragment żelu od obszaru tuż powyżej pomarańczowego prążka GD do samego dołu, obejmując standard IP six oraz jedną ścieżkę z próbką. Wyciętą część żelu należy barwić błękitem toluidynowym przez kilka minut, aż pojawi się prążek Anatol Pyrophosphate.

W międzyczasie należy ponownie położyć wcześniej zdjętą szklaną płytkę na wierzchu żelu, aby zapobiec wysychaniu niebarwionej części żelu. Przenieś zabarwioną część żelu do roztworu odbarwiającego DES na kilka minut, aby wypłukać nadmiar błękitu toluidyny, a następnie ponownie umieść żel razem z niebarwioną częścią. Prążek IP seven powinien być widoczny, ponieważ wędruje nieco wolniej niż standard IP six A TP, natomiast prążek, który wędruje szybciej niż IP six, również powinien być widoczny.

Następnie za pomocą żyletki wytnij prążek IP seven z niebarwionej części żelu. Wykorzystaj pozycję migracji IP seven określoną na żelu barwionym. Aby oszacować położenie prążka IP seven, umieść wycięty z żelu prążek IP seven w probówce o pojemności 15 milliliter i dodaj 10 milliliters wody podwójnie destylowanej milli Q.

Po inkubacji obracaj probówki przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie usuń ciecz poprzez odlanie, aby pozbyć się nadmiaru buforu TBE oraz mikroskopijnych cząsteczek akryloamidu. Następnie przeprowadź dwa cykle dehydratacji i rehydratacji, dodając najpierw pięć mililitrów 50% metanolu do probówki zawierającej żel IP seven. Obracaj próbkę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Następnie przenieś wycinek żelu do nowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml podwójnie destylowanej wody Milli-Q i inkubuj w rotatorze w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Zachowaj probówkę z metanolem do dalszego użytku po inkubacji. Powtórz cykl dehydratacji i rehydratacji jeszcze raz, aby skoncentrować elowany IP7.

Połącz wcześniej dodane 5 mL wody i 5 mL 50% metanolu. Odparuj połączony roztwór za pomocą wirówki odparowującej (speed vac) w temperaturze 60 °C. Gdy próbki będą prawie suche, przelej pozostałą ciecz do probówki do wirowania o pojemności 1,5 mL.

Wiruj probówkę przez dwie minuty przy 5, 000 obr./min. Zbierz nadsącz (SUP), pozostawiając dolne 20 do 30 µL, ponieważ mogą one zawierać cząsteczki akryloamidu. Przenieś próbkę do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1.5 ml.

W razie potrzeby kontynuować proces suszenia przy użyciu niepodgrzewanej wirówki próżniowej (speed vac). Odzysk IP seven jest drastycznie ograniczony, jeśli próbki wyschną całkowicie. Dlatego konieczne jest przerwanie procesu suszenia, gdy objętość próbek osiągnie od 100 do 300 µL.

Po odzyskaniu wyizolowanego IP seven, nanieś od 2 do 5 µL próbki na żel PAGE w celu określenia jej stężenia i czystości. W charakterze standardów stężenia nanieś kilka rozcieńczeń IP six oraz marker białkowy 4 mol. Po przeprowadzeniu elektroforezy zwizualizuj początkowe izoformy pirofosforanu poprzez barwienie i odbarwianie całego żelu roztworem błękitu toluidyny.

Zgodnie z opisaną wcześniej procedurą po barwieniu toluidyną, stężenia można określić poprzez skanowanie żelu i porównanie różnic w intensywności między IP6 a IP7. Przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak Image J, preparatywną konwersję enzymatyczną IP6 do IP7 przy użyciu enzymów IP6 kinase 1 i VIP1 można łatwo rozstrzygnąć za pomocą analizy PAGE.

Załadowanie IP six jako kontroli wielkości wraz z barwieniem żelu błękitem toluidyny pozwala na identyfikację pochodnych pirofosforylowanych. Ze względu na to, że wędrują one wolniej, w zależności od liczby grup fosforanowych obecnych w substracie, opisana powyżej procedura pozwoliła na łatwe oczyszczenie IP seven. Ponadto analiza oczyszczonego pirofosforanu anatolu za pomocą PAGE potwierdziła czystość IP seven.

Co ciekawe, izomer 1,3-pirofosforanowy IP5 produktu IP7 powstającego w reakcji z VIP1 migruje nieco wolniej niż izomer 5-pirofosforanowy IP5 z IP7 generowanego przez IP6 kinazę 1. Zastosowanie standardów IP6 umożliwia łatwą kwantyfikację stężenia oczyszczonego IP7 przed jego wykorzystaniem w dalszych eksperymentach, w których można ocenić jego aktywność biologiczną.

Pirofosforan IP five inkubuje się rutynowo z FIP one oraz z fosfatazą IP seven DDP one. Oczyszczony IP seven jest przekształcany w IP eight przez VIP one oraz w IP six przez DDP one. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak przedłużone barwienie toliną w błękicie, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące izolacji IP eight lub innych fosforylowanych izoform in.