Kwantyfikacja upośledzenia funkcji poznawczych spowodowanego radioterapią czaszki

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie zmian behawioralnych i poznawczych wywołanych napromieniowaniem czaszki. Pierwszym krokiem jest zbadanie pamięci rozpoznawania przestrzennego opartej na hipokampie z wykorzystaniem testu rozpoznawania nowych miejsc. Następnie ocenia się poziom lęku za pomocą testu labiryntu wzniesionego krzyża, formowanie pamięci lękowej przy użyciu testu kontekstowego warunkowania lękowego zależnego od hipokampa i ciała migdałowatego, a następnie mierzy się zależne od ciała migdałowatego warunkowanie lękowe sygnałowe.

Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie testu w labiryncie wodnym Morrisa w celu oceny uczenia się przestrzennego, pamięci przestrzennej oraz zdolności do uczenia się odwróconego. Ostatecznie protokół ten pozwala wykryć zmiany w nastroju, uczeniu się i pamięci przestrzennym oraz nieprzestrzennych, a także wszelkie zaburzenia sensoryczno-motoryczne wywołane napromieniowaniem czaszki. Metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat wpływu napromieniowania czaszki na zachowanie i funkcje poznawcze.

Metodę tę można zastosować również w innych sytuacjach, w których funkcje poznawcze są upośledzone jako niepożądany skutek uboczny innej terapii, na przykład w przypadku tzw. chemo brain lub zaburzeń uczenia się i pamięci wywołanych chemioterapią. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności ze względu na czasochłonny proces przygotowania i optymalizacji sprzętu. Interpretacja wyników może być utrudniona, jeśli procedury eksperymentalne nie są ściśle kontrolowane, a zmienność danych może utrudniać wykrycie różnic między grupą kontrolną a eksperymentalną.

Wizualna demonstracja tych metodologii jest kluczowa, aby czytelnik mógł docenić subtelności związane z organizacją pomieszczeń eksperymentalnych, w których przeprowadzane są testy poznawcze, a także specyfikę stosowanych procedur. Aby zapewnić spójność w obchodzeniu się ze zwierzętami, należy rozpocząć fazę oswajania od dokładnego przygotowania środowiska testowego: należy oczyścić dwa identyczne plastikowe bloki 70% ethanol i umieścić je w określonych pozycjach w obrębie areny. Następnie należy umieścić zwierzę w centrum areny i pozwolić mu na swobodną eksplorację.

Przez pięć minut oceniane są zachowania eksploracyjne. Przy użyciu zautomatyzowanego systemu śledzenia eksplorację definiuje się jako sytuację, w której nos zwierzęcia znajduje się w promieniu czterech centymetrów od bloków i jest skierowany w ich stronę. Po upływie czasu zwierzę należy przenieść do klatki holdingowej na kolejne pięć minut.

W tym czasie należy oczyścić arenę testową 70% etanolem. Umieść jeden identyczny zestaw bloków w tej samej pozycji przestrzennej co podczas fazy familiarizacji, a drugi w nowej pozycji przestrzennej. Po pięciominutowym odstępie czasowym ponownie wprowadź zwierzę na arenę testową na pięciominutową fazę testową i pozwól mu na swobodną eksplorację przez trzy minuty.

Jeśli szczur zapamięta układ przestrzenny bloków z fazy zapoznawczej, poświęci więcej czasu na eksplorację bloku znajdującego się w nowym miejscu. Następnego dnia zwierzęta są ponownie umieszczane w arenie. W fazie testowej po 24 godzinach jeden blok ponownie pozostaje w znanej pozycji, podczas gdy drugi znajduje się w nowym miejscu.

Po pierwsze, umieść zwierzę w centrum areny i rejestruj eksplorację przez trzy minuty. Podwyższony krzyżowy labirynt służy do pomiaru poziomu lęku u gryzoni. Przed przeprowadzeniem testu upewnij się, że labirynt został dokładnie wyczyszczony.

Na początek umieść zwierzę w środkowej części labiryntu, przodem do otwartego ramienia i tyłem do eksperymentatora, a następnie pozwól zwierzęciu na eksplorację przez pięć minut. Liczba wejść oraz czas spędzony w ramionach otwartych i zamkniętych są rejestrowane za pomocą automatycznego oprogramowania do śledzenia. Jeśli szczur spadnie z labiryntu, szybko umieść go z powrotem w ramieniu otwartym i odnotuj to zdarzenie.

Należy również odnotować wszelkie przejawy zamierania oraz ich możliwe przyczyny. Warunkowanie lękowe jest paradygmatem behawioralnym, w którym zwierzęta uczą się lękać bodźca, który wcześniej był obojętny. Po sparowaniu go z bodźcem awersyjnym w pierwszym dniu, umieść zwierzę w dokładnie oczyszczonej komorze.

Rozpocznij próbę treningową, która składa się z trzech faz. Pierwszą jest pięciominutowa faza bazowa, podczas której nie podaje się wstrząsów ani sygnałów dźwiękowych; następnie, w fazie treningu, w ciągu pięciu minut prezentowanych jest wielokrotne zestawienie sygnału dźwiękowego ze wstrząsem. Na koniec, w fazie po treningu, zwierzę otrzymuje kolejne pięć minut.

W przypadku braku wstrząsu lub sygnału dźwiękowego pomiar procentu czasu, w którym każde zwierzę pozostaje w bezruchu (freezing), przeprowadza się w ciągu ostatnich 60 sekund fazy bazowej oraz ostatnich 60 sekund fazy po treningu. Po 24 godzinach należy ponownie umieścić zwierzę w komorze w celu przeprowadzenia pięciominutowego testu kontekstowego i zapisać procent czasu spędzony w bezruchu godzinę po teście. W znanym kontekście należy usunąć kratowaną podłogę, dodać panele na zewnątrz komory i wyczyścić ją pachnącym detergentem domowym.

Aby przetestować warunkowanie lękowe z sygnałem, umieść zwierzę w nowym kontekście i zarejestruj zachowanie zamarcia (freezing) w obecności i przy braku tonu, który został wcześniej powiązany z bodźcem awersyjnym. Labirynt wodny Morrisa jest testem uczenia się przestrzennego, który wymaga wykorzystania wskazówek dystalnych do zlokalizowania zanurzonej platformy ucieczkowej w dużym basenie z nieprzezroczystą wodą; zadanie jest przeprowadzane przez osiem dni i składa się z czterech faz: testu wskazówek oraz fazy nabywania. Faza ta obejmuje 24-godzinny test badawczy (probe test) oraz test uczenia się odwrócenia.

Aby rozpocząć zaplanowany test, umieść wyraźną czarno-białą flagę na środku platformy, tak aby miejsce ucieczki było dla zwierzęcia oczywiste. W każdej próbie testu CUD umieść zwierzę w innym, wcześniej określonym punkcie startowym na obwodzie basenu i przesuń platformę do innego kwadrantu. W każdej z czterech prób daj zwierzęciu 30 sekund na znalezienie platformy ucieczkowej.

Jeśli zostanie osiągnięty maksymalny czas, przeprowadź zwierzęta tam ręcznie. Pozostaw zwierzę na platformie przez 20 sekund przed umieszczeniem go w ogrzewanej klatce. Następnego dnia rozpocznij fazę nabywania, składającą się z czterech prób dziennie przez pięć kolejnych dni.

W tej fazie ukryta platforma pozostaje w tym samym miejscu, a zwierzęta uczą się nawigować do niej. Wykorzystując dystalne wskazówki wizualne w pomieszczeniu, umieść zwierzę w basenie w innym, wcześniej określonym punkcie startowym. Dla każdej próby zarejestruj średni czas dotarcia do platformy oraz długość przebytej ścieżki jako miary uczenia się przestrzennego.

Jeśli zwierzę nie dotrze do platformy w maksymalnym czasie pływania wynoszącym 60 sekund, należy poprowadzić je do niej ręcznie i pozwolić mu pozostać na niej przez 20 sekund. 24 godziny po ostatniej próbie treningowej należy przeprowadzić próbę sondującą, podczas której platforma zostaje usunięta, aby określić preferencję zwierzęcia co do kwadrantu, w którym wcześniej znajdowała się platforma. Po tej próbie sondującej należy przywrócić platformę do tego samego kwadrantu i przeprowadzić trzy dodatkowe próby nabywania w ramach testu uczenia odwróconego (Reversal Learning).

Ósmego dnia przenieś platformę w nowe miejsce. Umieść zwierzę w basenie i zmierz czas spędzony na poszukiwaniu platformy w jej poprzedniej lokalizacji w porównaniu do nowej lokalizacji. Wyniki uzyskane dla zwierząt kontrolnych i napromieniowanych w zadaniu rozpoznawania nowego miejsca (Novel Place Recognition Task) wykazały, że obie pozycje były eksplorowane w równym stopniu podczas fazy zapoznawczej.

Jednakże zwierzęta kontrolne wykazały wyraźną preferencję dla nowej pozycji przestrzennej po pięciominutowym i 24-godzinnym odstępie czasu, podczas gdy zwierzęta napromieniowane tego nie zrobiły. W labiryncie krzyżowym zwierzęta kontrolne i napromieniowane spędzały mniej czasu na eksploracji otwartych ramion, niż wynikałoby to z przypadku. Procent zamarcia podczas pierwszej ekspozycji na komorę był bardzo niski w porównaniu z okresem po treningu w następnym dniu.

Zachowanie zamierania nadal było zwiększone w znanym kontekście, choć w znacznie mniejszym stopniu u zwierząt napromieniowanych; po umieszczeniu w nowym kontekście zachowanie zamierania powróciło do poziomów bazowych, lecz ponownie wzrosło po prezentacji sygnału dźwiękowego w labiryncie wodnym Morrisa. Zwierzęta z grupy kontrolnej odnajdywały platformę ucieczkową szybciej w kolejnych próbach w porównaniu do zwierząt napromieniowanych. Zwierzęta napromieniowane potrzebowały również więcej czasu i pokonywały dłuższą drogę do platformy w próbie sondującej, 24 godziny później podczas testu uczenia odwróconego (Reversal Learning Test), w którym lokalizacja platformy zostaje zmieniona; zwierzęta zdrowe stopniowo przestają przeszukiwać stary kwadrant i uczą się nowej lokalizacji platformy, podczas gdy zwierzęta napromieniowane tego nie robią.

Podczas wykonywania tych zadań ważne jest sporządzanie szczegółowych notatek dotyczących wszelkich nieprawidłowych zdarzeń lub zachowań, a także wszelkich problemów z monitorowaniem, które wystąpią i będą wymagały rozwiązania przed analizą danych. Należy pamiętać, że praca ze zwierzętami doświadczalnymi może być niebezpieczna, dlatego podczas przeprowadzania tych procedur zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak użycie osobistego sprzętu ochronnego. Kluczowe jest również uzyskanie zgody instytucjonalnej oraz przestrzeganie wytycznych instytucjonalnych i federalnych dotyczących bezpiecznego i etycznego wykorzystania zwierząt.