Indukowanie tworzenia się skrzepów krwi w mózgu myszy za pomocą światłoczułego barwnika

Weźmy znieczuloną mysz z oknem czaszkowym z cienką warstwą czaszki, aby umożliwić wizualizację mózgu przy minimalnej inwazyjności.

Pod mikroskopem zidentyfikuj tętnicę na podstawie przepływu krwi z większych do mniejszych naczyń.

Wstrzyknij światłoczuły barwnik do żyły ogonowej, która dociera do mózgu poprzez krążenie.

Wzbudz barwnik światłem, aby wyemitować fluorescencję, umożliwiając monitorowanie przepływu krwi.

Zwiększ natężenie światła, aby wywołać tworzenie się skrzepów, znane jako zakrzepica.

Barwnik pochłania światło o dużej intensywności, reaguje z tlenem i wytwarza reaktywne formy tlenu, które uszkadzają komórki śródbłonka.

Uszkodzone komórki uwalniają mediatory, które powodują przyleganie płytek krwi, inicjując tworzenie się skrzepów. Fibryna we krwi pomaga uwięzić dodatkowe komórki krwi, tworząc skrzep

Skrzep, wykryty przez nagromadzenie poprzedzającego go barwnika, utrudnia przepływ krwi do mózgu.

Zamknij nacięcie, zastosuj antybiotyki, aby zapobiec infekcji i podaj leki przeciwbólowe, aby zmniejszyć ból i umożliwić powrót do zdrowia.

Po ustawieniu myszy pod mikroskopem przygotuj świeżą różę bengalską w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym w ilości 20 miligramów na mililitr. Przefiltruj, wysterylizuj mieszaninę i wyrzuć ją po zakończeniu eksperymentu. Musi być zawsze używany na świeżo.

Teraz, skanując okno czaszki za pomocą lasera o długości fali 561 nanometrów, wstrzyknij 0,1 mieszaniny przez żyłę ogonową. W ciągu 5 sekund barwnik powinien być łatwo widoczny w unaczynieniu czaszki. Po wstrzyknięciu wystarczającej ilości barwnika wybierz naczynie o wielkości od 40 do 80 mikronów do zakrzepicy. Tętnice można odróżnić od żył na podstawie przepływu większych do mniejszych naczyń i odwrotnie.

Teraz przygotuj się do laserowego naczynia na żądanie. Wydłuż czas przebywania do tego, co jest odpowiednie dla używanego systemu. Zwiększ moc lasera do 100% i ustaw kolekcję obrazów na jedną klatkę na sekundę z maksymalną prędkością skanowania. Skanuj mysz, aż utworzy się skrzep zszywki. Zwykle zajmuje to około pięciu minut. Idealnie byłoby, gdyby skanowano tylko jedno pole widzenia, aby utworzyć skrzep. Wybierz odpowiedni cel. Jeśli nie tworzy się skrzep, spróbuj użyć większej ilości barwnika.

Po utworzeniu się skrzepu usuń mysz z obszaru obrazowania i przygotuj się do zakończenia operacji pod mikroskopem preparacyjnym. Najpierw ostrożnie zdejmij pierścień, sprawdzając, czy nie ma krwawienia. Jeśli wystąpi jakiekolwiek krwawienie, eksperyment musi zostać przerwany.

Następnie za pomocą szwu 6-0 zamknij nacięcie. Następnie nałóż antybiotyk na linię nacięcia. W celu złagodzenia bólu należy podawać podskórne wstrzyknięcia buprenexu przez trzy dni. Po podaniu pierwszego wstrzyknięcia buprenexu należy umieścić mysz w komorze rekonwalescencji i monitorować ją do momentu rozpoczęcia chodzenia. Następnie włóż go z powrotem do domowej klatki, którą należy wyczyścić. Obrazowanie podłużne jest szczegółowo opisane w protokole tekstowym.