Protokoły inokulacji dopochwowej i pobierania próbek w eksperymentalnym mysim modelu zapalenia pochwy wywołanego przez Candida
8 grudnia 2011
Opisano kluczowe techniki do oceny zapalenia pochwy wywołane przez Candida w eksperymentalnym modelu zwierzęcym. Metody te pozwolą na szybkie pobranie wycinków z pochwy i limfocytów z drenujących węzłów chłonnych lędźwiowych. Techniki te mogą dać początek mysim modelom innych chorób w dolnych drogach rodnych kobiet.
Ogólnym celem tej procedury jest wykazanie konkretnych problemów proceduralnych związanych z wykorzystaniem eksperymentalnego modelu zwierzęcego kandydozy pochwy jako środka do ilościowego określenia obciążenia grzybicą pochwy, a także wykorzystanie komórek pochwy lub limfoidalnych w specyficznych testach, takich jak testy immunologiczne i histologiczne. Zostanie to osiągnięte poprzez najpierw zademonstrowanie techniki inokulacji dopochwowej na myszach leczonych estrogenem. Następnie, po eutanazji myszy, zostanie wykonane płukanie pochwy w celu odzyskania candidy.
Następnie zostanie usunięta tkanka pochwy i/lub węzły chłonne drenujące pochwę. Płyn lawiczny można oglądać pod mikroskopem, aby pokazać candida związaną z komórkami nabłonka pochwy lub posiewać na agarze w celu ilościowego określenia obciążenia grzybicą pochwy. Rozmaz frakcji komórkowej może być również używany do barwienia komórek nabłonkowych i komórek limfoidalnych.
Tak więc główną zaletą demonstrowania tej techniki jest to, że użytkownicy zwierzęcego modelu zapalenia pochwy mogą to zrobić najbardziej wydajnie i skutecznie. Kluczowe pytania, na które można odpowiedzieć za pomocą tej techniki, dotyczą zapalenia pochwy i ekologii oraz odpowiadają na kluczowe pytania, takie jak odpowiedź immunologiczna gospodarza, dystrybucja komórkowa, skuteczność leków, skuteczność immunoterapeutyczna, a także efekty immunizacji i demonstracji techniki. Dzisiaj będę doktorantem w moim laboratorium, junco yano, aby zarazić mysz C albicans trzy dni po podaniu zastrzyku beta estradiolu.
Zacznij od ustabilizowania myszy na płaskiej powierzchni gRED, aby mogła się chwycić. Następnie przytrzymaj podstawę ogona dwoma palcami i unieś biodro do góry, tak aby otwór pochwy był skierowany w Twoją stronę. Włóż końcówkę pipety na głębokość około pięciu milimetrów do światła pochwy i odpipetuj do 20 mikrolitrów zawiesiny inokulum.
Wykonaj ten krok tak szybko i delikatnie, jak to możliwe, aby zminimalizować niepokój myszy. Po pożądanym okresie inkubacji poddaj zwierzę eutanazji zgodnie z protokołem obowiązującym w Twojej placówce. Następnie dwoma palcami przytrzymaj mysz w dół za podstawę ogona, tak aby otwór pochwy został odsłonięty za pomocą pipety.
Wprowadzić 100 mikrolitrów sterylnego PBS do światła pochwy i przy wielokrotnym zasysaniu i mieszaniu wykonać płukanie. Jeśli końcówka pipety zostanie zatkana komórkami, dozuj zatykające komórki i kontynuuj niszczenie pozostałym PBS. Zbierz płyn z płukania do mikroprobówki wirówkowej.
Po zabiegu płukania pochwy połóż mysz na plecach i nasącz obszar pachwiny 70% etanolem. Za pomocą kleszczy podnieś otwór moczowy do góry, tak aby otwór pochwy został odsłonięty. Włóż parę zakrzywionych kleszczyków do światła pochwy i zlokalizuj szyjkę macicy, utrzymując mocny chwyt kleszczykami.
Wyciągnij szyjkę macicy przez jamę pochwy, wytnij pochwę u podstawy otworu pochwy, a następnie usuń szyjkę macicy z pochwy nożyczkami chirurgicznymi. Ponieważ tkanka pochwy jest ewoluowana, odwróć ją, aby zachować pierwotną orientację lub otwórz ją w prześcieradło, wykonując boczne nacięcie w celu wycięcia węzła lędźwiowego ze zwierzęciem na grzbiecie. Nasycić brzuch 70% etanolem.
Wykonaj boczne nacięcie, zaczynając od dolnej części brzucha do klatki piersiowej i odsłoń narządy wewnętrzne za pomocą kleszczy w obu rękach. Przesuń jelita do góry, aby widoczne stały się centralne naczynia krwionośne. Zlokalizuj żyłę dolną cva i aortę brzuszną.
Para węzłów chłonnych lędźwiowych może być zidentyfikowana w sąsiedztwie aorty brzusznej położonej mniej więcej w połowie drogi między początkiem tętnicy nerkowej a tętnicy biodrowej wspólnej. Te węzły chłonne można wizualnie odróżnić od tkanki tłuszczowej dzięki ich elastycznej teksturze i są jaśniejsze i bardziej nieprzezroczyste w porównaniu z tkanką tłuszczową. Są one również zauważalnie większe u zakażonych zwierząt w porównaniu z niezaszczepionymi.
Zwierzęta wycinały węzły chłonne, umieszczając mikrokleszcze pod węzłem, a następnie delikatnie podciągały, aby oddzielić je od otaczającej tkanki. Po wycięciu tkanki przenieś węzły chłonne na sterylne sito z siatki drucianej umieszczone wewnątrz sterylnej szklanej szalki Petriego zawierającej około 10 mililitrów zbilansowanego roztworu soli Hanka. Aby wyizolować komórki limfoidalne, zapoznaj się z pisemnym protokołem.
Frakcje komórkowe płynu z płukania pochwy od myszy zaszczepionych co najmniej cztery dni wcześniej zazwyczaj składają się z komórek nabłonka Candida i nacieków komórkowych, jak pokazano tutaj za pomocą mikroskopii mokrej. Candida można rozpoznać po obecności PHA, a także drożdży. Tutaj preparaty rozmazowe płynu z płukania pochwy są barwione.
Wykorzystanie techniki rozmazu cytologicznego do badania komórek nabłonkowych i naciekających leukocytów, których głównymi komórkami są neutrofile, które można zidentyfikować za pomocą płatów traclear. Bardzo niewiele neutrofili, jeśli w ogóle, wykrywa się u niezaszczepionych myszy. Ten rysunek przedstawia przykład obciążenia grzybicą pochwy.
Płyn z płukania pochwy jest pobierany w określonych punktach czasowych i hodowany w celu oznaczenia CFU. W tym przykładzie płyn pobrano w piątym dniu po inokulacji, seryjnie, rozcieńczono na platerze i inkubowano przez 48 godzin. Kolonie są następnie liczone i obliczane obciążenie grzybicze pochwy Kolonizacja pochwy lub zakażenie Candida utrzymuje się przez tygodnie u myszy zaszczepionych estrogenem.
Podczas gdy Candida nie jest w stanie ustanowić kolonizacji pochwy u myszy zaszczepionych estrogenem, myszy niezaszczepione estrogenem pozostają ujemne dla Candida przez cały czas. Ponadto płukanie pochwy można wykonać jednorazowo na oddzielnych myszach w każdym punkcie czasowym lub podłużnie u tych samych myszy w znieczuleniu. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o bezpiecznym unieruchomieniu zwierząt, aby uniknąć urazu pochwy, i należy poświęcić czas niezbędny do dokładnego płukania, aby uzyskać dokładne obciążenie grzybicą pochwy podczas ekstrakcji tkanek pochwy.
Używaj nadal PBS, aby zapobiec ich odwodnieniu i uważaj, aby nie uszkodzić głównych żył i tętnic podczas usuwania węzłów chłonnych i podczas przetwarzania komórek węzłów chłonnych, trzymaj je na lodzie lub w temperaturze czterech stopni, aby utrzymać żywotność komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykorzystać eksperymentalny mysi model zapalenia pochwy Candida do powtarzalnego ilościowego określenia obciążenia grzybicą pochwy i wycięcia tkanek pochwy lub limfoidalnych do określonych testów immunologicznych lub histologicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje kluczowe techniki oceny zapalenia pochwy wywołanego przez Candida przy użyciu eksperymentalnego modelu zwierzęcego. Metody te umożliwiają szybkie pobieranie próbek pochwy i limfocytów z limfowęzłów lędźwiowych, potencjalnie prowadząc do stworzenia modeli mysich dla innych chorób dolnego odcinka żeńskiego układu rodnego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Mikrobiologia
- Immunologia
Tło
- Zapalenie pochwy wywołane przez Candida jest częstą chorobą dolnego odcinka żeńskiego układu rodnego.
- Zrozumienie reakcji odpornościowej jest kluczowe dla opracowania terapii.
- Modele eksperymentalne pomagają w badaniu mechanizmów choroby.
- Kandydozę pochwy można ilościowo określić za pomocą specyficznych testów.
Cel badania
- Aby pokazać techniki proceduralne do badania kandydozy pochwy.
- Aby ilościowo określić liczbę grzybów w pochwie w eksperymentalnym modelu.
- Aby wykorzystać komórki pochwy i limfoidowe w badaniach immunologicznych.
Stosowane metody
- Technika inokulacj pochwy na szczurach leczonych estrogenem.
- Płukanie pochwy w celu odzyskania Candida po uśmierceniu myszy.
- Wydobycie tkanki pochwy i limfowęzłów lędźwiowych.
- Badanie mikroskopowe i wysiew płynu płukającego na agar.
Główne wyniki
- Udana odzyskanie Candida z płukanie pochwy.
- Ilościowe określenie obciążenia grzybem za pomocą wysiewu na agar.
- Identyfikacja komórek nabłonkowych i limfoidowych poprzez barwienie.
- Demonstracja wykonalności modelu dla przyszłych badań.
Wnioski
- Opisane techniki zapewniają solidną metodę badania kandydozy pochwy.
- Ten model może być dostosowany do innych chorób dolnego odcinka żeńskiego układu rodnego.
- Przyszłe badania mogą budować na tych znaleziskach, aby zbadać odpowiedzi immunologiczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The experimental mouse model of Candida vaginitis provides a robust platform for quantifying vaginal fungal burden and evaluating host immune responses in a controlled, disease-relevant system. This model enables reproducible assessment of infection dynamics and immunological endpoints, supporting early discovery and mechanistic de-risking for antifungal and immunotherapeutic candidates. Its translational alignment with human infection properties enhances predictive confidence for preclinical portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of host-pathogen interactions and immune response mechanisms in a physiologically relevant context.
- Supports functional target validation by quantifying infection and immune cell infiltration without immunosuppression confounders.
- Facilitates mechanistic de-risking for antifungal and immunomodulatory strategies.
Screening & Assay Development
- Provides standardized protocols for inoculation, sample collection, and fungal burden quantification.
- Delivers reproducible, quantitative outputs such as CFU enumeration and immune cell profiling.
- Enables longitudinal sampling from the same animal, supporting robust assay development and screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with human infection immunology, enhancing translational relevance for candidate evaluation.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling immunological and histological endpoint analysis.
- Permits risk-adjusted advancement of antifungal and immunotherapeutic leads based on quantitative infection and immune readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This model integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, target validation, and quantitative assessment of infection and immune responses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven studies of host-pathogen interactions and immune mechanisms.
- Screening: Provides validated, reproducible assays for fungal burden and immune cell quantification.
- Analytics: Generates quantitative outputs (CFU counts, cell profiles) for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Offers continuity for immunological and infection endpoints relevant to human disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating diverse infectious and immunological hypotheses in the lower female genital tract.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in antifungal and immunological research.
- Operational Value: Standardizes infection and sampling protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust preclinical data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of therapeutic candidates targeting mucosal infections.
Implementation Considerations
- Requires expertise in animal handling, infection models, and immunological assays.
- Needs access to instrumentation for sample collection, microscopy, and quantitative plating.
- Demands cross-team standardization of protocols for reproducibility across studies.
- Adaptable to other infectious disease models of the lower female genital tract with protocol modifications.
- Careful handling and sample processing are critical to maintain cell viability and data integrity.
