Protokoły inokulacji dopochwowej i pobierania próbek w eksperymentalnym mysim modelu zapalenia pochwy wywołanego przez Candida
December 8th, 2011
Opisano kluczowe techniki do oceny zapalenia pochwy wywołane przez Candida w eksperymentalnym modelu zwierzęcym. Metody te pozwolą na szybkie pobranie wycinków z pochwy i limfocytów z drenujących węzłów chłonnych lędźwiowych. Techniki te mogą dać początek mysim modelom innych chorób w dolnych drogach rodnych kobiet.
Ogólnym celem tej procedury jest wykazanie konkretnych problemów proceduralnych związanych z wykorzystaniem eksperymentalnego modelu zwierzęcego kandydozy pochwy jako środka do ilościowego określenia obciążenia grzybicą pochwy, a także wykorzystanie komórek pochwy lub limfoidalnych w specyficznych testach, takich jak testy immunologiczne i histologiczne. Zostanie to osiągnięte poprzez najpierw zademonstrowanie techniki inokulacji dopochwowej na myszach leczonych estrogenem. Następnie, po eutanazji myszy, zostanie wykonane płukanie pochwy w celu odzyskania candidy.
Następnie zostanie usunięta tkanka pochwy i/lub węzły chłonne drenujące pochwę. Płyn lawiczny można oglądać pod mikroskopem, aby pokazać candida związaną z komórkami nabłonka pochwy lub posiewać na agarze w celu ilościowego określenia obciążenia grzybicą pochwy. Rozmaz frakcji komórkowej może być również używany do barwienia komórek nabłonkowych i komórek limfoidalnych.
Tak więc główną zaletą demonstrowania tej techniki jest to, że użytkownicy zwierzęcego modelu zapalenia pochwy mogą to zrobić najbardziej wydajnie i skutecznie. Kluczowe pytania, na które można odpowiedzieć za pomocą tej techniki, dotyczą zapalenia pochwy i ekologii oraz odpowiadają na kluczowe pytania, takie jak odpowiedź immunologiczna gospodarza, dystrybucja komórkowa, skuteczność leków, skuteczność immunoterapeutyczna, a także efekty immunizacji i demonstracji techniki. Dzisiaj będę doktorantem w moim laboratorium, junco yano, aby zarazić mysz C albicans trzy dni po podaniu zastrzyku beta estradiolu.
Zacznij od ustabilizowania myszy na płaskiej powierzchni gRED, aby mogła się chwycić. Następnie przytrzymaj podstawę ogona dwoma palcami i unieś biodro do góry, tak aby otwór pochwy był skierowany w Twoją stronę. Włóż końcówkę pipety na głębokość około pięciu milimetrów do światła pochwy i odpipetuj do 20 mikrolitrów zawiesiny inokulum.
Wykonaj ten krok tak szybko i delikatnie, jak to możliwe, aby zminimalizować niepokój myszy. Po pożądanym okresie inkubacji poddaj zwierzę eutanazji zgodnie z protokołem obowiązującym w Twojej placówce. Następnie dwoma palcami przytrzymaj mysz w dół za podstawę ogona, tak aby otwór pochwy został odsłonięty za pomocą pipety.
Wprowadzić 100 mikrolitrów sterylnego PBS do światła pochwy i przy wielokrotnym zasysaniu i mieszaniu wykonać płukanie. Jeśli końcówka pipety zostanie zatkana komórkami, dozuj zatykające komórki i kontynuuj niszczenie pozostałym PBS. Zbierz płyn z płukania do mikroprobówki wirówkowej.
Po zabiegu płukania pochwy połóż mysz na plecach i nasącz obszar pachwiny 70% etanolem. Za pomocą kleszczy podnieś otwór moczowy do góry, tak aby otwór pochwy został odsłonięty. Włóż parę zakrzywionych kleszczyków do światła pochwy i zlokalizuj szyjkę macicy, utrzymując mocny chwyt kleszczykami.
Wyciągnij szyjkę macicy przez jamę pochwy, wytnij pochwę u podstawy otworu pochwy, a następnie usuń szyjkę macicy z pochwy nożyczkami chirurgicznymi. Ponieważ tkanka pochwy jest ewoluowana, odwróć ją, aby zachować pierwotną orientację lub otwórz ją w prześcieradło, wykonując boczne nacięcie w celu wycięcia węzła lędźwiowego ze zwierzęciem na grzbiecie. Nasycić brzuch 70% etanolem.
Wykonaj boczne nacięcie, zaczynając od dolnej części brzucha do klatki piersiowej i odsłoń narządy wewnętrzne za pomocą kleszczy w obu rękach. Przesuń jelita do góry, aby widoczne stały się centralne naczynia krwionośne. Zlokalizuj żyłę dolną cva i aortę brzuszną.
Para węzłów chłonnych lędźwiowych może być zidentyfikowana w sąsiedztwie aorty brzusznej położonej mniej więcej w połowie drogi między początkiem tętnicy nerkowej a tętnicy biodrowej wspólnej. Te węzły chłonne można wizualnie odróżnić od tkanki tłuszczowej dzięki ich elastycznej teksturze i są jaśniejsze i bardziej nieprzezroczyste w porównaniu z tkanką tłuszczową. Są one również zauważalnie większe u zakażonych zwierząt w porównaniu z niezaszczepionymi.
Zwierzęta wycinały węzły chłonne, umieszczając mikrokleszcze pod węzłem, a następnie delikatnie podciągały, aby oddzielić je od otaczającej tkanki. Po wycięciu tkanki przenieś węzły chłonne na sterylne sito z siatki drucianej umieszczone wewnątrz sterylnej szklanej szalki Petriego zawierającej około 10 mililitrów zbilansowanego roztworu soli Hanka. Aby wyizolować komórki limfoidalne, zapoznaj się z pisemnym protokołem.
Frakcje komórkowe płynu z płukania pochwy od myszy zaszczepionych co najmniej cztery dni wcześniej zazwyczaj składają się z komórek nabłonka Candida i nacieków komórkowych, jak pokazano tutaj za pomocą mikroskopii mokrej. Candida można rozpoznać po obecności PHA, a także drożdży. Tutaj preparaty rozmazowe płynu z płukania pochwy są barwione.
Wykorzystanie techniki rozmazu cytologicznego do badania komórek nabłonkowych i naciekających leukocytów, których głównymi komórkami są neutrofile, które można zidentyfikować za pomocą płatów traclear. Bardzo niewiele neutrofili, jeśli w ogóle, wykrywa się u niezaszczepionych myszy. Ten rysunek przedstawia przykład obciążenia grzybicą pochwy.
Płyn z płukania pochwy jest pobierany w określonych punktach czasowych i hodowany w celu oznaczenia CFU. W tym przykładzie płyn pobrano w piątym dniu po inokulacji, seryjnie, rozcieńczono na platerze i inkubowano przez 48 godzin. Kolonie są następnie liczone i obliczane obciążenie grzybicze pochwy Kolonizacja pochwy lub zakażenie Candida utrzymuje się przez tygodnie u myszy zaszczepionych estrogenem.
Podczas gdy Candida nie jest w stanie ustanowić kolonizacji pochwy u myszy zaszczepionych estrogenem, myszy niezaszczepione estrogenem pozostają ujemne dla Candida przez cały czas. Ponadto płukanie pochwy można wykonać jednorazowo na oddzielnych myszach w każdym punkcie czasowym lub podłużnie u tych samych myszy w znieczuleniu. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o bezpiecznym unieruchomieniu zwierząt, aby uniknąć urazu pochwy, i należy poświęcić czas niezbędny do dokładnego płukania, aby uzyskać dokładne obciążenie grzybicą pochwy podczas ekstrakcji tkanek pochwy.
Używaj nadal PBS, aby zapobiec ich odwodnieniu i uważaj, aby nie uszkodzić głównych żył i tętnic podczas usuwania węzłów chłonnych i podczas przetwarzania komórek węzłów chłonnych, trzymaj je na lodzie lub w temperaturze czterech stopni, aby utrzymać żywotność komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykorzystać eksperymentalny mysi model zapalenia pochwy Candida do powtarzalnego ilościowego określenia obciążenia grzybicą pochwy i wycięcia tkanek pochwy lub limfoidalnych do określonych testów immunologicznych lub histologicznych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje kluczowe techniki oceny zapalenia pochwy wywołanego przez Candida przy użyciu eksperymentalnego modelu zwierzęcego. Metody te umożliwiają szybkie pobieranie próbek pochwy i limfocytów z limfowęzłów lędźwiowych, potencjalnie prowadząc do stworzenia modeli mysich dla innych chorób dolnego odcinka żeńskiego układu rodnego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Mikrobiologia
- Immunologia
Tło
- Zapalenie pochwy wywołane przez Candida jest częstą chorobą dolnego odcinka żeńskiego układu rodnego.
- Zrozumienie reakcji odpornościowej jest kluczowe dla opracowania terapii.
- Modele eksperymentalne pomagają w badaniu mechanizmów choroby.
- Kandydozę pochwy można ilościowo określić za pomocą specyficznych testów.
Cel badania
- Aby pokazać techniki proceduralne do badania kandydozy pochwy.
- Aby ilościowo określić liczbę grzybów w pochwie w eksperymentalnym modelu.
- Aby wykorzystać komórki pochwy i limfoidowe w badaniach immunologicznych.
Stosowane metody
- Technika inokulacj pochwy na szczurach leczonych estrogenem.
- Płukanie pochwy w celu odzyskania Candida po uśmierceniu myszy.
- Wydobycie tkanki pochwy i limfowęzłów lędźwiowych.
- Badanie mikroskopowe i wysiew płynu płukającego na agar.
Główne wyniki
- Udana odzyskanie Candida z płukanie pochwy.
- Ilościowe określenie obciążenia grzybem za pomocą wysiewu na agar.
- Identyfikacja komórek nabłonkowych i limfoidowych poprzez barwienie.
- Demonstracja wykonalności modelu dla przyszłych badań.
Wnioski
- Opisane techniki zapewniają solidną metodę badania kandydozy pochwy.
- Ten model może być dostosowany do innych chorób dolnego odcinka żeńskiego układu rodnego.
- Przyszłe badania mogą budować na tych znaleziskach, aby zbadać odpowiedzi immunologiczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The experimental mouse model of Candida vaginitis provides a robust platform for quantifying vaginal fungal burden and evaluating host immune responses in a controlled, disease-relevant system. This model enables reproducible assessment of infection dynamics and immunological endpoints, supporting early discovery and mechanistic de-risking for antifungal and immunotherapeutic candidates. Its translational alignment with human infection properties enhances predictive confidence for preclinical portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of host-pathogen interactions and immune response mechanisms in a physiologically relevant context.
- Supports functional target validation by quantifying infection and immune cell infiltration without immunosuppression confounders.
- Facilitates mechanistic de-risking for antifungal and immunomodulatory strategies.
Screening & Assay Development
- Provides standardized protocols for inoculation, sample collection, and fungal burden quantification.
- Delivers reproducible, quantitative outputs such as CFU enumeration and immune cell profiling.
- Enables longitudinal sampling from the same animal, supporting robust assay development and screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with human infection immunology, enhancing translational relevance for candidate evaluation.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling immunological and histological endpoint analysis.
- Permits risk-adjusted advancement of antifungal and immunotherapeutic leads based on quantitative infection and immune readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This model integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, target validation, and quantitative assessment of infection and immune responses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven studies of host-pathogen interactions and immune mechanisms.
- Screening: Provides validated, reproducible assays for fungal burden and immune cell quantification.
- Analytics: Generates quantitative outputs (CFU counts, cell profiles) for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Offers continuity for immunological and infection endpoints relevant to human disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating diverse infectious and immunological hypotheses in the lower female genital tract.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in antifungal and immunological research.
- Operational Value: Standardizes infection and sampling protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust preclinical data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of therapeutic candidates targeting mucosal infections.
Implementation Considerations
- Requires expertise in animal handling, infection models, and immunological assays.
- Needs access to instrumentation for sample collection, microscopy, and quantitative plating.
- Demands cross-team standardization of protocols for reproducibility across studies.
- Adaptable to other infectious disease models of the lower female genital tract with protocol modifications.
- Careful handling and sample processing are critical to maintain cell viability and data integrity.
