Name: Protokoły inokulacji dopochwowej i pobierania próbek w eksperymentalnym mysim modelu zapalenia pochwy wywołanego przez Candida (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Poznaj techniki inokulacji dopochwowej i pobierania próbek w mysim modelu zakażenia Candida. Metoda umożliwia ilościowe oznaczanie grzybów i analizę komórek immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant R01 AI32556 (NIAID, National Institute of Health). Praca ta była również częściowo wspierana przez Louisiana Vaccine Center oraz South Louisiana Institute for Infectious Disease Research, sponsorowane przez Louisiana Board of Regents.

1. Inokulacja pochwowa Candida albicans
<ol>
	<li>Na trzy dni przed inokulacją, unieruchamiając zwierzę w celu odsłonięcia brzucha, wstrzyknąć podskórnie w dolną część brzucha 100 μl oleju sezamowego zawierającego 0,1-0,5 mg β-estradiolu. Igłę należy wprowadzić na głębokość około 5 do 10 mm bocznie względem skóry, aby zminimalizować wyciek z miejsca wstrzyknięcia. 
	Podanie estrogenu podskórnie w dolnej części brzucha jest optymalne w tym modelu ze względu na bliskie sąsiedztwo z drogami rodnymi. Dawki skuteczne mogą się różnić w zależności od szczepów myszy, ich wieku lub pochodnych estrogenu. W poprzednich badaniach z wykorzystaniem myszy CBA-J (H-2κ), C3H/HeN (H-2κ), C57BL/6 (H-2b), Balb/c (H-2d), DBA/2 (H-2d), SJL (H-2s) w wieku 6-8 tygodni, za skuteczną uznano dawkę 0,1 mg/100 μl, co potwierdzono pogrubieniem ścian pochwy, zmniejszeniem ilości śluzu pochwowego oraz zwiększonym złuszczaniem komórek nabłonkowych. Myszy traktowane estrogenem w tym stężeniu wykazują trwałą kolonizację pochwy przez Candida. W przypadku inokulacji myszy innych szczepów i w innym wieku zaleca się przeprowadzenie badania pilotażowego, aby zapewnić skuteczność estrogenu w zmodyfikowanych warunkach i w razie potrzeby zwiększyć dawkę estrogenu. 
	Roztwór estrogenu należy przygotowywać na świeżo w dniu wstrzyknięcia. Aby zapewnić całkowitą rozpuszczalność estrogenu w oleju sezamowym, roztwór należy dokładnie wymieszać za pomocą mieszadła wirówkowego i okresowo podgrzewać do 37°C. Iniekcję powtarzać co tydzień przez cały okres trwania badania.</li>
	<li>Aby przygotować inokulum, nanieść pętlą blastokonidia C. albicans z niedawnej subkultury na agarze Sabourauda z dekstrozą (SDA) do 10 ml bulionu Phytone-peptone uzupełnionego o 0,1% glukozy. Hodowlę w bulionie inkubować do fazy stacjonarnej przez 18 h w 25°C w kołyszącej łaźni wodnej.</li>
	<li>Po inkubacji przenieść hodowlę z bulionu do probówki stożkowej o pojemności 15 ml i wirować przy 800 x g przez 5 min. Osad przemyć dwukrotnie sterylnym PBS.</li>
	<li>Policzyć żywe blastokonidia za pomocą komory licznikowej (hemocytometru) z wykorzystaniem metody wykluczania barwnika trypan blue. Dostosować stężenie komórek do 2,5 x 106/ml (lub do pożądanego stężenia inokulum) w sterylnym PBS.</li>
	<li>Aby ustabilizować mysz, chwycić podstawę ogona dwoma palcami i unieść biodra do góry tak, aby otwór pochwy był skierowany w stronę operatora (Rysunek 1A). Idealnie jest, jeśli mysz zostanie umieszczona na płaskiej, kratowej powierzchni (np. na górze klatki), tak aby zwierzę mogło stawiać opór przeciwko unieruchomieniu ogona.</li>
	<li>Nabiorem pipety pobrać 20 μl (lub inną pożądaną objętość nieprzekraczającą 20 μl) zawiesiny inokulum, wprowadzając końcówkę pipety na głębokość około 5 mm do światła pochwy (Rysunek 1B). Krok ten należy wykonać jak najszybciej i jak najdelikatniej, aby zminimalizować stres u myszy.</li>
</ol>
2. Płukania pochwy
<ol>
	<li>Po eutanazji (lub znieczuleniu) trzymaj mysz skierowaną w dół, chwytając za nasadę ogona dwoma palcami, tak aby otwór pochwy był odsłonięty.</li>
	<li>Przeprowadź płukanie światła pochwy, wprowadzając 100 μl sterylnego PBS, wykonując wielokrotne aspiracje i mieszanie końcówką pipety. Końcówka pipety może zostać zatkana komórkami. W takim przypadku usuń blokujące komórki i kontynuuj płukanie pozostałym w pochwie PBS. Zbierz płyn z płukania do probówki do mikrocentryfugi.</li>
	<li>Alternatywnie płukanie pochwy można przeprowadzić u myszy znieczulonych wziewnie izofluranem. W tym celu wystaw myszy na działanie odparowanego izofluranu aż do pełnego uspokojenia (~30 sec.). Trzymaj myszy skierowane w dół za nasadę ogona i delikatnie wypłucz światło pochwy, używając 50 μl sterylnego PBS. Należy unikać gwałtownego mieszania końcówką pipety, aby zminimalizować urazy pochwy podczas tej procedury. Uśpione myszy powinny dojść do siebie po znieczuleniu w ciągu 30 sec od wystawienia na powietrze otoczenia.
	 Izofluran można odparować przy użyciu waporyzatora do izofluranu i O2 (preferowane) lub standardowej zamkniętej komory anestezjologicznej z systemem kroplowym bez systemu waporyzacji (wymaga ścisłego monitorowania zwierzęcia podczas sedacji, aby uniknąć niewydolności oddechowej).
	 Płukanie pochwy u myszy znieczulonych powinno być metodą z wyboru w przypadku podłużnego pobierania próbek z płukania od tych samych zwierząt. Kolejne płukania nie wpływają na ocenę obciążenia grzybiczego w czasie41.</li>
	<li>Do preparatów w metodzie mokrej przenieś 10 μl płynu z płukania na szkiełko przedmiotowe i obserwuj przy powiększeniu 400-1000x za pomocą mikroskopii świetlnej. Dodatkowo frakcje komórkowe płynu z płukania można zabarwić w celu zbadania morfologii komórek i jąder. Do preparatów rozmazowych przenieś 10 μl płynu z płukania na szkiełko przedmiotowe i delikatnie rozmaż, używając zewnętrznej ścianki końcówki pipety. Próbki rozmazów utrwal fiksatywem CytoPrep i zabarw standardową techniką Papanicolaou (cytologia Pap). Obserwuj przy powiększeniu 400 × za pomocą mikroskopii świetlnej.</li>
</ol>
3. Ilościowe oznaczenie obciążenia grzybiczego pochwy
<ol>
	<li>W płytce 96-dołkowej z okrągłym dnem przenieś płyn z płukania do jednego dołka w górnym rzędzie oraz 180 μl sterylnego PBS do kolejnych 5 dołków w tej samej kolumnie (w dół płytki).</li>
	<li>Przygotuj seryjne rozcieńczenia płynu z płukania pochwy w stosunku 1:10, przenosząc 20 μl płynu do następnego dołka w kolumnie. Przed każdym przeniesieniem wymieszaj dokładnie zawartość poprzez wielokrotne pipetowanie. Seryjne rozcieńczenia do 12 próbek z płukania (pełny rząd poziomy) można wykonać jednocześnie, używając pipety 12-kanałowej.</li>
	<li>Zaczynając od najniższego rozcieńczenia, przenieś 10 μl próbki na agar Sabourauda z dekstrozą (SDA). Posiew do 36 próbek można wykonać na jednej płytce, używając SDA przygotowanego w kwadratowych szalkach Petriego z siatką oraz wielokanałowej pipety z regulowanym odstępem.</li>
	<li>Wylicz jednostki tworzące kolonie (CFU) po inkubacji w temperaturze 34°C przez 48 h.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja tkanki pochwy
<ol>
	<li>Po przeprowadzeniu procedury przemywania pochwy, ułożyć uśpioną mysz na grzbiecie i nasączyć okolicę pachwin 70% etanolem. Za pomocą pęsety unieść ujście cewki moczowej do góry, aby odsłonić otwór pochwy.</li>
	<li>Wprowadzić zakrzywioną pęsetę do światła pochwy i zlokalizować szyjkę macicy. Utrzymując mocny chwyt pęsetą, wyciągnąć szyjkę macicy przez jamę pochwy (Rysunek 2A-C).</li>
	<li>Wyciąć pochwę u podstawy otworu pochwy, a następnie oddzielić szyjkę macicy od pochwy za pomocą nożyczek chirurgicznych. Należy pamiętać, że tkanka pochwy jest wywinięta (wewnętrzna strona nabłonkowa pochwy jest wystawiona na zewnątrz). Tkankę można odwrócić bocznie, aby zachować pierwotną orientację pochwy, lub rozciąć wzdłuż boku, aby uzyskać płaski arkusz.
	 Wycięte tkanki pochwy mogą być wykorzystane do: 1) ekstrakcji limfocytów po trawieniu kolagenazą (~1 ×104/mysz)40, 2) izolacji komórek nabłonkowych po trawieniu dyspazą (~5 ×104/mysz)28, 3) preparatów mrożonych lub zatopionych w parafinie do analiz histologicznych25.</li>
</ol>
5. Wycięcie węzłów chłonnych lędźwiowych
<ol>
	<li>Po przeprowadzeniu procedury płukania pochwy, połóż eutanazowaną mysz na grzbiecie i nasącz brzuch 70% etanolem. Wykonaj nacięcie boczne od dolnej części brzucha aż do klatki piersiowej i odsłoń narządy wewnętrzne. Używając pęset w obu dłoniach, przesuń jelita ku górze, tak aby centralne naczynia krwionośne stały się widoczne.</li>
	<li>Zlokalizuj żyłę główną dolną oraz aortę brzuszną. Zazwyczaj para węzłów chłonnych lędźwiowych znajduje się w sąsiedztwie aorty brzusznej, mniej więcej w połowie drogi między odejściem tętnic nerkowych a tętnicami biodrowymi wewnętrznymi39. Węzły chłonne te można odróżnić od tkanki tłuszczowej po elastycznej teksturze oraz jaśniejszym, bardziej nieprzezroczystym kolorze (Rycina 3). Węzły chłonne te są wyraźnie powiększone u zwierząt zainfekowanych w porównaniu do zwierząt nieinokulowanych.</li>
	<li>Wyciśnij węzły chłonne, umieszczając mikropęsetę pod węzłem, a następnie delikatnie pociągnij w górę, aby oddzielić go od otaczającej tkanki.</li>
</ol>
6. Izolacja komórek limfoidalnych w zawiesinach jednokomórkowych
<ol>
	<li>Przenieś węzły chłonne na sterylne sito z drucianej siatki (o rozmiarze około 3 x 3 cm2) umieszczone w sterylnej szklanej płytce Petri zawierającej ˜10 ml zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) (Rysunek 4).</li>
	<li>Przy lekko nachylonej płytce Petri dociśnij węzły chłonne do siatki za pomocą tłoka strzykawki. Upewnij się, że wszystkie węzły chłonne zostały rozdrobnione, tak aby zawartość komórkowa węzłów przeszła przez siatkę, podczas gdy komponenty niekomórkowe (tj. błony, zrąb, tłuszcz) pozostały na niej.</li>
	<li>Za pomocą tego samego tłoka i strzykawki odessij HBSS zawierający komórki. Przepłucz siatkę ˜5 ml HBSS i zbierz pozostałą ciecz do stożkowej probówki 15 ml.</li>
	<li>Wiruj przy 800 x g przez 10 min. Przed usunięciem cieczy odessaj pipetą wszelkie złogi tłuszczu znajdujące się na powierzchni płynu. Przemyj osad komórkowy trzykrotnie roztworem HBSS. Resuspenduj osad w 1 ml HBSS i policz żywe komórki metodą wykluczania błękitu trypanu.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki:
Frakcje komórkowe płynu z przemywania pochwy u myszy inokulowanych &gt;4 dni temu zazwyczaj składają się z Candida, komórek nabłonkowych i nacieków komórkowych (Rysunek 5). W badaniu mikroskopowym preparatu świeżego Candida można zidentyfikować wizualnie na podstawie obecności strzępek oraz drożdżaków (Rysunek 5A). Preparaty rozmazowe płynu z przemywania pochwy można barwić metodą Papanicolaou w celu oceny komórek nabłonkowych i naciekających leukocytów, wśród których głównymi komórkami są neutrofile, rozpoznawane po trójpłatowych jądrach (Rysunek 5B). U myszy nieinokulowanych wykrywa się bardzo mało neutrofili lub nie stwierdza się ich wcale (Rysunek 5C)41.
Przykład obciążenia grzybiczego pochwy przedstawiono na rysunku 6. Płyn z płukania pochwy pobrany w określonych punktach czasowych jest poddawany hodowli w celu wyliczenia CFU (rysunek 6A). Kolonizacja/infekcja pochwy drożdżakami z rodzaju Candida utrzymuje się przez wiele tygodni u myszy inokulowanych i traktowanych estrogenem (rysunek 6B), podczas gdy u myszy inokulowanych, ale niepoddanych działaniu estrogenu, nie dochodzi do kolonizacji pochwy przez Candida (rysunek 6C). Myszy nieinokulowane, traktowane estrogenem, pozostają ujemne w kierunku Candida przez cały czas trwania badania (dane nie pokazano). Ponadto płukanie pochwy można przeprowadzić jednorazowo na osobnych myszach w każdym punkcie czasowym lub podłużnie u tych samych zwierząt w znieczuleniu.
Lędźwiowe węzły chłonne są głównymi węzłami drenującymi układ rozrodczy i stanowią najważniejsze miejsce oceny systemowych odpowiedzi immunologicznych na wyzwanie dopochwowe. Należy zauważyć, że węzły chłonne te mogą ulec powiększeniu u myszy inokulowanych, podczas gdy u myszy nieinokulowanych zazwyczaj pozostają bardzo małe. Odzysk komórek leukocytarnych wynosi zazwyczaj od 8 × 105/mysz nieinokulowana do 5 ×106/mysz inokulowana. Oprócz lędźwiowych węzłów chłonnych można wykorzystać również węzły chłonne pachwinowe, podkolanowe oraz krezkowe.
<img alt="Unieruchomienie i iniekcja u myszy, technika laboratoryjna, obchodzenie się z okazami, procedura weterynaryjna." src="/files/ftp_upload/3382/3382fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Inokulacja pochwowa z użyciem Candida. A) Mysz unieruchomiona do inokulacji. Myszy umieszcza się na drucianej wkładce klatki i trzyma za nasadę ogona, lekko unosząc go do góry, aby unieść kończyny i odsłonić otwór pochwy. Biodro myszy można stabilizować tą samą ręką, jeśli zwierzę próbuje stawiać opór unieruchomieniu za ogon. B) Wprowadzanie inokulum do światła pochwy. Końcówkę pipety delikatnie wprowadza się na głębokość około 5 mm do światła pochwy. Następnie nanosi się zawiesinę inokulum.
<img alt="Proces sekcji myszy; sekwencja ekstrakcji tkanki w eksperymencie naukowym." src="/files/ftp_upload/3382/3382fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Ekstrakcja tkanki pochwy. A-B) Ekstrakcja szyjki macicy. Szyjkę macicy lokalizuje się za pomocą pęsety zakrzywionej i wystawia na zewnątrz poprzez jamę pochwy. Po wyprowadzeniu z jamy pochwy, szyjkę macicy odciąga się dalej, aby w pełni odsłonić pochwę. C) Ekstrakcja pochwy. Pochwę wycina się od sromu za pomocą nożyczek. Po oddzieleniu należy usunąć szyjkę macicy z pochwy.
<img alt="Sekcja ukazująca węzły chłonne lędźwiowe w jamie brzusznej ssaka, badanie anatomiczne." src="/files/ftp_upload/3382/3382fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Identyfikacja węzłów chłonnych lędźwiowych. Wskazano położenie węzłów chłonnych lędźwiowych pomiędzy otaczającymi organami/naczyniami krwionośnymi w okolicy miednicy. A, aorta brzuszna. B, pęcherz moczowy. C, wspólna tętnica biodrowa. I, jelita. L, wątroba. R, odbytnica. S, śledziona. U, macice.
<img alt="Eksperyment barwienia hodowli komórkowych, ustawienie szalki Petriego, proces przygotowania próbki histologicznej." src="/files/ftp_upload/3382/3382fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4. Węzły chłonne lędźwiowe umieszczone na siatce drucianej. Węzły chłonne są gromadzone na siatce umieszczonej w szalce Petriego z HBSS. Węzły chłonne są dociskane do siatki tłokiem strzykawki w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek limfoidalnych.
<img alt="Porównanie morfologii komórek; obrazy mikroskopowe; zaszczepione vs. niezaszczepione; oznaczone struktury komórkowe." src="/files/ftp_upload/3382/3382fig5.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 5"> Rycina 5. Frakcje komórkowe płynu z przemywania pochwy u myszy zaszczepionych. A) Preparaty w metodzie mokrej i B) preparaty cytologiczne (rozmaz Pap) próbek z przemywania pochwy pobranych 4 dni po inokulacji oraz C) od myszy niezaszczepionych. Obrazy przedstawiono przy powiększeniu 1000× (A) lub 400× (B, C). Wstawka w B pokazuje morfologię jąder neutrofili pochwowych przy powiększeniu 1000×. Oznaczono drożdżaki (Y) i strzępki (H) Candida, komórki nabłonkowe (EC) oraz neutrofile (N).
<img alt="Badanie obciążenia grzybiczego pochwy: seria rozcieńczeń, wpływ estrogenu, analiza CFU, dot blot, wykresy." src="/files/ftp_upload/3382/3382fig6.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 6"> Rysunek 6. Wykrywanie obciążenia grzybiczego pochwy. A) Reprezentatywne kolonie C. albicans wyhodowane na płytce SDA. Próbki płukania w postaci niepoddanych rozcieńczeniu (N) od sześciu różnych inokulowanych myszy (górny rząd) zostały poddane rozcieńczeniom seryjnym i wysiane w celu wyznaczenia liczby CFU. B) Ilościowe określenie obciążenia grzybiczego pochwy u myszy traktowanych estrogenem i C) u myszy nietraktowanych estrogenem. Liczbę CFU/100 μl płynu do płukania od inokulowanych myszy oceniano w wskazanych punktach czasowych.

<ol><li>Abraham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+immunity+to+Trichomonas+vaginalis+in+a+mouse+model+of+vaginal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Inducible immunity to Trichomonas vaginalis in a mouse model of vaginal infection.</a> Infect. Immun. 64, 3571-3571 (1996).</li>
<li>Black, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+histocompatibility+haplotype+does+not+impact+the+course+of+experimentally+induced+murine+vaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Major histocompatibility haplotype does not impact the course of experimentally induced murine vaginal candidiasis.</a> Lab. Anim. Sci. 49 (6), 668-668 (1999).</li>
<li>Black, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+neutropenia+decreases+inflammation+associated+with+murine+vaginal+candidiasis+but+has+no+effect+on+the+course+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Inf.+Immun%22%5BJournal%5D)">Acute neutropenia decreases inflammation associated with murine vaginal candidiasis but has no effect on the course of infection.</a> Inf. Immun. 66, 1273-1273 (1998).</li>
<li>Black, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+severity+of+Candida+vaginitis+in+BALB%2Fc+nu%2Fnu+mice+versus+the+parent+strain+is+not+abrogated+by+adoptive+transfer+of+T+cell+enriched+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Increased severity of Candida vaginitis in BALB/c nu/nu mice versus the parent strain is not abrogated by adoptive transfer of T cell enriched lymphocytes.</a> J. Reprod. Immunol. 45, 1-1 (1999).</li>
<li>Buchannan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+stromal+and+epithelial+estrogen+receptors+in+vaginal+epithelial+proliferation%2C+stratification%2C+and+cornification%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Role of stromal and epithelial estrogen receptors in vaginal epithelial proliferation, stratification, and cornification.</a> Endocrinology. 139 (10), 4345-4345 (1998).</li>
<li>Clemons, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+susceptibility+of+mice+to+Candida+albicans+vaginitis+correlates+with+host+estrogen+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic susceptibility of mice to Candida albicans vaginitis correlates with host estrogen sensitivity.</a> Infect. Immun. 72, 4878-4878 (2004).</li>
<li>Conrady, C. D., Halford, W. P., Carr, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+type+I+interferon+pathway+increases+vulnerability+of+mice+to+genital+Herpes+simplex+virus+2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Loss of the type I interferon pathway increases vulnerability of mice to genital Herpes simplex virus 2 infection.</a> J. Virol. 85 (4), 1625-1625 (2011).</li>
<li>Cunha, G. R., Cooke, P. S., Kurita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+estromal-epithelial+interaction+in+hormonal+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Histol+Cytol%22%5BJournal%5D)">Role of estromal-epithelial interaction in hormonal responses.</a> Arch Histol Cytol. 67 (5), 417-417 (2004).</li>
<li>Enjalbert, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifunctional%2C+synthetic+Caussia+princeps+luciferase+reporter+for+live+imaging+of+Candida+albicans+infections%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A multifunctional, synthetic Caussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections.</a> 77 (11), 4847-4847 (2009).</li>
<li>Feinen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+Th17+responses+in+a+murine+model+of+Neisseria+gonorrhoeae+genital+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Critical role of Th17 responses in a murine model of Neisseria gonorrhoeae genital infection.</a> Mucosal Immunol. 3 (3), 312-312 (2010).</li>
<li>Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+protective+host+defenses+against+oral+and+vaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Distinct protective host defenses against oral and vaginal candidiasis.</a> Med. Mycol. 40, 359-359 (2002).</li>
<li>Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intravaginal+live+Candida+challenge+in+humans+leads+to+new+hypotheses+for+the+immunopathogenesis+of+vulvovaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">An intravaginal live Candida challenge in humans leads to new hypotheses for the immunopathogenesis of vulvovaginal candidiasis.</a> Infect. Immun. 72, 2939-2939 (2004).</li>
<li>Fidel, P. L., Cutright, J. L., Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+D0870+treatment+of+experimental+Candida+vaginitis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Efficacy of D0870 treatment of experimental Candida vaginitis.</a> Antimicrob. Agents. Chemother. 41, 1455-1455 (1997).</li>
<li>Fidel, P. L., Cutright, J. L., Steele, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Reproductive+hormones+on+experimental+vaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Effects of Reproductive hormones on experimental vaginal candidiasis.</a> Infect. Immun. 68, 651-651 (2000).</li>
<li>Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+Candida+glabrata+vaginitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inf.+Dis%22%5BJournal%5D)">A murine model of Candida glabrata vaginitis.</a> J. Inf. Dis. 173, 425-425 (1996).</li>
<li>Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+vaginal+cell+populations+during+experimental+vaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Inf.+Immun%22%5BJournal%5D)">Analysis of vaginal cell populations during experimental vaginal candidiasis.</a> Inf. Immun. 67, 3135-3135 (1999).</li>
<li>Fidel, P. L., Lynch, M. E., Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida-specific+cell-mediated+immunity+is+demonstrable+in+mice+with+experimental+vaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Candida-specific cell-mediated immunity is demonstrable in mice with experimental vaginal candidiasis.</a> Infect. Immun. 61, 1990-1990 (1993).</li>
<li>Fidel, P. L., Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunopathogenesis+of+recurrent+vulvovaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev.+9%22%5BJournal%5D)">Immunopathogenesis of recurrent vulvovaginal candidiasis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 9. 9, 335-335 (1996).</li>
<li>Fidel, P. L., Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFidel%2C+PL+%22Murine+Models+of+Candida+Vaginal+Infections%2C+In+Experimental+models+in+antimicrobial+chemotherapy%22">Murine Models of Candida Vaginal Infections, In Experimental models in antimicrobial chemotherapy</a>. Zak, O., Sande, M. , 2nd ed, Academic Press Ltd. London, UK. 741-748 (1999).</li>
<li>Fidel, P. L., Vazquez, J. A., Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+glabrata%3A+Review+of+epidemiology%2C+pathogenesis%2C+and+clinical+disease+with+comparison+to+C.+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Candida glabrata: Review of epidemiology, pathogenesis, and clinical disease with comparison to C. albicans.</a> Clin. Microbiol. Rev. 12, 80-80 (1999).</li>
<li>Fulurija, A., Ashman, R. B., Papadimitriou, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+depletion+increases+susceptibility+to+systemic+and+vaginal+candidiasis+in+mice%2C+and+reveals+differences+between+brain+and+kidney+in+mechanisms+of+host+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil depletion increases susceptibility to systemic and vaginal candidiasis in mice, and reveals differences between brain and kidney in mechanisms of host resistance.</a> Microbiology. 142, 3487-3487 (1996).</li>
<li>Gill, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+require+type+I+IFN+receptor+for+antiviral+responses+during+genital+HSV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection.</a> Cell Immunol. 269 (1), 29-29 (2011).</li>
<li>Hamad, M., Abu-Elteen, K. H., Ghaleb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen-dependent+induction+of+persistent+vaginal+candidosis+in+naive+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Estrogen-dependent induction of persistent vaginal candidosis in naive mice.</a> Cell. Immunol. 47 (7), 304-304 (2004).</li>
<li>Hamad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+the+oestrogen-dependent+vaginal+candidosis+murine+model+in+evaluating+the+efficacy+of+various+therapies+against+vaginal+Candida+albicans+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Utility of the oestrogen-dependent vaginal candidosis murine model in evaluating the efficacy of various therapies against vaginal Candida albicans infection.</a> Mycoses. 49 (2), 104-104 (2006).</li>
<li>LeBlanc, D. M., Barousse, M. M., Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+dendritic+cells+in+immunoregulation+during+experimental+vaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">A role for dendritic cells in immunoregulation during experimental vaginal candidiasis.</a> Infect. Immun. 74, 3213-3213 (2006).</li>
<li>McGrory, T., Garber, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+intravaginal+infection+with+Trichomonas+vaginalis+and+role+of+Lactobacillus+acidophilus+in+sustaining+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Mouse intravaginal infection with Trichomonas vaginalis and role of Lactobacillus acidophilus in sustaining infection.</a> Infect. Immun. 60, 2375-2379 (1992).</li>
<li>Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+mucosal+Candida+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS.+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Animal models of mucosal Candida infection.</a> FEMS. Microbiol. Lett. 283 (2), 129-129 (2008).</li>
<li>Nomanbhoy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaginal+and+oral+epithelial+cell+anti-Candida+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Inf.+Immun%22%5BJournal%5D)">Vaginal and oral epithelial cell anti-Candida activity.</a> Inf. Immun. 70, 7081-7081 (2002).</li>
<li>Pietrella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beta-glucan-conjugate+vaccine+and+anti-beta-glucan+antibodies+are+effective+against+murine+vaginal+candidiasis+as+assessed+by+a+novel+in+vivo+imaging+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A beta-glucan-conjugate vaccine and anti-beta-glucan antibodies are effective against murine vaginal candidiasis as assessed by a novel in vivo imaging technique.</a> Vaccine. 28 (7), 1717-1717 (2010).</li>
<li>Redondo-Lopez, V., Cook, R. N., Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+Lactobacilli+in+the+control+and+maintenance+of+the+vaginal+bacterial+microflora%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Emerging role of Lactobacilli in the control and maintenance of the vaginal bacterial microflora.</a> Rev Infect Dis. 12 (5), 856-856 (1990).</li>
<li>Saavedra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+production+of+chemokines+during+experimental+vaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Inf.+Immun%22%5BJournal%5D)">Local production of chemokines during experimental vaginal candidiasis.</a> Inf. Immun. 67, 5820-5820 (1999).</li>
<li>Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+epidemiology+of+vulvovaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and epidemiology of vulvovaginal candidiasis.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 544, 547-547 (1988).</li>
<li>Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+treatment+of+recurrent+vulvovaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and treatment of recurrent vulvovaginal candidiasis.</a> Clin. Infect. Dis. 14, Suppl 1. S148-S153 (1992).</li>
<li>Sobel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vulvovaginal+candidiasis%3A+Epidemiologic%2C+diagnostic%2C+and+therapeutic+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Vulvovaginal candidiasis: Epidemiologic, diagnostic, and therapeutic considerations.</a> Am. J. Obstet. Gynecol. 178 (2), 203-203 (1998).</li>
<li>Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+humoral+immune+responses+against+primary+and+repeat+Neisseria+gonorrhoeae+genital+tract+infections+of+17%CE%B2-estradiol-treated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Local and humoral immune responses against primary and repeat Neisseria gonorrhoeae genital tract infections of 17β-estradiol-treated mice.</a> Vaccine. 26, 5741-5741 (2008).</li>
<li>Taylor, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+virulence+of+Candida+albicans+isolates+causing+mucosal+infections+in+people+infected+with+the+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">In vivo virulence of Candida albicans isolates causing mucosal infections in people infected with the human immunodeficiency virus.</a> J. Infect. Dis. 182, 955-955 (2000).</li>
<li>Taylor, B. N., Saavedra, M., Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Th1%2FTh2+cytokine+production+during+experimental+vaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Mycol%22%5BJournal%5D)">Local Th1/Th2 cytokine production during experimental vaginal candidiasis.</a> Med. Mycol. 38, 419-419 (2000).</li>
<li>Tirabassi, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mucosal+vaccination+approach+for+herpes+simplex+virus+type+2%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A mucosal vaccination approach for herpes simplex virus type 2.</a> Vaccine. 29 (5), 1090-1090 (2011).</li>
<li>Broeck, W. V. anden, Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes%3A+descriptive+and+nomenclatory+standardization+in+BALB%2FcAnNCrl+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: descriptive and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J. Immunol. Methods. 312 (1-2), 12-12 (2006).</li>
<li>Wormley, F. L., Chaiban, J., Fidel, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+molecule+and+lymphocyte+activation+marker+expression+during+experimental+vaginal+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion molecule and lymphocyte activation marker expression during experimental vaginal candidiasis.</a> J. Immunol. Methods. 69, 5072-5072 (2001).</li>
<li>Yano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell-derived+S100+calcium-binding+proteins+as+key+mediators+in+the+hallmark+acute+neutrophil+response+during+Candida+vaginitis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis.</a> Infect. Immun. 78 (12), 5126-5126 (2010).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Eksperymentalny model zapalenia pochwy wywołanego przez Candida u myszy został opracowany i wykorzystywany przez ostatnie kilka dekad do badania odpowiedzi błon śluzowych gospodarza na Candida, a także do testowania terapii przeciwgrzybiczych3,4,11,13,16,17,19,21,24,25,37. Przedstawione tutaj protokoły wykorzystują wydajne i mniej pracochłonne metody i wydają się być jednym z najlepiej zoptymalizowanych systemów modelowych zapalenia pochwy przez Candida opisanych do tej pory. Technik...

<table><tbody><tr><td>samice myszy CBA/J</td><td>Charles River Laboratories</td><td>01C38</td><td>wiek 5–6 tygodni</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Candida albicans&lt;/em&gt; (3153A)</td><td>Krajowa Kolekcja Grzybów Patogennych, Wielka Brytania</td><td>NCPF3153</td><td></td></tr><tr><td>olej sezamowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3547</td><td>D&amp;#8211;nie wymagają wstępnej sterylizacji przed użyciem</td></tr><tr><td>&amp;#914;estradiolu 17-walerianian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1631</td><td>0,1–0,5 mg w oleju sezamowym</td></tr><tr><td>Pepton fitonowy pepton</td><td>BD Biosciences</td><td>211906</td><td>Uzupełnić o 0,1% glukozy</td></tr><tr><td>roztwór błękitu trypanowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>agar Sabourauda z dekstrozą</td><td>BD Biosciences</td><td>211584</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td>0.25%</td></tr><tr><td>Dyspaza</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>1,7 U/ml</td></tr><tr><td>Sita z siatki drucianej</td><td>TWP</td><td>Tekst źródłowy nie zawiera treści do przetłumaczenia. Proszę o dostarczenie materiału w języku angielskim.</td><td>Nr 60 mesh, stal nierdzewna</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; zrównoważony roztwór soli</td><td>Invitrogen</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>utrwalacz CytoPrep</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-570-10</td><td>Konserwuje preparaty rozmazowe</td></tr><tr><td>barwienie Papanicolaou EA-65</td><td>EMD Millipore</td><td>7054X-85</td><td></td></tr><tr><td>barwienie Papanicolaou OG-6</td><td>EMD Millipore</td><td>7052X-85</td><td></td></tr><tr><td>Harris&amp;rsquo; Hematoksylina alumnowa</td><td>EMD Millipore</td><td>638A-85</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Baxter International Inc.</td><td>NDC 10019-773-60</td><td>Stosowana z waporyzatorem izofluranu lub w zamkniętej komorze anestezyjnej z systemem kroplowym</td></tr></tbody></table>

protokoły inokulacji pochwowej i pobierania próbek w eksperymentalnym modelu zapalenia pochwy wywołanego przez candida u myszy

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Kandydoza wulwopodpochwowa (VVC), wywoływana przez gatunki Candida, jest grzybiczą infekcją dolnych dróg rodnych kobiety, która dotyczy około 75% zdrowych kobiet w wieku rozrodczym18,32-34. Czynniki predysponujące obejmują stosowanie antybiotyków, niekontrolowaną cukrzycę oraz zaburzenia poziomu hormonów rozrodczych wynikające z ciąży, stosowania doustnych środków antykoncepcyjnych lub hormonalnej terapii zastępczej33,34. Nawracająca kandydoza wulwopodpochwowa (RVVC), definiowana jako trzy lub więcej epizodów w roku, dotyczy dodatkowo od 5 do 8% kobiet bez czynników predysponujących33.
Ustanowiono eksperymentalny mysi model VVC, który wykorzystano do badania patogenezy oraz odpowiedzi błony śluzowej gospodarza na Candida3,4,11,16,17,19,21,25,37. Model ten został również zastosowany do testowania potencjalnych terapii przeciwgrzybiczych in vivo13,24. Model ten wymaga utrzymywania zwierząt w stanie pseudoestrusu w celu optymalizacji kolonizacji/infekcji Candida6,14,23. W takich warunkach u zaszczepionych zwierząt wykrywalna liczba grzybów w pochwie utrzymuje się od kilku tygodni do kilku miesięcy. Dotychczasowe badania wykazują niezwykle wysoką zbieżność między modelem zwierzęcym a infekcją u ludzi w odniesieniu do właściwości immunologicznych i fizjologicznych3,16,21. Różnice obejmują jednak brak Candida jako normalnej flory pochwy oraz neutralne pH pochwy u myszy.
W niniejszej pracy prezentujemy serię kluczowych metod w mysim modelu zapalenia pochwy, obejmujących inokulację pochwy, szybkie pobieranie próbek z pochwy, ocenę obciążenia grzybiczego pochwy oraz przygotowanie tkanek do ekstrakcji/izolacji komórek. Następnie przedstawiono reprezentatywne wyniki dotyczące składników płynu z płukania pochwy, obciążenia grzybiczego oraz wydajności uzyskiwania leukocytów z drenujących węzłów chłonnych. Dzięki zastosowaniu środków znieczulających próbki z płukania można pobierać w wielu punktach czasowych od tych samych myszy w celu podłużnej oceny infekcji/kolonizacji. Ponadto model ten nie wymaga stosowania środków immunosupresyjnych do zainicjowania infekcji, co umożliwia prowadzenie badań immunologicznych w określonych warunkach gospodarza. Wreszcie, zaprezentowany tutaj model i każda z opisanych technik mogą potencjalnie znaleźć zastosowanie w badaniu innych chorób zakaźnych dolnych dróg rodnych kobiet (bakteryjnych, pasożytniczych, wirusowych) oraz odpowiadających im miejscowych lub systemowych mechanizmów obronnych gospodarza.

Opisano kluczowe techniki stosowane w ocenie zapalenia pochwy spowodowanego przez Candida w eksperymentalnym modelu zwierzęcym. Metody te pozwalają na szybkie pobranie wymazów z pochwy oraz limfocytów z drenujących węzłów chłonnych lędźwiowych. Techniki te mogą posłużyć do stworzenia modeli mysich innych chorób dolnych dróg rodnych u samic.

Protokoły inokulacji pochwowej i pobierania próbek w eksperymentalnym modelu zapalenia pochwy wywołanego przez Candida u myszy

Kandydoza wulwowo-pochwowa (VVC), wywoływana przez gatunki Candida, jest grzybiczą infekcją dolnych dróg rodnych kobiety, która dotyka około 75% ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie konkretnych kwestii proceduralnych związanych z wykorzystaniem eksperymentalnego modelu zwierzęcego kandydozy pochwy w celu ilościowego określenia obciążenia grzybiczego w pochwie, a także wykorzystania komórek pochwy lub komórek limfatycznych w określonych testach, takich jak analizy immunologiczne i histologiczne. Zostanie to osiągnięte poprzez zaprezentowanie techniki inokulacji pochwy u myszy traktowanych estrogenem. Następnie, po uśmierceniu myszy, zostanie wykonane płukanie pochwy w celu odzyskania candida.Następnie należy wyekstrahować tkankę pochwy i/lub drenażowe węzły chłonne pochwy. Płyn z płukania można poddać badaniu mikroskopowemu w celu wykazania obecności Candida związanej z komórkami nabłonka pochwy lub wysiać na agar w celu ilościowego oznaczenia obciążenia grzybiczego pochwy. Rozmaz frakcji komórkowej można również wykorzystać do barwienia komórek nabłonkowych i limfoidalnych.Główną zaletą zaprezentowania tej techniki jest umożliwienie użytkownikom zwierzęcego modelu zapalenia pochwy przeprowadzania go w sposób najbardziej wydajny i efektywny. Kluczowe pytania, na które odpowiada ta metoda, dotyczą dziedziny zapalenia pochwy i ekologii; obejmują one kwestie takie jak odpowiedzi immunologiczne gospodarza, dystrybucja komórkowa, skuteczność leków, skuteczność immunoterapii, a także efekty immunizacji oraz demonstracja samej techniki. Dzisiaj doktorantka z mojego laboratorium, Junco Yano, przeprowadzi zakażenie myszy C. albicans trzy dni po podaniu iniekcji beta-estradiolu.Zacznij od ustabilizowania myszy na płaskiej powierzchni gRED, aby zwierzę mogło się czegoś chwycić. Następnie chwyć nasadę ogona dwoma palcami i unieś biodra do góry tak, aby otwór pochwy był skierowany w Twoją stronę. Wprowadź końcówkę pipety na głębokość około pięciu milimetrów do światła pochwy i pobierz 20 µL zawiesiny inokulum.Wykonaj ten krok tak szybko i delikatnie, jak to możliwe, aby zminimalizować stres u myszy. Po pożądanym czasie inkubacji uśmierć zwierzę zgodnie z protokołem obowiązującym w Twojej jednostce. Następnie, trzymając mysz dwoma palcami za nasadę ogona w pozycji skierowanej w dół, odsłoń otwór pochwy, aby umożliwić dostęp pipetą.Wprowadź 100 µL sterylnego PBS do światła pochwy, a następnie wykonaj płukanie, powtarzając aspirację i mieszanie. Jeśli końcówka pipety zostanie zatkana komórkami, usuń je i kontynuuj płukanie pozostałym PBS. Płyn z płukania zbierz do probówki do mikrocentryfugi.Po przeprowadzeniu procedury płukania pochwy, połóż mysz na grzbiecie i nasącz okolicę pachwin 70% ethanol. Za pomocą pęsety unieś ujście cewki moczowej do góry, aby odsłonić otwór pochwy. Wprowadź zakrzywioną pęsetę do światła pochwy i zlokalizuj szyjkę macicy, utrzymując ją pewnym uchwytem pęsety.Wyciągnij szyjkę macicy przez jamę pochwy, wycinij pochwę u podstawy otworu pochwy, a następnie oddziel szyjkę macicy od pochwy za pomocą nożyczek chirurgicznych. Ponieważ tkanka pochwy uległa inwolucji, odwróć ją, aby zachować pierwotną orientację, lub rozetnij ją bocznie, tworząc płaski arkusz, w celu wycięcia węzłów chłonnych lędźwiowych przy zwierzęciu leżącym na grzbiecie. Nasącz brzuch 70% ethanol.Wykonaj nacięcie boczne od dolnej części brzucha do klatki piersiowej i odsłoń narządy wewnętrzne, używając w obu dłoniach pęset. Przesuń jelita ku górze, aby odsłonić centralne naczynia krwionośne. Zlokalizuj żyłę główną dolną oraz aortę brzuszną.Parę węzłów chłonnych lędźwiowych można zidentyfikować w sąsiedztwie aorty brzusznej, mniej więcej w połowie drogi między odejściem tętnic nerkowych a tętnicami biodrowymi wspólnymi. Węzły chłonne te można odróżnić od tkanki tłuszczowej po ich elastycznej teksturze oraz jaśniejszym i bardziej nieprzezroczystym kolorze. Są one również wyraźnie większe u zwierząt zainfekowanych w porównaniu do nieinokulowanych.Węzły chłonne wycinano, umieszczając mikropincetę pod węzłem, a następnie delikatnie go unosząc, aby oddzielić go od otaczających tkanek. Po wycięciu tkanki węzły chłonne przenoszono na sterylne sito z drutu, umieszczone w sterylnej szklanej szalce Petri zawierającej około 10 ml zrównoważonego roztworu soli Hanksa. W celu izolacji komórek limfoidalnych należy odnieść się do protokołu pisemnego.Frakcje komórkowe płynu z płukania pochwy u myszy inokulowanych co najmniej cztery dni wcześniej zazwyczaj składają się z komórek nabłonka pochwy oraz nacieków komórkowych, co pokazano tutaj w badaniu mikroskopowym w świeżym preparacie. Candida może zostać zidentyfikowana poprzez obecność PHA, a także drożdżaków. Tutaj przedstawiono barwione preparaty rozmazów płynu z płukania pochwy.Wykorzystanie techniki cytologii szyjki macicy (Pap smear) do badania komórek nabłonkowych i naciekających leukocytów, wśród których komórkami głównymi są neutrofile, co można zidentyfikować po trójpłatowych jądrach. U myszy nieinokulowanych stwierdza się bardzo mało neutrofili lub ich całkowity brak. Rycina ta przedstawia przykład obciążenia grzybiczego pochwy.Płyn z płukania pochwy jest pobierany w określonych punktach czasowych i poddawany hodowli w celu wyznaczenia liczby CFU. W tym przykładzie płyn pobrano w piątym dniu po inokulacji, poddano rozcieńczeniom seryjnym, wysiano na płytki i inkubowano przez 48 godzin. Następnie zliczono kolonie i obliczono obciążenie grzybicze pochwy; kolonizacja pochwy lub zakażenie candida utrzymuje się przez wiele tygodni u myszy inokulowanych i traktowanych estrogenem.Podczas gdy u myszy inokulowanych, niepoddanych działaniu estrogenu, candida nie kolonizuje pochwy, mysze nieinokulowane, lecz traktowane estrogenem, pozostają ujemne w kierunku candida przez cały czas trwania badania. Dodatkowo, płukanie pochwy można przeprowadzić jednorazowo na osobnych myszach w każdym punkcie czasowym lub podłużnie u tych samych myszy w znieczuleniu. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o bezpiecznym unieruchomieniu zwierząt, aby uniknąć urazów pochwy, oraz poświęcić czas niezbędny do dokładnego wypłukania, aby uzyskać precyzyjną wartość obciążenia grzybiczego pochwy podczas pobierania tkanek pochwy.Użyj statycznego roztworu PBS, aby zapobiec ich odwodnieniu; należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić głównych żył i tętnic podczas usuwania węzłów chłonnych. Podczas przetwarzania komórek węzłów chłonnych należy trzymać je w lodzie lub w temperaturze 4°C w celu utrzymania żywotności komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak wykorzystać eksperymentalny model mysi zapalenia pochwy wywołanego przez Candida, aby w sposób powtarzalny określić ilość grzybów w pochwie oraz wyciąć tkanki pochwy lub tkanki limfatyczne do specyficznych analiz immunologicznych lub histologicznych.

protocols-for-vaginal-inoculation-sample-collection-experimental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Protokoły inokulacji dopochwowej i pobierania próbek w eksperymentalnym mysim modelu zapalenia pochwy wywołanego przez Candida

Źródło: Morrill, S. R., et al. Modele kolonizacji pochwy przez bakterie hodowane beztlenowo. J. Vis. Exp. (2022)Ten film przedstawia protokół modelowania kolonizacji pochwy u myszy przy użyciu bakterii beztlenowych opornych na antybiotyki. Rozpoczyna się od leczenia hormonalnego w celu zwiększenia podatności nabłonka, a następnie inokulacji dopochwowej i koinokulacji w warunkach beztlenowych. Procedura kończy się pobraniem próbek po inokulacji i hodowlą w celu oceny kolonizacji bakteryjnej i...

Modelowanie kolonizacji pochwy myszy przez bakterie beztlenowe

Źródło: O'Brien, wiceprezes i inni. Nawracająca infekcja dróg moczowych Escherichia coli wywołana przez narażenie pęcherza pochwy Gardnerella u myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film prezentuje przygotowanie szczepionki Gardnerella wagalis w celu ustanowienia mysiego modelu nawracającej infekcji dróg moczowych.

Przygotowanie Gardnerella wagalis inoculum do modelowania nawracających infekcji dróg moczowych u myszy

Źródło: Patras, K. A., Doran, K. S. Model myszy kolonizacji pochwy grupy B Streptococcus . J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje przygotowanie i zaszczepienie pochwy u samicy myszy leczonej hormonami paciorkowcem grupy B w celu modelowania infekcji. Wyjaśnia, jak hodować i przygotowywać bakterie, podawać inokulum do lumenu pochwy oraz zapewnić skuteczną infekcję.

Ustanowienie mysiego modelu infekcji paciorkowcem grupy B pochwy

Ten film pokazuje proces zapoczątkowania uropatogennej infekcji Escherichia coli u samicy pęcherza myszy poprzez przezcewkowe wkroplenie cewnika. Wstrzyknięte bakterie z powodzeniem wywołują infekcję dróg moczowych w obrębie pęcherza moczowego, stanowiąc cenną platformę do badania chorób związanych z opieką zdrowotną związanych z drogami moczowymi.

Opracowanie modelu infekcji dróg moczowych u samic myszy

Ten film demonstruje rozwój mysiego modelu in vivo do badania tworzenia biofilmu Candida albicans w tkance podskórnej. Eksperyment polega na wszczepieniu urządzeń zakażonych Candida w okolicy pleców zwierzęcia w celu rozwoju biofilmu.

Candida albicans (Candida albicans) Tworzenie biofilmu w mysim modelu in vivo

Chociaż dostępne są modele infekcji Candida do badania odporności immunologicznej gospodarza, nie ma modelu do badania immunopatologii za pośrednictwem limfocytów T w kontekście infekcji Candida. Tutaj opisujemy metodę ustalania immunopatologii Th17 związanej z doustnym zakażeniem Candida u myszy z niedoborem odporności.

Model zapalenia Th17 kandydozy jamy ustnej i gardła u myszy z niedoborem odporności

Celem tego protokołu jest imitacja kolonizacji pochwy przez Streptococcus grupy B (GBS) w modelu mysim. Metoda ta może być stosowana do badania odpowiedzi immunologicznych gospodarza i czynników bakteryjnych przyczyniających się do utrzymywania się GBS w pochwie, a także do testowania strategii terapeutycznych.

Mysi model kolonizacji pochwy paciorkowcami grupy B

Tutaj prezentujemy skuteczną i efektywną metodę wstrzykiwania żył ogonowych gryzoni za pomocą unikalnie zaprojektowanego urządzenia rozgrzewającego/krępującego. Usprawniając inicjację procesów rozszerzania naczyń krwionośnych i ograniczania, protokół ten umożliwia dokładne i terminowe wstrzyknięcia dożylne dużym grupom zwierząt przy minimalnym stresie.

Nowoczesne urządzenie rozgrzewające/ograniczające do skutecznych iniekcji żył ogonowych w mysim modelu sepsy grzybiczej

Protokół przedstawia mysi model kolonizacji pochwy za pomocą beztlenowo hodowanych ludzkich bakterii pochwy. Skupiamy się na Gardnerella vaginalis, jednocześnie zamieszczając sugestie dotyczące Prevotella bivia i Fusobacterium nucleatum. Protokół ten może być również stosowany jako przewodnik do inokulacji dopochwowych i realnego odzyskiwania innych bakterii hodowanych beztlenowo.

Modele kolonizacji pochwy myszy przez bakterie hodowane beztlenowo

Tworzymy mysi model infekcji związanej z cewnikiem (CRI) związanej z C.albicans, w której na cewniku tworzy się biofilm, a interakcja między C.albicans a gospodarzem dobrze koreluje z klinicznym CRI. Model ten pomaga w badaniach przesiewowych w kierunku CRI związanego z biofilmem C. albicans, kładąc podwaliny pod transformację kliniczną.

Model zakażenia Candida albicans związany z cewnikiem u myszy

Wcześniaki (poród &lt; 37. tygodniu) to pilny globalny problem zdrowotny z nieoptymalnymi opcjami profilaktyki i leczenia. Przedstawiamy myszy model wcześnianego porodu wywołanego infekcją bakteryjną pochwy oraz opisujemy, jak analizować wynikającą z tego chorobność i śmiertelność noworodków.

Modelowanie wznoszącej się infekcji pochwy, przedwczesnych porodów i noworodkowej zachorowalności u myszy

Poznaj techniki inokulacji dopochwowej i pobierania próbek w mysim modelu zakażenia Candida. Metoda umożliwia ilościowe oznaczanie grzybów i analizę komórek immunologicznych.

Protokoły inokulacji pochwowej i pobierania próbek w eksperymentalnym modelu zapalenia pochwy wywołanego przez Candida u myszy

Przeglądaj więcej filmów