Wykorzystanie plazmonicznych i fotonicznych nanostruktur krystalicznych do usprawnionej manipulacji mikro- i nanocząsteczkami

Ogólnym celem niniejszej procedury jest chwytanie obiektów biologicznych o rozmiarach mikronowych za pomocą pęset plazmonicznych i kryształów fotonicznych. Jest to realizowane poprzez wstępne wytworzenie podłoża plazmonicznego lub podłoża z kryształu fotonicznego. Następnie przygotowuje się próbkę biologiczną poprzez dodanie BSA do zawiesiny komórkowej oraz zapewnienie odpowiedniej przestrzeni dla zawiesiny komórkowej pod górnym szkiełkiem zakrywowym.

Następnie laser zostaje wyrównany z mikroskopem, który został wyposażony w odpowiedni zestaw filtrów. Mikroskop zostaje teraz ustawiony na próbce i przeprowadzana jest pułapkowanie. Na koniec, za pomocą nanostruktur plazmonicznych lub kryształów fotonicznych, można pułapkować cząsteczki o rozmiarach mikro- lub nanometrycznych przy zredukowanej intensywności wiązki padającej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak konwencjonalne pęsety optyczne, jest to, że konwersja pól optycznych poprzez nanostruktury plazmoniczne i kryształy fotoniczne redukuje natężenie niezbędne do pułapkowania małych cząsteczek, takich jak komórki, a także nie wymaga wąskiej wiązki skupionej, co zmniejsza ryzyko fotouszkodzenia komórek w wyniku ekspozycji na promieniowanie. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w wielu dziedzinach biologii, takich jak oddziaływania międzykomórkowe oraz badanie różnych sił biologicznych. Może być również użytecznym narzędziem w obszarze mikro- i nanotechnologii, umożliwiając precyzyjną manipulację mikro- i nanocząsteczkami. Aby utworzyć macierz nanocząsteczek złota, należy przy użyciu ewaporatora wiązką elektronów i chromu jako warstwy adhezyjnej napać złoto na szklaną lamellkę do grubości 20 nanometrów.

Oczyść próbkę za pomocą plazmy tlenowej przez około jedną minutę, aby usunąć z powierzchni zanieczyszczenia organiczne. Po zaindukowaniu samoorganizacji monowarstwy polistyrenu, nanieś ciecz na próbkę metodą kroplowania, inkubuj przez około jedną godzinę, a następnie użyj dużej objętości wody, aby wypłukać niesorbowane sfery i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Po odparowaniu monowarstwy napać drugą warstwę złota o grubości 20 nanometrów na sfery lateksowe, aby utworzyć losową macierz nanocząstek złota.

Układ nanocząsteczek jest teraz gotowy do przyjęcia próbki biologicznej. Umieść przygotowany preparat z nanocząsteczkami na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Kolejnym krokiem jest przygotowanie jąder komórek mysich do pułapkowania optycznego.

Zacznij od jąder komórek mysich znakowanych barwnikiem orange, aby zapobiec przyleganiu jąder do podłoża. Umieść jądra komórkowe w małej fiolce i dodaj 10% BSA w PBS w stężeniu od 1 do 10 BSA, mieszając za pomocą wirówka Vortex. Następnie nanieś pipetą 5 µL roztworu jąder w BSA na przygotowany preparat.

Aby zapewnić odstęp między jądrami a szkiełkiem nakrywnym, należy umieścić stos dwóch szkiełek dystansowych wokół kropli, a następnie nałożyć na wierzch kolejne szkiełko nakrywne. Do pułapkowania i jednoczesnego obrazowania wykorzystuje się dostosowaną konfigurację mikroskopu fluorescencyjnego, obejmującą pominięty filtr wzbudzenia oraz dwa specjalistyczne dichroiczne dzielniki wiązki. Pinceta optyczna została zbudowana poprzez skierowanie lasera helowo-neonowego o mocy 35 milliwatt przez mikroskop zes axio imager D one M, wyposażony w zestaw filtrów GFP 17, który został zmodyfikowany w celu umożliwienia dotarcia promieniowania laserowego o długości 633 nanometr do próbki.

Mikroskop skupi wiązkę lasera na próbce, a następnie wiązka zostanie ugięta przez podłoże z nanocząstek plazmonicznych lub siatkę dyfrakcyjną. Aby obrazować jądra komórkowe, których średnica wynosi około pięciu mikronów, należy użyć obiektywu Zeiss LDEC epi plan z Neola 50 x. Rozpocznij od umieszczenia próbki na obiektywie i ustawienia ostrości na płaszczyźnie z największą liczbą jąder, ponieważ znajdują się one na powierzchni podłoża.

Następnie ustaw ostrość mikroskopu na jądro komórkowe przeznaczone do schwytania, odnajdując wolno pływające jądra komórkowe nad warstwami komórek na powierzchni. Następnie umieść punkt pułapki laserowej nad cząsteczką. W tym momencie powinna ona zostać schwytana i utrzymywać swoją pozycję w plamce lasera, nawet podczas przesuwania stolika.

Jądra komórek mysich znajdujące się w płaszczyźnie ogniskowej mikroskopu będą prawdopodobnie dryfować wraz z lekkim prądem mikrofluidycznym wywołanym nagrzewaniem i odparowywaniem próbki, natomiast jądra w pułapce pozostaną w jednej pozycji. Na tej ilustracji przedstawiono skaningową mikrografię elektronową samoorganizujących się nanocząsteczek złota, z których każda ma średnicę około 450 nanometrów. Oto obraz z bliskopolowej skaningowej mikroskopii optycznej podłoża plazmonicznego o rzadkim rozkładzie nanocząsteczek, ukazujący promieniowanie bliskiego pola.

Długość fali lasera wzbudzającego wynosi 633 nanometrów; tutaj przedstawiono widmo wydajności rozpraszania podłoża plazmonicznego z pikiem przy 624 nanometrach. Widmo wydajności absorpcji podłoża plazmonicznego wykazuje pik przy 668 nanometrach. Złote nanokule są rozłożone losowo w domenie 2D o wymiarach jeden na jeden kwadrat.

Tutaj przedstawiono mikrometr. Każde niebieskie koło reprezentuje środek nanokuli. Na panelach pokazano rozkłady pola rozproszonego w płaszczyznach obserwacji, które są równoległe do losowej macierzy nanokul.

Wykresy te przedstawiają minimalne natężenia lasera niezbędne do utrzymania pułapki w funkcji szybkości przepływu otaczającego płynu. Dzięki zastosowaniu pułapkowania plazmonicznego, wszystkie natężenia optyczne mierzono w płaszczyźnie próbki pod obiektywem mikroskopu. Każdy panel prezentuje wyniki pomiarów dla pojedynczych kulek polistyrenowych o różnych średnicach.

Wstawki przedstawiają odpowiadające im obrazy mikroskopowe cząsteczek. Paski skali na wszystkich obrazach reprezentują długość 5 µm. Przedstawiono tutaj nachylenie linii dopasowanej do początku układu współrzędnych z poprzednich wykresów w funkcji wielkości cząsteczek.

Dla pułapkowania plazmonicznego. Słupki błędów przedstawiają odchylenia standardowe dopasowań liniowych. Wyniki wskazują, że większe cząstki wymagają większej intensywności lasera w celu utrzymania odpowiedniej stabilności pułapkowania.

Ten schemat przedstawia ulepszone pułapkowanie optyczne z wykorzystaniem jednowymiarowych (1D) nanostruktur okresowych. Wiązka padająca ulega dyfrakcji na nanostrukturze okresowej w polu dalekim. Przedstawiono tutaj rozkład natężenia światła o dwóch ortogonalnych polaryzacjach na powierzchni gradu aluminiowego.

Przy okresie 417 nanometrów uzyskanym za pomocą symulacji w dziedzinie czasu metodą różnic skończonych (FDTD), rozkład jest znormalizowany do intensywności na płaskiej powierzchni aluminiowej. Rysunki te przedstawiają potencjał pułapkowania cząstek znajdujących się bezpośrednio nad powierzchnią gradientową w zależności od położenia cząstki. W przypadku kulek polistyrenowych o średnicy 350 nanometrów (CA) i jednej mikrometra (DA), białe okręgi ilustrują wielkości cząstek.

Wstawki przedstawiają potencjał pułapkowania nad płaską powierzchnią aluminiową. Dla tej samej wielkości cząstek w ramach porównania. Wartości zostały znormalizowane dla każdej wielkości cząstek.

Dla wszystkich rycin z symulacji FDTD pole widzenia wynosi 10 na 8 µm². Przedstawiono tutaj wydajność pułapki oraz minimalną intensywność pułapkowania zmierzoną dla kulek polistyrenowych o różnych rozmiarach przy polaryzacji wiązki prostopadłej do linii gradientu. Wstawka pokazuje asymetrię pułapki w wydajności pułapkowania podczas przemieszczania kulki polistyrenowej o rozmiarze 3,87 µm w kierunku prostopadłym i równoległym do linii gradientu.

Poniżej znajduje się schematyczne przedstawienie kąta translacji cząsteczki. Wstawka ta pokazuje wzmocnienie w zależności od kierunku translacji dla różnych polaryzacji i rozmiarów cząsteczek. Linią ciągłą zaznaczono dużą asymetrię uzyskaną przy świetle padającym spolaryzowanym prostopadle do gradientu, a linią przerywaną.

Niewielką asymetrię uzyskuje się przy świetle padającym spolaryzowanym równolegle do gradientu. Panele te przedstawiają demonstrację pułapkowania fluorescencyjnej kuleczki polistyrenowej o rozmiarze 590 nanometrów. Czerwone koło wskazuje pozycję plamki laserowej, ponieważ światło lasera było początkowo zbyt słabe, aby było widoczne.

Cząsteczka zostaje uwięziona w plamce przy wyższej mocy. Wraz ze zmniejszaniem mocy ruchy brownowskie cząsteczki przezwyciężają siłę pułapkowania, co pozwala cząsteczce na ucieczkę. W tym przypadku, w odniesieniu do uwięzionego fluorescencyjnego jądra komórki raka jajnika, minimalna intensywność wymagana do zainicjowania pułapkowania wynosiła 16 µW/µm², co osiągnięto przy użyciu obiektywu 20x.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tworzenia pułapki optycznej o niskiej intensywności do nieinwazyjnej manipulacji biologicznymi próbkami o rozmiarach mikro- i nanometrycznych z wykorzystaniem nanostrukturalnych podłoży plazmonicznych i fotonicznych kryształów.