Wykorzystanie plazmonicznych i fotonicznych nanostruktur krystalicznych do lepszej manipulacji mikro- i nanocząstkami

Ogólnym celem tej procedury jest uwięzienie obiektów biologicznych o rozmiarach mikronów za pomocą plazmonicznej i fotonicznej pęsety krystalicznej. Osiąga się to poprzez najpierw wytworzenie podłoża plazmonicznego lub substratu kryształów fotonicznych. Następnie próbkę biologiczną przygotowuje się, dodając BSA do roztworu komórkowego i zapewniając odpowiednie odstępy dla roztworu komórkowego pod górnym szkiełkiem nakrywkowym.

Następnie laser jest ustawiany w stosunku do mikroskopu, który został wyposażony w odpowiedni schemat filtrów. Mikroskop jest teraz ustawiany na próbce i wykonywane jest chwytanie. Wreszcie, mikro lub nanocząstki mogą być wychwytywane ze zmniejszoną intensywnością incydentów za pomocą plazmonicznych lub fotonicznych nanostruktur krystalicznych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak konwencjonalna pęseta optyczna, jest to, że konwersja pól optycznych przez plazmoniczne i fotoniczne nanostruktury kryształów zmniejsza intensywność wymaganą do uwięzienia małych cząstek, takich jak komórki, a także nie wymaga ściśle skupionej wiązki, co zmniejsza ryzyko fotouszkodzenia komórek w wyniku ekspozycji na promieniowanie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w wielu dziedzinach biologii, takich jak interakcja między komórkami i badanie różnych sił w biologii. Może być również użytecznym narzędziem do produkcji w mikro i nanotechnologii, zapewniając precyzyjną manipulację mikro i nanocząstkami: Aby utworzyć układ nanocząstek złota za pomocą parownika wiązki elektronicznej i chromu jako warstwy adhezyjnej, odparuj złoto na szklanym szkiełku nakrywkowym do grubości 20 nanometrów.

Wyczyść próbkę za pomocą plazmy tlenowej przez około jedną minutę, aby usunąć zanieczyszczenia organiczne z powierzchni. Po skłonieniu monowarstwy polistyrenu do samoorganizacji, upuść, wylej ciecz na próbkę, inkubuj ją przez około godzinę, a następnie użyj dużej ilości wody, aby zmyć kulki nieadsorpcyjne do wyschnięcia na powietrzu. Monowarstwa w końcu odparowuje drugą 20-nanometrową warstwę złota na kulę lateksową, monowarstwę, tworząc losowy układ nanocząstek złota.

Matryca nanocząstek jest teraz gotowa do pobrania próbki biologicznej. Umieść przygotowane szkiełko nanocząsteczkowe na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Kolejnym krokiem jest przygotowanie jąder komórek myszy do pułapki optycznej.

Zacznij od jąder komórek myszy oznaczonych pomarańczowo, aby zapobiec przywieraniu jąder do podłoża. Umieścić jądra komórkowe w małej fiolce i dodać 10% BSA do PBS w stężeniu od 1 do 10 BSA zmieszanych przez wirowanie. Następnie odpipetować pięć mikrolitrów roztworu BSA jąder na przygotowane szkiełko.

Aby zapewnić odstępy między jądrami a szkiełkiem nakrywkowym, umieść stos dwóch szkiełek nakrywkowych z przekładką wokół kropli, a następnie umieść kolejny szkiełko nakrywkowe na górze. Do pułapkowania i jednoczesnego obrazowania należy użyć niestandardowej konfiguracji mikroskopu fluorescencyjnego, w tym pominiętego filtra wzbudzenia i dwóch niestandardowych rozdzielaczy wiązki dichroicznej. Pęseta optyczna jest skonstruowana poprzez wysłanie 35-miliwatowego helowego lasera neonowego przez mikroskop zes axio imager D one M, wyposażony w zestaw filtrów GFP 17, który jest zmodyfikowany tak, aby umożliwić dotarcie promieniowania laserowego o długości 633 nanometrów do próbki.

Mikroskop skupi wiązkę laserową na próbce, a następnie wiązka zostanie zadyfrakowana przez substrat nanocząstek plazmonicznych lub gradację dyfrakcyjną. Aby zobrazować jądra komórkowe o średnicy około pięciu mikronów, użyj planu epi LDEC firmy Zeiss z obiektywem Neola 50 x. Zacznij od umieszczenia próbki na obiektywie i skupienia się na płaszczyźnie z największą liczbą jąder, które znajdują się na powierzchni podłoża.

Następnie skoncentruj mikroskop na jądrze, które ma zostać uwięzione, znajdując swobodnie unoszące się jądra komórkowe nad warstwami komórek na powierzchni. Następnie umieść plamkę pułapki laserowej nad cząstką. W tym momencie powinien zostać uwięziony i powinien utrzymywać swoją pozycję w plamce lasera nawet po przesunięciu stolika.

Jądra myszy, które znajdują się w płaszczyźnie ogniskowej mikroskopu, będą prawdopodobnie dryfować z niewielkim prądem mikroprzepływowym spowodowanym ogrzewaniem i parowaniem próbki, ale jądra w pułapce pozostaną w jednej pozycji. Rysunek ten przedstawia skaningowy mikroskop elektronowy samoorganizujących się nanocząstek złota, z których każda ma średnicę około 450 nanometrów. Oto obraz z mikroskopii optycznej skaningowej bliskiego pola podłoża plazmonicznego, na którym rozkład nanocząstek jest rzadki, pokazujący promieniowanie bliskiego pola.

Długość fali lasera wzbudzającego wynosi 633 nanometry, pokazano tutaj widmo wydajności rozpraszania substratu plazmonicznego pokazujące pik na 624 nanometrach. Widmo wydajności absorpcji substratu plazmonicznego pokazuje pik przy 668 nanometrach. Złote nanosfery losowo rozmieszczone na domenie 2D jedna po jednej kwadracie.

Mikrometry są pokazane tutaj. Każdy niebieski okrąg reprezentuje środek nanosfery. Na tych panelach pokazane są rozkłady pola rozpraszania na płaszczyznach obserwacyjnych, które są równoległe do losowego układu nanosfer

Wykresy te pokazują minimalne natężenia lasera do utrzymania pułapki w funkcji natężenia przepływu otaczającego płynu. Wykorzystując pułapkowanie plazmoniczne, wszystkie intensywności optyczne są mierzone na płaszczyźnie próbki pod obiektywem mikroskopu. Każdy panel pokazuje wyniki pomiarów dla pojedynczych kulek styropianowych o różnych średnicach.

Wstawki pokazują odpowiednie mikroskopowe obrazy cząstek. Paski skali na wszystkich obrazach mają długość pięciu mikrometrów. Wykreślone w tym miejscu jest nachylenie dopasowanej linii przez początek układu współrzędnych na poprzednich wykresach w funkcji wielkości cząstek.

Do pułapkowania plazmonicznego. Słupki błędów pokazują odchylenia standardowe pasowań liniowych. Wyniki pokazują, że większe cząstki wymagają większej intensywności lasera, aby utrzymać odpowiednią stabilność wychwytywania.

Ten schemat przedstawia ulepszone pułapkowanie optyczne wykorzystujące okresowe nanostruktury 1D. Padająca wiązka jest odchylana przez okresową nanostrukturę w dalekim polu. Pokazano tutaj rozkład natężenia światła z dwiema ortogonalnymi polaryzacjami na powierzchni gradacji aluminium.

Przy okresie 417 nanometrów uzyskanym za pomocą symulacji w dziedzinie czasu różnicy skończonej, rozkład jest znormalizowany do intensywności na płaskiej powierzchni aluminiowej. Liczby te pokazują potencjał wychwytywania cząstek znajdujących się bezpośrednio nad powierzchnią sortowania w porównaniu z lokalizacją cząstki. W przypadku kulki polistyrenowej CA 350 nanometrów i kulki polistyrenowej DA o długości jednego mikrometra białe kółka ilustrują rozmiary cząstek.

Wstawki pokazują potencjał uwięzienia nad płaską powierzchnią aluminiową. Dla tej samej wielkości cząstek, co porównania. Wartości są znormalizowane dla każdej wielkości cząstek.

Dla wszystkich figur symulacyjnych FDTD pole widzenia wynosi 10 na osiem mikrometrów kwadratowych. Oto skuteczność pułapki i minimalna intensywność pułapkowania mierzona dla kulek polistyrenowych o różnych rozmiarach przy polaryzacji wiązki prostopadłej do linii sortowania. Wstawka pokazuje asymetrię pułapek w skuteczności zalewkowania dla przekładania kulki polistyrenowej o grubości 3,87 mikrometra, prostopadle i równolegle do zasad klasyfikacji.

Oto schematyczne przedstawienie kąta translacji cząstki. Ta wstawka pokazuje wzmocnienie w funkcji kierunku translacji dla różnych polaryzacji i rozmiarów cząstek. Dużą asymetrię linii ciągłej uzyskuje się przy padającym świetle spolaryzowanym prostopadle do skarpy i linii przerywanej.

Niewielką asymetrię uzyskuje się przy padającym świetle spolaryzowanym równolegle do skarpy. Panele te reprezentują demonstrację zalewkowania fluorescencyjnego koralika polistyrenowego o długości 590 nanometrów. Czerwone kółko wskazuje położenie plamki lasera, ponieważ światło lasera było zbyt słabe, aby można je było zobaczyć na początku.

Cząstka jest uwięziona w miejscu przy większej mocy. Gdy moc jest obniżana, ruch Browna cząstki pokonuje siłę pułapki, umożliwiając ucieczkę cząstki. W tym przypadku uwięziono we fluorescencyjnym jądrze komórkowym raka jajnika, którego minimalna intensywność wymagana do zainicjowania pułapki wynosiła 16 mikrowatów na mikrometr kwadratowy uzyskany przy użyciu soczewki obiektywowej o powiększeniu 20x.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stworzyć pułapkę optyczną o niskiej intensywności do nieinwazyjnej manipulacji mikro i nano próbkami biologicznymi przy użyciu plazmonicznych i fotonicznych kryształów nanostrukturalnych.