Metodologia elastografii rezonansu magnetycznego w ocenie wzrostu konstruktów inżynierii tkankowej

W celu badania inżynieryjnych konstruktów tkankowych tradycyjne testy mechaniczne, które często prowadzą do zniszczenia próbki, nie są dopuszczalne. Niniejsza metoda wykorzystuje mikroskopową elastografię rezonansu magnetycznego, zwaną micro MRE, jako nieinwazyjną technikę pomiaru właściwości mechanicznych małych tkanek miękkich. W pierwszej kolejności komórki są osadzane na rusztowaniu z biomateriału w celu wytworzenia tkanki.

Tkankę zawiesza się w żelu aros, a końcówkę aktuatora umieszcza się w żelu. Następnie, aby scharakteryzować ruch, jest on przenoszony z aktuatora na próbkę i wykrywany za pomocą laserowego wibrometru Dopplera.

Próbkę i siłownik przenosi się do magnesu i urządzenia do rezonansu magnetycznego. Wykonywane są obrazy elastograficzne. Analiza uzyskanych obrazów wykazuje zmianę sztywności ścinania zarówno dla konstruktów osteogennych, jak i adipogennych.

Najpierw opracowaliśmy koncepcję tej techniki, obserwując zastosowanie rezonansu magnetycznego w diagnostyce chorób, i uznaliśmy, że można ją rozszerzyć na inżynierię tkankową. Główną zaletą tej metody w porównaniu z innymi istniejącymi technikami, takimi jak testy mechaniczne, jest zastosowanie nieinwazyjnej technologii MRI do badania głównych właściwości mechanicznych tkanek. Zastosowania tej techniki obejmują inżynierię tkankową, ponieważ znajomość właściwości mechanicznych zapewni odpowiedniość materiałów do ich zamierzonych zastosowań w inżynierii kości i chrząstek.

Chociaż metody te dostarczają cennych informacji w dziedzinie inżynierii tkankowej, mogą one być również wykorzystywane do diagnozowania chorób różnych narządów, na przykład włóknienia wątroby, urazów mózgu czy nowotworów mózgu. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ obejmuje ona etapy trudne do opanowania oraz wymaga wcześniejszej wiedzy z zakresu inżynierii tkankowej i obrazowania rytmu wielkościowego (magnitude rhythm imaging). Proces przygotowania konstruktu tkankowego składa się z trzech głównych etapów: ekspansji populacji komórek, wysiewania komórek na rusztowanie z biomateriału oraz różnicowania z wykorzystaniem cząsteczek sygnałowych.

Po hodowli i namnożeniu linii komórkowej, wysiać ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste lub HMCs na gąbkę żelatynową z gęstością 1 × 10⁶ komórek/ml w celu indukcji kostnienia. Około trzech dni później komórki powinny osiągnąć konfluencję na rusztowaniu, aby zaindukować różnicowanie. Usunąć pożywkę i zastąpić ją pożywką indukującą różnicowanie w tkankę tłuszczową.

Następnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez trzy dni. Wymienić pożywkę na pożywkę konserwującą, która składa się z pożywki do ekspansji zawierającej 10 µg/mL ludzkiej rekombinowanej insuliny. Po 24-godzinnej inkubacji wymienić pożywkę konserwującą na pożywkę indukcyjną.

Powtórz ten cykl trzykrotnie. Następnie wymieniaj podłoże utrzymujące co dwa dni przez cztery tygodnie, aby zindukować osteogenezę. Przez cały czas trwania badania wymieniaj podłoże na świeże podłoże osteogenne co dwa dni.

W niniejszym badaniu czas trwania wynosi cztery tygodnie, a MRE jest wykonywana w każdym tygodniu. Elastografia rezonansu magnetycznego opiera się na propagacji mechanicznych fal ścinających w celu oceny lokalnych wartości właściwości mechanicznych. W związku z tym wibracje mechaniczne muszą zostać wygenerowane i scharakteryzowane w badanej tkance przy użyciu aktuatora piezoelektrycznego. Aby przygotować próbkę, przenieś hodowlę tkankową do probówki o średnicy 10 mm zawierającej stałą podstawę oraz warstwę 0,5% żelu AGROS.

Następnie dodaj ciepły 0,5% acro gel, aby go zabezpieczyć. Pozostaw acro gel na pięć minut do stężenia.

W temperaturze pokojowej wprowadź końcówkę piezoelektrycznego silnika giętego w powierzchnię żelu. Następnie przymocuj probówkę zawierającą próbkę oraz siłownik do sztywnego podparcia. Skieruj wiązkę laserowego barometru dopplerowskiego w stronę końcówki siłownika mechanicznego.

Dostosuj położenie układu, aby zoptymalizować siłę sygnału odbitego, która jest wyświetlana na barometrze. W celu maksymalizacji odbicia, w razie potrzeby użyj taśmy refleksyjnej, aby ustawić siłownik tak, by generował nieszkodliwe fale ścinające o znacznych amplitudach wynoszących około 250 micronów. Ustaw generator funkcji na sweep w żądanym zakresie częstotliwości, stosując napięcie pracy 20 volts peak to peak z sygnałem białego szumu.

W tym doświadczeniu pożądanym zakresem częstotliwości jest od 20 do 2000 hertz. Aby wyświetlić scharakteryzowane widmo w programie Polytech Rsof, należy wybrać tryb wyświetlania prędkości i FFT. Następnie rozpoczęto przechwytywanie sygnału i zidentyfikowano częstotliwość rezonansową układu na podstawie pików widma.

Następnie, aby zmierzyć wychylenie aktuatora, należy ustawić go tak, aby generował ciągły sygnał sinusoidalny o wyznaczonej częstotliwości rezonansowej. Przy zastosowaniu napięcia roboczego 200 V szczyt-szczyt, a następnie określając przemieszczenie generowane przez aktuator i przekazywane na powierzchnię żelu, należy ustawić program FiberSoft tak, aby wyświetlał FFT z przemieszczeniem na osi Y. Po zcharakteryzowaniu aktuatora należy umieścić probówkę zawierającą próbkę oraz aktuator w szczelinie 10 mm cewki RF, a następnie umieścić próbkę wraz z aktuatorem w centrum skanera MRI.

Wykonaj obraz skautowy w celu zidentyfikowania lokalizacji konstruktu. Po zlokalizowaniu konstruktu tkankowego ustaw parametry akwizycji. Typowy skan strzałkowy in vitro będzie miał czas repetycji wynoszący 1000 milisekund.

Czas echa od 20 do 40 milisekund, grubość warstwy od 0,5 do 1 milimetra i pole widzenia 12 na 10 milimetrów kwadratowych, przy rozmiarze macierzy 128 na 128 pikseli. W przypadku parametrów elastografii ustaw częstotliwość wzbudnika na wartość wyznaczoną podczas charakterystyki laserowego dopplerowskiego wibrometru. Dla tej próbki wymagana jest jedna para bipolarna przy amplitudzie gradientu 50 gaussów na centymetr i opóźnieniu MRE ustawionym na zero.

Przełącz generator funkcji w tryb serii (burst mode) i dostosuj jego parametry tak, aby odpowiadały parametrom akwizycji elastografii, w tym częstotliwości oraz liczbie cykli. Następnie ustaw generator funkcji na wyzwalanie zewnętrzne. Aby uzyskać obraz w płaszczyźnie strzałkowej, ustaw czułość na ruch w dodatnim kierunku przekroju i rozpocznij skanowanie po dokonaniu akwizycji.

Sprawdź obraz, aby ocenić jakość sygnału w konstrukcie tkankowym. Jeśli obraz wydaje się zbyt ciemny, dostosuj parametry MR i wykonaj kolejny skan. Następnie zmień sensybilizację na ujemny kierunek przekroju.

Przenieś pliki ze skanera MRI na inny komputer wyposażony w program MATLAB i uruchom program MATLAB, który wykona złożony dzielenie w celu wygenerowania obrazu przedstawiającego propagację fal ścinających. Oceń obraz pod kątem obecności fal ścinających oraz możliwych artefaktów, takich jak zawijanie fazy; można wykreślić profile linii, aby lepiej ocenić jakość i amplitudę fali. Jeśli wystąpi zawijanie, zmniejsz amplitudę gradientu i wykonaj kolejny skan.

Jeśli nie są wymagane żadne korekty obrazu, ustaw rozmiar tablicy parametrów na osiem równomiernie rozmieszczonych wartości w zakresie od zera sekund do pełnego okresu charakteryzowanej częstotliwości rezonansowej. Po uzyskaniu obrazów przeprowadź skan w obu orientacjach przekrojów, dodatniej i ujemnej.

Należy użyć programu MATLAB zaprojektowanego do generowania danych fali ścinającej oraz odpowiadającego im filmu przedstawiającego propagację fali w próbce. Plik ten będzie niezbędny do oszacowania właściwości mechanicznych. Ostatnim krokiem MRE jest obliczenie sztywności ścinania na podstawie obrazów fali ścinającej.

Zacznij od wprowadzenia danych do programu MATLAB, który oceni trójwymiarowy zestaw danych; określ parametry obrazowania, w tym pole widzenia, gradient, amplitudę oraz liczbę par bipolarnych, a następnie uruchom kod. Algorytm umożliwia wybór obszarów zainteresowania, dla których obliczana jest średnia i odchylenie standardowe każdego parametru. Obrysuj kontury konstruktu tkankowego, aby wybrać obszar zainteresowania.

Wyświetlono średnią i odchylenie standardowe sztywności, modułu zachowawczego oraz modułu strat w wybranym obszarze zainteresowania. Program dostarcza również wyniki pośrednie, w tym falę po filtrowaniu, falę po filtrowaniu kierunkowym oraz profile liniowe, które pomagają w ocenie dokładności odzyskiwania danych. Dla uzyskania precyzyjnej oceny fala przefiltrowana musi być gładka.

Odchylenie standardowe parametru w określonym obszarze zainteresowania jest również wskaźnikiem jakości obliczeń; w razie potrzeby należy dostosować pozostałe parametry, aby uzyskać dokładne wartości właściwości mechanicznych, co pozwoli na obserwację zmian właściwości mechanicznych konstruktów inżynieryjnych w miarę ich rozwoju. Badania MRE przeprowadzono w okresie czterech tygodni. Niniejsza mapa rozwoju konstruktów przedstawia konstrukty adipogenne (oznaczone literą A) oraz osteogenne (oznaczone literą O) wraz z odpowiadającymi im obrazami amplitudy, obrazami fal ścinających, wartościami ELA oraz wyświetloną średnią sztywnością ścinania.

Mapa kolorów dla ELA odpowiada schematowi kolorystycznemu paska. Wykres i słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe w obrębie każdego regionu zainteresowania konstruktów. Z biegiem czasu konstrukty adipogenne stawały się mniej sztywne, wykazując właściwości podobne do tkanki tłuszczowej.

Podobnie konstrukty osteogenne stawały się sztywniejsze w ciągu czterech tygodni, co wskazywało na różnicowanie w kierunku tkanki kostnej. Po opanowaniu, technika ta może zostać wykonana w około dwie godziny, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pełne scharakteryzowanie aktuatora po zakończeniu procedury. Do odpowiedzi na pytania takie jak potwierdzenie depozycji minerałów można wykorzystać metody analizy biochemicznej oraz histologii.

Należy pamiętać, że praca z ludzkim materiałem komórkowym i urządzeniem MRI może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tych procedur należy przestrzegać odpowiednich środków ostrożności dotyczących poziomu BSL-2 oraz bezpieczeństwa MRI.