Name: Metodologia elastografii rezonansu magnetycznego do oceny wzrostu konstruktu opartego na inżynierii tkankowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Poznaj metodologię mikroskopowej elastografii rezonansu magnetycznego do nieinwazyjnej oceny właściwości mechanicznych inżynieryjnych konstruktów tkankowych adipogennych i osteogennych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te były częściowo wspierane przez NIH RO3-EB007299-02 oraz NSF EPSCoR First Award.

1. Przygotowanie konstrukcji tkankowej
 Proces przygotowania konstruktu tkankowego składa się z trzech głównych etapów: namnożenia populacji komórek, wysiewu komórek na rusztowanie z biomateriału oraz różnicowania z wykorzystaniem chemicznych cząsteczek sygnałowych. Procedura przygotowania konstruktu opiera się na metodach opracowanych przez Dennis et al., Hong et al. oraz Marion i Mao8,9,10.
 <ol>
 <li>Po wyhodowaniu i namnożeniu linii komórkowej, wysiej ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSCs) na gąbkę żelatynową (średnica 4 mm, grubość 3,5 mm) z gęstością 1x106 komórek/ml dla tworzenia kości oraz 3x106 komórek/ml dla tworzenia tkanki tłuszczowej.</li>
 <li>W celu różnicowania hMSCs w stronę adipocytów, po osiągnięciu przez komórki konfluencji na rusztowaniu, zastosuj pożywkę indukującą adipogenezę składającą się z 1 μM deksametazonu, 0,5 μM izobutylmetylksantyny, 10 μg/ml ludzkiej insuliny rekombinowanej oraz 200 μM indometacyny w pożywce do namnażania komórek. Po trzech dniach wymień pożywkę na pożywkę do namnażania z dodatkiem 10 μg/ml ludzkiej insuliny rekombinowanej na 24 godziny, a następnie powróć do pożywki indukującej. Powtórz ten cykl trzy razy, a następnie wymieniaj pożywkę wyłącznie na pożywkę utrzymującą co dwa dni.</li>
 <li>Aby indukować osteogenezę, przygotuj pożywkę indukującą osteogenezę, uzyskując końcowe stężenie 0,1 μM deksametazonu, 50 μM L-askorbinianu-2-fosforanu oraz 10 mM β-glicero-fosforanu w pożywce do namnażania komórek. Wymieniaj na świeżą pożywkę osteogenną co dwa dni.</li>
 </ol>
 2. Charakterystyka siłownika
 Charakterystyka siłownika jest kluczowym etapem eksperymentu MRE. Metoda MRE opiera się na propagacji mechanicznych fal ścinających w celu oceny lokalnych wartości właściwości mechanicznych; w związku z tym wibracje mechaniczne te muszą zostać wygenerowane i scharakteryzowane w badanej tkance przy użyciu siłownika piezoelektrycznego. Ilustracyjny przykład procesu charakterystyki przedstawiono na rysunku 3. Celem tej procedury jest optymalizacja ruchu siłownika w celu wygenerowania bezpiecznych fal ścinających o znaczących amplitudach (~250 micron).
 <ol>
 <li>Przed rozpoczęciem eksperymentu należy wprowadzić 0,5% żel agaryzowy do probówki o średnicy 10 mm, aby otoczyć konstrukcję. Temperatura żelu powinna wynosić około 37 °C, aby zminimalizować uszkodzenia konstrukcji. </li>
 <li>Po odczekaniu pięciu minut w temperaturze pokojowej do stężenia żelu agaryzowego, należy wprowadzić końcówkę piezoelektrycznego silnika zginającego w powierzchnię żelu. </li>
 <li>Probówkę zawierającą próbkę i aktuator należy przymocować do sztywnego wspornika, a wiązkę wibrometru laserowego Dopplera skierować na końcówkę aktuatora mechanicznego. Należy dostosować ustawienie systemu w celu optymalizacji sygnału odbitego, w razie potrzeby stosując taśmę refleksyjną. </li>
 <li>W oparciu o oczekiwaną częstotliwość rezonansową aktuatora mechanicznego, należy ustawić generator funkcji na skanowanie pożądanego zakresu częstotliwości (w tym eksperymencie od 20 do 2000 Hz), stosując napięcie robocze 20 Vpp z sygnałem szumu białego. </li>
 <li>Należy przeanalizować charakterystykę widma w programie Polytec Vibrosoft, aby zidentyfikować częstotliwość rezonansową układu, a w programie ustawić FFT oraz prędkość na osi y. </li>
 <li>W celu pomiaru przemieszczenia należy ustawić aktuator tak, aby generował ciągłą sinusoidę o wskazanej częstotliwości rezonansowej przy napięciu roboczym 200 Vpp, a następnie odnotować przemieszczenie przekazywane na powierzchnię żelu. W programie Vibrosoft należy ustawić wyświetlanie FFT z przemieszczeniem na osi y. </li>
 </ol>
 3. Pozyskiwanie obrazów
 <ol>
 <li>Po zakończeniu charakterystyki siłownika umieść próbkę i siłownik w centrum skanera MRI. W przypadku eksperymentów z konstruktami tkankowymi należy użyć małej i bardziej czułej cewki RF (w tym eksperymencie 10 mm) do nadawania i odbierania sygnału RF. (Przedstawiona procedura wykorzystuje magnes z pionową szczeliną 9.4 T wyposażony w gradienty trójosiowe, 100 G/cm). </li>
 <li>Wykonaj obraz zwiadowczy (scout image) w celu zidentyfikowania położenia konstruktu.</li>
 <li>Ustaw parametry akwizycji. Typowy skan strzałkowy in vitro będzie miał czas repetycji 1000 ms, czas echa 20-40 ms, grubość warstwy 0.5-1.0 mm oraz pole widzenia 12x10 mm2 przy rozmiarze macierzy 128x128 pikseli. </li>
 <li>W przypadku parametrów elastografii ustaw częstotliwość siłownika na wartość wyznaczoną podczas charakterystyki wibrometrem laserowym Dopplera. W niniejszym badaniu wymagana była jedna para bipolarna z amplitudą gradientu 50 G/cm. Inne parametry do dostrojenia obejmują opóźnienie, które dla początkowej akwizycji powinno zostać ustawione na zero milisekund.</li>
 <li>Przełącz generator funkcji w tryb seryjny (burst mode) i dostosuj jego parametry tak, aby były zgodne z parametrami akwizycji elastografii, w tym częstotliwość i liczbę cykli. Ponadto ustaw generator funkcji na wyzwalanie zewnętrzne. </li>
 <li>Dla obrazu strzałkowego ustaw sensybilizację na ruch w dodatnim kierunku warstwy i rozpocznij skanowanie. Po akwizycji sprawdź obraz i zmień sensybilizację na ujemny kierunek warstwy.</li>
 <li>Uruchom program MATLAB, który wykona dzielenie zespolone w celu wygenerowania obrazu fali poprzecznej.</li>
 <li>Oceń obraz pod kątem obecności fal poprzecznych oraz możliwych artefaktów, takich jak zawijanie fazy (phase wrapping).</li>
 <li>Jeśli korekty obrazu nie są konieczne, dostosuj rozmiar tablicy parametrów do ośmiu równomiernie rozmieszczonych wartości w zakresie od zera sekund do pełnego okresu wyznaczonej częstotliwości rezonansowej. </li>
 <li>Wykonaj skan w orientacji warstwy dodatniej i ujemnej.</li>
 <li>Po pozyskaniu obrazów użyj programu MATLAB zaprojektowanego do generowania danych o fali poprzecznej z serii obrazów.</li>
 </ol>
 4. Przetwarzanie obrazów z eksperymentu MRE
 <ol>
 <li>Ostatnim krokiem MRE jest obliczenie sztywności ścinania na podstawie obrazów fal ścinających. Następnie wprowadza się dane do programu MATLAB, który przeanalizuje trójwymiarowy zestaw danych (2 przestrzenne, 1 czasowe).</li>
 </ol>
 Uwaga: Przy założeniu płaskiej fali poprzecznej równania ruchu ulegają rozdzieleniu, co pozwala na oszacowanie zespolonego modułu ścinania jako funkcji przemieszczenia i jego laplasjanu. Algorytm przybliża drugie pochodne przestrzenne za pomocą różnic skończonych i oblicza moduł ścinania dla każdego piksela z osobna. Z tej liczby zespolonej można wyprowadzić wiele parametrów mechanicznych, takich jak prędkość fali poprzecznej, tłumienie fali, sztywność ścinania, sprężystość ścinania, lepkość ścinania itp. Algorytm umożliwia również wybór obszarów zainteresowania, dla których obliczane jest średnie i odchylenie standardowe każdego parametru.
 <ol start="2">
 <li>Parametry obrazowania należy określić na początku programu. Dodatkowo można dostosować górną granicę elastogramu, aby zoptymalizować kontrast w próbce.</li>
 </ol>
 Uwaga: Program dostarcza wyniki pośrednie (falę po filtrach dolnoprzepustowych, falę po filtrowaniu kierunkowym, czasową transformatę FFT, profile liniowe itp.), które pomagają użytkownikowi ocenić wierność odzyskiwania danych.
 <ol start="3">
 <li>Niektóre parametry można dostosować na podstawie tych informacji, np. poziomy filtrów dolnoprzepustowych, częstotliwość czasową ruchu, kierunek propagacji fali itp. Odchylenie standardowe parametru w konkretnym obszarze zainteresowania jest również wskaźnikiem jakości obliczeń. </li>
 </ol>
 5. Reprezentatywne wyniki
 Rysunek 4 przedstawia zmiany właściwości mechanicznych w ciągu czterech tygodni rozwoju konstruktów osteogennych i adipogennych. MRE przeprowadzono w zakresie 730-820 Hz. Choć obie zasiane gąbki startowały z poziomu około 3 kPa, tkanki kierowane w stronę osteogenną osiągnęły sztywność 22 kPa, podczas gdy w przypadku tkanek kierowanych w stronę adipogenną sztywność spadła do 1 kPa. Co więcej, konstrukty osteogenne wykazały znaczny spadek rozmiaru w porównaniu stanu początkowego do końcowego badania. Dodatkowe właściwości wynikające z badania elastograficznego przedstawiono w Tabeli 1.
 <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig1.jpg" alt="Schemat gradientu kontrastu fazowego MRI z uwrażliwieniem na ruch; wyniki obrazowania fal ścinających." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Proces akwizycji obrazów w elastografii rezonansu magnetycznego. Podczas akwizycji obrazu sekwencja impulsów (a) steruje synchronizacją (b) generatora funkcji z impulsami gradientów bipolarnych skanera MRI. Po akwizycji gradientów bipolarnych przełączanych w orientacjach dodatniej i ujemnej, (c) obraz fali ścinającej jest generowany przy użyciu dzielenia zespolonego.
 <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig2.jpg" alt="Schemat procesu obrazowania komórek z rusztowaniem, obrazem MR, elastogramem i barwieniem histologicznym." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Schemat procesu MRE dla konstruktów z inżynierii tkankowej. Najpierw komórki (a) są hodowane i namnażane do wielkości populacji niezbędnej dla projektowanego badania. Następnie komórki są wysiewane (b) na rusztowanie z biomateriału i stosuje się odczynniki chemiczne w celu indukcji różnicowania. Rusztowania są charakteryzowane metodą MRE, której pierwszym krokiem (c) jest wyznaczenie częstotliwości rezonansowej aktuatora sprzężonego z konstruktem. Następnie pozyskiwane są obrazy MRI (d) w celu wygenerowania obrazu fali poprzecznej (e). Na koniec stosuje się algorytm w celu uzyskania elastogramu (f), który mapuje sztywność konstruktu. Równolegle konstrukty są przecinane w celu oceny histologicznej (g), aby potwierdzić różnicowanie. 
 <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig3.jpg" alt="Dynamika konstrukcji tkankowej; układ piezoelektryczny, laserowy wibrometr dopplerowski, rezonans, przemieszczenie." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> Rysunek 3. Procedura charakterystyki siłownika. Rusztowanie żelatynowe jest zamknięte w 0,5% żelu agarozowym. Aby scharakteryzować ruch przenoszony do próbki, do układu wysyłany jest najpierw szum biały (1a), a powstały ruch jest wykrywany za pomocą laserowego wibrometru dopplerowskiego (1b). Po określeniu częstotliwości rezonansowej, wysyłany jest ciągły sygnał sinusoidalny o częstotliwości rezonansowej (2a), aby określić przemieszczenie (2b) przeniesione do środowiska żelatynowego. 
 <img src="/files/ftp_upload/3618/3618fig4.jpg" alt="Wykres elastografii fali poprzecznej; pomiary sztywności, skala kolorów, analiza z tygodni 0-4." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> Rysunek 4. Mapa rozwoju konstruktów w okresie czterech tygodni. Konstrukty adipogenne (A) i osteogenne (O) przedstawiono od lewej do prawej wraz z odpowiadającymi im obrazami amplitudy i fali poprzecznej, elastogramem oraz średnią sztywnością ścinania. Mapa kolorów elastogramu odpowiada schematowi kolorystycznemu wykresu słupkowego, a słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe w obrębie obszaru zainteresowania każdego konstruktu. 
<img src="/files/ftp_upload/3618/3618Table1.jpg" alt="Tabela sztywności i lepkości porównująca tkankę tłuszczową i kostną w ciągu pięciu tygodni, przedstawiająca wartości w kPa i Pa.s." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 1"> Tabela 1. Właściwości mechaniczne konstruktów tłuszczowych i kostnych w czterotygodniowym okresie wzrostu.

<ol><li>Xu, H., Othman, S. F., Magin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+tissue+engineering+using+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Monitoring tissue engineering using magnetic resonance imaging.</a> J. Biosci. Bioeng. 106, 515-527 (2008).</li>
<li>Xu, H., Othman, S. F., Hong, L., Peptan, I. A., Magin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+microscopy+for+monitoring+osteogenesis+in+tissue-engineered+construct+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance microscopy for monitoring osteogenesis in tissue-engineered construct in vitro.</a> Phys. Med. Biol. 51, 719-732 (2006).</li>
<li>Othman, S. F., Xu, H., Royston, T. J., Magin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+magnetic+resonance+elastography+%28microMRE%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Microscopic magnetic resonance elastography (microMRE.</a> Magn. Reson. Med. 54, 605-615 (2005).</li>
<li>Muthupillai, R., Lomas, D. J., Rossman, P. J., Greenleaf, J. F., Manduca, A., Ehman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+elastography+by+direct+visualization+of+propagating+acoustic+strain+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance elastography by direct visualization of propagating acoustic strain waves.</a> Science. 269, 1854-1857 (1995).</li>
<li>Othman, S. F., Curtis, E. T., Plautz, S. A., Pannier, A. P., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+elastography+monitoring+of+tissue+engineered+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance elastography monitoring of tissue engineered constructs.</a> NMR Biomed. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Oliphant, T. E., Manduca, A., Ehman, R. L., Greenleaf, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex-valued+stiffness+reconstruction+for+magnetic+resonance+elastography+by+algebraic+inversion+of+the+differential+equation%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Complex-valued stiffness reconstruction for magnetic resonance elastography by algebraic inversion of the differential equation.</a> Magn. Reson. Med. 45, 299-310 (2001).</li>
<li>Ringleb, S. I., Chen, Q., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L., An, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+shear+wave%3A+comparison+to+a+dynamic+shear+material+test%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Quantitative shear wave: comparison to a dynamic shear material test.</a> Magn. Reson. Med. 53, 1197-1201 (2005).</li>
<li>Hong, L., Peptan, I., Clark, P., Mao, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+adipose+tissue+engineering+by+human+marrow+stromal+cell+seeded+gelatin+sponge%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Ex vivo adipose tissue engineering by human marrow stromal cell seeded gelatin sponge.</a> Ann. Biomed. Eng. 33, 511-517 (2005).</li>
<li>Dennis, J. E., Haynesworth, S. E., Young, R. G., Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenesis+in+marrow-derived+mesenchymal+cell+porous+ceramic+composites+transplanted+subcutaneously%3A+effect+of+fibronectin+and+laminin+on+cell+retention+and+rate+of+osteogenic+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Osteogenesis in marrow-derived mesenchymal cell porous ceramic composites transplanted subcutaneously: effect of fibronectin and laminin on cell retention and rate of osteogenic expression.</a> Cell Transplant. 1, 23-32 (1992).</li>
<li>Marion, N. W., Mao, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells and tissue engineering.</a> Methods Enzymol. 420, 339-361 (2006).</li>
<li>Rydberg, J., Grimm, R., Kruse, S., Felmlee, J., McCracken, P., Ehman, R. L. Fast spin-echo magnetic resonance elastography of the brain. Proceedings of the International Society of Magnetic Resonance in Medicine, Glasgow, Scotland, , 1647-1647 (2001).</li>
<li>Kruse, S. A., Grim, R. C., Lake, D. S., Manduca, A., Ehman, R. L. Fast EPI based 3D MR elastography of the brain. Proceedings of the International Society for Magnetic Resonance in Medicine, Seattle, Washington, , 3385-3385 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

W niniejszej procedurze zaprezentowano proces MRE dla konstruktów inżynierii tkankowej, od przygotowania komórek po generowanie elastogramu. Dzięki zastosowaniu nieniszczącej metody oceny mechanicznej w procesie inżynierii tkankowej możliwe jest obecnie ocenianie zmian w konstruktach na wielu etapach ich rozwoju. Ponadto MRE uzupełnia inne metody MR służące do monitorowania konstruktów inżynierii tkankowej, takie jak dyfuzja, transfer magnetyzacji oraz analiza przesunięcia chemicznego1.
	<p class="jove_con...

<table><tbody><tr><td>Zestaw MSCGM-Bullet</td><td>Odczynnik</td><td>Lonza Inc.</td><td>PT-3001</td><td>Przechowywać w 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>1X DPBS</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300-054</td><td>Przechowywać w -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2915</td><td></td></tr><tr><td>3-izobutyl-1-metyloksantyna</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td>Przechowywać w -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Insulina z trzustki bydlęcej</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>Przechowywać w -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Indometacyna</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#914;-glicerynian</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9891</td><td></td></tr><tr><td>L-Kwas askorbiniowy 2-fosforan</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Rusztowanie</td><td>Pharmacia Corporation (Pfizer)</td><td>09-0315-08</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste</td><td>Linia komórkowa</td><td>Lonza Inc.</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>Skaner MR 9.4T</td><td>Urządzenie</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>400MHz WB</td></tr><tr><td>Cewka Litz 10mm</td><td>Urządzenie</td><td>Doty Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laserowy wibrometr dopplerowski</td><td>Urządzenie</td><td>Polytec</td><td>PDV-100</td><td></td></tr><tr><td>Vibrosoft (20)</td><td>Oprogramowanie</td><td>Polytec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Generator funkcji</td><td>Urządzenie</td><td>Agilent Technologies</td><td>AFG 3022B</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Urządzenie</td><td>Piezo Inc.</td><td>EPA-104-115</td><td></td></tr><tr><td>Piezoelektryczny silnik zginający</td><td>Urządzenie</td><td>Piezo Inc.</td><td>T234-A4Cl-203X</td><td></td></tr><tr><td>Komputer-Linux</td><td>Urządzenie</td><td>Intel</td><td></td><td>Procesor: Intel Core 2 Duo E8400, Pamięć: 2G</td></tr><tr><td>Komputer-Windows</td><td>Urządzenie</td><td>Intel</td><td></td><td>Procesor: Intel Core 2 Duo E8400, Pamięć: 2G</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Oprogramowanie</td><td>Mathworks</td><td></td><td>2009b</td></tr></tbody></table>

metodologia elastografii rezonansu magnetycznego w ocenie wzrostu konstruktów inżynierii tkankowej

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Tradycyjne badania mechaniczne często prowadzą do zniszczenia próbki, a w przypadku długoterminowych badań nad konstruktami z inżynierii tkankowej stosowanie niszczących metod oceny jest nieakceptowalne. Zaproponowaną alternatywą jest wykorzystanie procesu obrazowania zwanego elastografią rezonansu magnetycznego. Elastografia jest nieniszczącą metodą określania efektów inżynieryjnych poprzez pomiar lokalnych wartości właściwości mechanicznych (np. zespolonego modułu ścinania), które są kluczowymi markerami identyfikującymi strukturę i funkcjonalność tkanki. Jako nieinwazyjny środek oceny, monitorowanie konstruktów inżynieryjnych za pomocą technik obrazowania, takich jak obrazowanie rezonansem magnetycznym (MRI), budzi coraz większe zainteresowanie w ciągu ostatniej dekady1. Na przykład techniki rezonansu magnetycznego (MR), takie jak dyfuzja i relaksometria, pozwoliły na scharakteryzowanie zmian właściwości chemicznych i fizycznych podczas rozwoju inżynieryjnej tkanki2. Metoda zaproponowana w poniższym protokole wykorzystuje mikroskopową elastografię rezonansu magnetycznego (μMRE) jako nieinwazyjną technikę opartą na MR do pomiaru właściwości mechanicznych małych tkanek miękkich3. MRE uzyskuje się poprzez sprzęgnięcie sonicznego aktuatora mechanicznego z badaną tkanką i rejestrację propagacji fal ścinających za pomocą skanera MR4. Niedawno μMRE zastosowano w inżynierii tkankowej w celu pozyskania istotnych informacji o wzroście, które tradycyjnie mierzy się za pomocą niszczących makroskopowych technik mechanicznych5. W poniższej procedurze elastografię uzyskuje się poprzez obrazowanie konstruktów inżynieryjnych z wykorzystaniem zmodyfikowanej sekwencji spin-echo Hana sprzężonej z aktuatorem mechanicznym. Jak pokazano na Rysunku 1, zmodyfikowana sekwencja synchronizuje akwizycję obrazu z transmisją zewnętrznych fal ścinających; następnie ruch jest uwrażliwiany poprzez zastosowanie oscylujących par bipolarnych. Po zebraniu obrazów z dodatnią i ujemną sensybilizacją ruchu, zespolone dzielenie danych pozwala uzyskać obraz fali ścinającej. Następnie obraz jest analizowany przy użyciu algorytmu inwersji w celu wygenerowania mapy sztywności ścinania6. Wykazano, że otrzymane pomiary w każdym wokselu silnie korelują (R2&gt;0,9914) z danymi zebranymi za pomocą dynamicznej analizy mechanicznej7. W niniejszym badaniu elastografia została zintegrowana z procesem rozwoju tkanki w celu monitorowania różnicowania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC) w konstrukty adipogenne i osteogenne, co przedstawiono na Rysunku 2.

Procedura demonstruje metodologię elastografii rezonansu magnetycznego w celu monitorowania wyników inżynierii tkankowej konstruktów adypogennych i osteogennych poprzez nieinwazyjną lokalną ocenę właściwości mechanicznych z wykorzystaniem mikroskopowej elastografii rezonansu magnetycznego (μMRE).

Metodologia elastografii rezonansu magnetycznego w ocenie wzrostu konstruktów inżynierii tkankowej

Tradycyjne badania mechaniczne często prowadzą do zniszczenia próbki, a w przypadku długoterminowych badań nad konstruktami z inżynierii tkankowej zastosowanie...

W celu badania inżynieryjnych konstruktów tkankowych tradycyjne testy mechaniczne, które często prowadzą do zniszczenia próbki, nie są dopuszczalne. Niniejsza metoda wykorzystuje mikroskopową elastografię rezonansu magnetycznego, zwaną micro MRE, jako nieinwazyjną technikę pomiaru właściwości mechanicznych małych tkanek miękkich. W pierwszej kolejności komórki są osadzane na rusztowaniu z biomateriału w celu wytworzenia tkanki.Tkankę zawiesza się w żelu aros, a końcówkę aktuatora umieszcza się w żelu. Następnie, aby scharakteryzować ruch, jest on przenoszony z aktuatora na próbkę i wykrywany za pomocą laserowego wibrometru Dopplera.Próbkę i siłownik przenosi się do magnesu i urządzenia do rezonansu magnetycznego. Wykonywane są obrazy elastograficzne. Analiza uzyskanych obrazów wykazuje zmianę sztywności ścinania zarówno dla konstruktów osteogennych, jak i adipogennych.Najpierw opracowaliśmy koncepcję tej techniki, obserwując zastosowanie rezonansu magnetycznego w diagnostyce chorób, i uznaliśmy, że można ją rozszerzyć na inżynierię tkankową. Główną zaletą tej metody w porównaniu z innymi istniejącymi technikami, takimi jak testy mechaniczne, jest zastosowanie nieinwazyjnej technologii MRI do badania głównych właściwości mechanicznych tkanek. Zastosowania tej techniki obejmują inżynierię tkankową, ponieważ znajomość właściwości mechanicznych zapewni odpowiedniość materiałów do ich zamierzonych zastosowań w inżynierii kości i chrząstek.Chociaż metody te dostarczają cennych informacji w dziedzinie inżynierii tkankowej, mogą one być również wykorzystywane do diagnozowania chorób różnych narządów, na przykład włóknienia wątroby, urazów mózgu czy nowotworów mózgu. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ obejmuje ona etapy trudne do opanowania oraz wymaga wcześniejszej wiedzy z zakresu inżynierii tkankowej i obrazowania rytmu wielkościowego (magnitude rhythm imaging). Proces przygotowania konstruktu tkankowego składa się z trzech głównych etapów: ekspansji populacji komórek, wysiewania komórek na rusztowanie z biomateriału oraz różnicowania z wykorzystaniem cząsteczek sygnałowych.Po hodowli i namnożeniu linii komórkowej, wysiać ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste lub HMCs na gąbkę żelatynową z gęstością 1 × 10⁶ komórek/ml w celu indukcji kostnienia. Około trzech dni później komórki powinny osiągnąć konfluencję na rusztowaniu, aby zaindukować różnicowanie. Usunąć pożywkę i zastąpić ją pożywką indukującą różnicowanie w tkankę tłuszczową.Następnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez trzy dni. Wymienić pożywkę na pożywkę konserwującą, która składa się z pożywki do ekspansji zawierającej 10 µg/mL ludzkiej rekombinowanej insuliny. Po 24-godzinnej inkubacji wymienić pożywkę konserwującą na pożywkę indukcyjną.Powtórz ten cykl trzykrotnie. Następnie wymieniaj podłoże utrzymujące co dwa dni przez cztery tygodnie, aby zindukować osteogenezę. Przez cały czas trwania badania wymieniaj podłoże na świeże podłoże osteogenne co dwa dni.W niniejszym badaniu czas trwania wynosi cztery tygodnie, a MRE jest wykonywana w każdym tygodniu. Elastografia rezonansu magnetycznego opiera się na propagacji mechanicznych fal ścinających w celu oceny lokalnych wartości właściwości mechanicznych. W związku z tym wibracje mechaniczne muszą zostać wygenerowane i scharakteryzowane w badanej tkance przy użyciu aktuatora piezoelektrycznego. Aby przygotować próbkę, przenieś hodowlę tkankową do probówki o średnicy 10 mm zawierającej stałą podstawę oraz warstwę 0,5% żelu AGROS.Następnie dodaj ciepły 0,5% acro gel, aby go zabezpieczyć. Pozostaw acro gel na pięć minut do stężenia.W temperaturze pokojowej wprowadź końcówkę piezoelektrycznego silnika giętego w powierzchnię żelu. Następnie przymocuj probówkę zawierającą próbkę oraz siłownik do sztywnego podparcia. Skieruj wiązkę laserowego barometru dopplerowskiego w stronę końcówki siłownika mechanicznego.Dostosuj położenie układu, aby zoptymalizować siłę sygnału odbitego, która jest wyświetlana na barometrze. W celu maksymalizacji odbicia, w razie potrzeby użyj taśmy refleksyjnej, aby ustawić siłownik tak, by generował nieszkodliwe fale ścinające o znacznych amplitudach wynoszących około 250 micronów. Ustaw generator funkcji na sweep w żądanym zakresie częstotliwości, stosując napięcie pracy 20 volts peak to peak z sygnałem białego szumu.W tym doświadczeniu pożądanym zakresem częstotliwości jest od 20 do 2000 hertz. Aby wyświetlić scharakteryzowane widmo w programie Polytech Rsof, należy wybrać tryb wyświetlania prędkości i FFT. Następnie rozpoczęto przechwytywanie sygnału i zidentyfikowano częstotliwość rezonansową układu na podstawie pików widma.Następnie, aby zmierzyć wychylenie aktuatora, należy ustawić go tak, aby generował ciągły sygnał sinusoidalny o wyznaczonej częstotliwości rezonansowej. Przy zastosowaniu napięcia roboczego 200 V szczyt-szczyt, a następnie określając przemieszczenie generowane przez aktuator i przekazywane na powierzchnię żelu, należy ustawić program FiberSoft tak, aby wyświetlał FFT z przemieszczeniem na osi Y. Po zcharakteryzowaniu aktuatora należy umieścić probówkę zawierającą próbkę oraz aktuator w szczelinie 10 mm cewki RF, a następnie umieścić próbkę wraz z aktuatorem w centrum skanera MRI.Wykonaj obraz skautowy w celu zidentyfikowania lokalizacji konstruktu. Po zlokalizowaniu konstruktu tkankowego ustaw parametry akwizycji. Typowy skan strzałkowy in vitro będzie miał czas repetycji wynoszący 1000 milisekund.Czas echa od 20 do 40 milisekund, grubość warstwy od 0,5 do 1 milimetra i pole widzenia 12 na 10 milimetrów kwadratowych, przy rozmiarze macierzy 128 na 128 pikseli. W przypadku parametrów elastografii ustaw częstotliwość wzbudnika na wartość wyznaczoną podczas charakterystyki laserowego dopplerowskiego wibrometru. Dla tej próbki wymagana jest jedna para bipolarna przy amplitudzie gradientu 50 gaussów na centymetr i opóźnieniu MRE ustawionym na zero.Przełącz generator funkcji w tryb serii (burst mode) i dostosuj jego parametry tak, aby odpowiadały parametrom akwizycji elastografii, w tym częstotliwości oraz liczbie cykli. Następnie ustaw generator funkcji na wyzwalanie zewnętrzne. Aby uzyskać obraz w płaszczyźnie strzałkowej, ustaw czułość na ruch w dodatnim kierunku przekroju i rozpocznij skanowanie po dokonaniu akwizycji.Sprawdź obraz, aby ocenić jakość sygnału w konstrukcie tkankowym. Jeśli obraz wydaje się zbyt ciemny, dostosuj parametry MR i wykonaj kolejny skan. Następnie zmień sensybilizację na ujemny kierunek przekroju.Przenieś pliki ze skanera MRI na inny komputer wyposażony w program MATLAB i uruchom program MATLAB, który wykona złożony dzielenie w celu wygenerowania obrazu przedstawiającego propagację fal ścinających. Oceń obraz pod kątem obecności fal ścinających oraz możliwych artefaktów, takich jak zawijanie fazy; można wykreślić profile linii, aby lepiej ocenić jakość i amplitudę fali. Jeśli wystąpi zawijanie, zmniejsz amplitudę gradientu i wykonaj kolejny skan.Jeśli nie są wymagane żadne korekty obrazu, ustaw rozmiar tablicy parametrów na osiem równomiernie rozmieszczonych wartości w zakresie od zera sekund do pełnego okresu charakteryzowanej częstotliwości rezonansowej. Po uzyskaniu obrazów przeprowadź skan w obu orientacjach przekrojów, dodatniej i ujemnej.Należy użyć programu MATLAB zaprojektowanego do generowania danych fali ścinającej oraz odpowiadającego im filmu przedstawiającego propagację fali w próbce. Plik ten będzie niezbędny do oszacowania właściwości mechanicznych. Ostatnim krokiem MRE jest obliczenie sztywności ścinania na podstawie obrazów fali ścinającej.Zacznij od wprowadzenia danych do programu MATLAB, który oceni trójwymiarowy zestaw danych; określ parametry obrazowania, w tym pole widzenia, gradient, amplitudę oraz liczbę par bipolarnych, a następnie uruchom kod. Algorytm umożliwia wybór obszarów zainteresowania, dla których obliczana jest średnia i odchylenie standardowe każdego parametru. Obrysuj kontury konstruktu tkankowego, aby wybrać obszar zainteresowania.Wyświetlono średnią i odchylenie standardowe sztywności, modułu zachowawczego oraz modułu strat w wybranym obszarze zainteresowania. Program dostarcza również wyniki pośrednie, w tym falę po filtrowaniu, falę po filtrowaniu kierunkowym oraz profile liniowe, które pomagają w ocenie dokładności odzyskiwania danych. Dla uzyskania precyzyjnej oceny fala przefiltrowana musi być gładka.Odchylenie standardowe parametru w określonym obszarze zainteresowania jest również wskaźnikiem jakości obliczeń; w razie potrzeby należy dostosować pozostałe parametry, aby uzyskać dokładne wartości właściwości mechanicznych, co pozwoli na obserwację zmian właściwości mechanicznych konstruktów inżynieryjnych w miarę ich rozwoju. Badania MRE przeprowadzono w okresie czterech tygodni. Niniejsza mapa rozwoju konstruktów przedstawia konstrukty adipogenne (oznaczone literą A) oraz osteogenne (oznaczone literą O) wraz z odpowiadającymi im obrazami amplitudy, obrazami fal ścinających, wartościami ELA oraz wyświetloną średnią sztywnością ścinania.Mapa kolorów dla ELA odpowiada schematowi kolorystycznemu paska. Wykres i słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe w obrębie każdego regionu zainteresowania konstruktów. Z biegiem czasu konstrukty adipogenne stawały się mniej sztywne, wykazując właściwości podobne do tkanki tłuszczowej.Podobnie konstrukty osteogenne stawały się sztywniejsze w ciągu czterech tygodni, co wskazywało na różnicowanie w kierunku tkanki kostnej. Po opanowaniu, technika ta może zostać wykonana w około dwie godziny, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pełne scharakteryzowanie aktuatora po zakończeniu procedury. Do odpowiedzi na pytania takie jak potwierdzenie depozycji minerałów można wykorzystać metody analizy biochemicznej oraz histologii.Należy pamiętać, że praca z ludzkim materiałem komórkowym i urządzeniem MRI może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tych procedur należy przestrzegać odpowiednich środków ostrożności dotyczących poziomu BSL-2 oraz bezpieczeństwa MRI.

magnetic-resonance-elastography-methodology-for-evaluation-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Metodologia Elastografii Rezonansowej Magnetycznej w ocenie wzrostu tkankowego konstruktu inżynierii tkankowej

Dokładna i praktyczna metoda pomiaru parametrów takich jak odkształcenie (strain) w tkance mięśnia sercowego ma dużą wartość kliniczną, ponieważ wykazano, że odkształcenie jest czulszym i wcześniejszym markerem dysfunkcji kurczliwości niż często stosowany parametr EF.

Ocena odkształcenia mięśnia sercowego w rezonansie magnetycznym z wykorzystaniem śledzenia cech (feature tracking)

Źródło: Feng, Y., et al. Lepkosprężysta charakterystyka fantomów żelatynowych naśladujących tkanki miękkie przy użyciu elastografii wgłębień i rezonansu magnetycznego. J. Vis. Exp. (2022) Ten film przedstawia metodę elastografii rezonansu magnetycznego (MRE) do oceny właściwości lepkosprężystych tkanek poprzez analizę Rozchodzenie się fali ścinającej przez fantom żelatynowy, naśladujące tkankę mózgową. Proces ten polega na generowaniu i wychwytywaniu fal poprzecznych za pomocą rezonansu...

Elastografia rezonansu magnetycznego do oceny właściwości lepkosprężystych

Mikroreologia śledząca cząstki może być wykorzystana do nieniszczącego ilościowego i przestrzennego mapowania zmian właściwości mechanicznych macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3D nowotworów.

Podłużny pomiar sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3D guzów przy użyciu mikroreologii śledzenia cząstek

Opisujemy, jak uzyskać mapy parametryczne i wektorowe tensora dyfuzji piersi za pomocą rezonansu magnetycznego. Protokół i końcowe wyniki po przetworzeniu obrazowania są dostosowane do śledzenia cech architektonicznych piersi i wykrywania nowotworu złośliwego piersi.

Śledzenie cech architektonicznych sutka i wykrywanie raka piersi za pomocą obrazowania tensora dyfuzji rezonansu magnetycznego

Prezentowany tutaj jest protokół generowania zmodyfikowanych tkanek łącznych do równoległej hodowli 48 tkanek na wielodołkowej płytce z podwójnymi biegunami, odpowiedni do badań mechanistycznych, modelowania chorób i badań przesiewowych. Protokół jest zgodny z fibroblastami z różnych narządów i gatunków, a jego przykładem są tutaj pierwotne fibroblasty serca ludzkiego.

Tkanka łączna pochodząca z fibroblastów pochodząca od człowieka do zastosowań przesiewowych

Ten artykuł przedstawia demonstrację i podsumowanie protokołów tworzenia fantomów żelatynowych, które naśladują tkanki miękkie, oraz odpowiadającą im charakterystykę lepkosprężystą za pomocą elastografii wgłębień i rezonansu magnetycznego.

Lepkosprężysta charakterystyka fantomów żelatynowych naśladujących tkanki miękkie przy użyciu elastografii wgłębień i rezonansu magnetycznego

Ten protokół dostarcza metod generowania tkanek serca i mięśni szkieletowych w inżynierii 3D oraz opisuje ich zastosowanie w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków. Opisane metody wykorzystują system detekcji magnetycznej, aby ułatwić jednoczesną ocenę 24 tkanek równolegle.

Przedkliniczne testy leków w skalowalnych tkankach mięśniowych modyfikowanych w 3D

Celem tego badania było opracowanie nowatorskiego trójwymiarowego cyfrowego modelu do wczesnej diagnozy zwłóknienia wątroby, który obejmuje sztywność każdego woksela w wątrobie pacjenta i dlatego może być wykorzystany do obliczenia proporcji dystrybucji wątroby pacjenta w różnych stadiach zwłóknienia.

Trójwymiarowy cyfrowy model do wczesnej diagnostyki zwłóknienia wątroby w oparciu o elastografię rezonansu magnetycznego

Przedstawiamy dynamiczną i odwracalną platformę do testowania sztywności wykonaną z ultramiękkiego silikonowego elastomeru (polidimetylosiloksan, PDMS) z osadzonymi cząstkami żelaza. Ten nowatorski test nadaje się do badania pojawiających się czasowo zależnych zmian fizycznych w fenotypach komórek, w tym naprowadzania kontaktowego. Tutaj mierzymy wyrównanie kardiomiocytów noworodków szczurów po usztywnieniu macierzy za pomocą magnetyki.

Mikrowzorowane elastomery magneto-reologiczne do wywoływania zmian w ustawieniu kardiomiocytów

Ponownie pojawiło się zainteresowanie rozwojem zaworów polimerowych. W tym przypadku celem jest wykazanie wykonalności modyfikacji komercyjnego powielacza impulsów w celu dostosowania go do geometrii trójulotkowej oraz zdefiniowanie protokołu prezentacji danych hydrodynamicznych zaworów polimerowych w porównaniu z danymi natywnymi i protezowymi zastawek zebranymi w niemal identycznych warunkach.

Protokół względnej oceny hydrodynamicznej trójpłatkowych zaworów polimerowych

Poznaj metodologię mikroskopowej elastografii rezonansu magnetycznego do nieinwazyjnej oceny właściwości mechanicznych inżynieryjnych konstruktów tkankowych adipogennych i osteogennych.

Metodologia elastografii rezonansu magnetycznego w ocenie wzrostu konstruktów inżynierii tkankowej

Przeglądaj więcej filmów