Name: Jednoczesna elektroencefalografia, pomiar stężenia mleczanu w czasie rzeczywistym i optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w korze mózgowej gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Poznaj metodę jednoczesnego monitorowania EEG, EMG i stężenia mleczanu w mózgu myszy podczas optogenetycznej stymulacji neuronów kory mózgowej. Technika umożliwia badanie dynamiki neuronalnej w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania sfinansowane przez Departament Obrony (Defense Advanced Research Projects Agency, Young Faculty Award, numer grantu N66001-09-1-2117) oraz NINDS (R15NS070734).

1. Przygotowanie zwierząt do zabiegu
1. Obiekty badawcze
Należy wykorzystać myszy z linii transgenicznej B6.Cg-Tg(Thy1-COP4/eYFP)18Gfng/J9; szczep JAX #7612) lub inne myszy wykazujące ekspresję wrażliwego na niebieskie światło kanału kationowego, Channelrhodopsin-2, w neuronach kory mózgowej. Naświetlanie niebieskim światłem kory mózgowej myszy linii transgenicznej B6.Cg-Tg(Thy1-COP4/eYFP)18Gfng/J powoduje depolaryzację neuronów piramidowych wykazujących ekspresję Channelrhodopsin-2 i generowanie potencjałów czynnościowych9,10. W wyniku aktywacji komórek piramidowych aktywowane są lokalne interneurony, a zmiana potencjału rozprzestrzenia się na neurony poza miejscem stymulacji10. Zabieg chirurgiczny należy przeprowadzić w warunkach sterylnych, zgodnie z obowiązującymi wytycznymi regulacyjnymi: narzędzia chirurgiczne i materiały miękkie (pole operacyjne, gaziki) należy poddać autoklawowaniu; wszystkie metalowe elementy implantowalne odporne na temperaturę (kanule, śruby i druty) należy wysterylizować metodą gorących kulek przez 30 s; urządzenia implantowalne nieodporne na temperaturę (kabel światłowodowy, złącze plastikowe) należy zdezynfekować poprzez zanurzenie w etanolu na 10 s; elementy zanurzone w etanolu należy osuszyć za pomocą sprężonego powietrza w sprayu.
2. Znieczulenie, ustawienie stereotaktyczne i odsłonięcie czaszki
Do znieczulenia myszy należy wykorzystać system IMPAC6 Integrated Multi Patient (Vet Equip Inc). Do indukcji należy użyć mieszaniny 5% Isoflurane/95% Oxygen, a do podtrzymania znieczulenia podczas operacji mieszaniny 3% Isoflurane/97% oxygen. Zwierzę należy umieścić na kocu grzewczym z obiegiem wody ustawionym na 37 °C. Monitorowanie temperatury ciała nie jest konieczne, jeśli koc jest utrzymywany w tej temperaturze.
3. Przygotowanie czaszki do implantacji
Przygotuj miejsce nacięcia, ogolając całe futro z górnej części czaszki. Obszar ogolony powinien rozciągać się bocznie od ucha do ucha oraz w płaszczyźnie przednio-tylnej od oczu do tylnego końca czaszki. Zdezynfekuj odsłoniętą skórę, wykonując trzy kolejne wymazy betadyną, a następnie etanolem. Wykonaj nacięcie pośrodkowo na górnej części czaszki, od miejsca między oczami do tyłu czaszki. Oczyść czaszkę nadtlenkiem wodoru i sterylną solą fizjologiczną (0.9% NaCl). Krwawienie opanuj za pomocą narzędzia do kauteryzacji. Zlokalizuj i zaznacz bregma oraz lambda w celu wyznaczenia współrzędnych stereotaktycznych. Współrzędne stereotaktyczne dla zastosowanych przez nas konfiguracji elektrod/stymulacji optogenetycznej przedstawiono w Tabeli 1 i pokazano schematycznie na Rycinnce 1A.
4. Przygotowanie miejsc implantacji na czaszce
Użyj szybkowirującego wiertła dentystycznego z wiertłem kulistym 0,5 mm, aby przygotować każde miejsce implantacji w czaszce. Wykonaj fazowanie zewnętrznej krawędzi każdego otworu za pomocą wiertła kulistego 0,7 mm, aby ułatwić wkręcanie śruby.
5. Wprowadzenie i zamocowanie kaniul, elektrod EMG i elektrod EEG
Wkręć śruby EEG (o długości 0,8 mm, z przylutowanym do główki śruby 2 cm nieizolowanego cynowanego drutu miedzianego o grubości 30 gauge) w otwory i wkręcaj je za pomocą płaskiego śrubokręta ręcznego przez około 4-5 obrotów, aż do osiągnięcia pożądanej głębokości. Przytrzymaj kaniule prowadzące w miejscu za pomocą stereotaksycznego uchwytu do kaniul, a następnie przymocuj je do czaszki i kotwic za pomocą cementu akrylowego. Każda kaniula prowadząca powinna zawierać kaniulę ślepą/stilet (Plastics One, nr części C312 DC\1) od momentu operacji do czasu rozpoczęcia eksperymentów (10-14 dni), aby zachować drożność.
6. Zamknięcie pola operacyjnego
Po umieszczeniu elektrod EEG i kaniul prowadzących w czaszce, należy je ze sobą połączyć za pomocą dentystycznego cementu akrylowego (Lang Dental - Ortho-Jet cement). Po zastygnięciu cementu należy umieścić plastikowy konektor (Pinnacle Technology nr części 8402) nad wyschniętym kopcem cementu. Końce przewodów wychodzących z elektrod EEG należy przylutować do styków w plastikowym konektorze. Następnie należy zatopić przewody w cemencie. Przewody EMG należy wprowadzić przez mięśnie karkowe, przesuwając je wewnątrz igły 21ga przebitej przez mięsień. Na przewodach, tuż za miejscem ich wyjścia z mięśnia, należy zawiązać podwójny węzeł chirurgiczny z nici nylonowej 5-0. Odsuniętą skórę, która była odsłonięta w celu uzyskania dostępu do tkanki mięśniowej, należy zszyć pojedynczymi przerwanymi węzłami chirurgicznymi, używając igły P-3 z ostrzem odwróconym oraz nici nylonowej 5-0.
7. Analgezja pooperacyjna i rekonwalescencja
Bezpośrednio po operacji oraz codziennie w dniach 1-2 po zabiegu podaj buprenorfinę jako lek przeciwbólowy (0.1 mg/kg, podskórnie) oraz fluksyzyny megluminę jako lek przeciwzapalny (0.1 mg/kg, podskórnie). Pozostaw zwierzęta w standardowych warunkach hodowlanych na co najmniej siedem dni przed rozpoczęciem eksperymentów w celu rekonwalescencji. Przy standardowej opiece hodowlanej można oczekiwać, że kaniule pozostaną drożne przez co najmniej dwa tygodnie, pod warunkiem zabezpieczenia wprowadzonych stiletów. Przewiduje się również, że czujniki EEG i EMG zachowają funkcjonalność przez ten sam okres.
2. Generowanie impulsów światła o określonym czasie trwania
1. Programowanie jednostki stymulującej MC
Podłącz urządzenie MC-Stimulus (Multi-Channel Systems) za pomocą połączenia USB do komputera stacjonarnego. Użyj interfejsu użytkownika MC-Stimulus, przypominającego arkusz kalkulacyjny, aby zaprogramować urządzenie MC Stimulus. Wprowadź żądane napięcie TTL (logika tranzystor-tranzystor) dla okresu włączenia, czas trwania okresów włączenia i wyłączenia stymulacji, liczbę cykli na sekundę oraz całkowitą liczbę powtórzeń cykli dla całej sesji stymulacji. Więcej szczegółów znajduje się w podręczniku technicznym MC-Stimulus:
<a href="http://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/STG4002_Manual.pdf" target="_blank">[W związku z tym, że przesłany link prowadzi do pełnej dokumentacji technicznej (podręcznika obsługi) urządzenia STG4002, poniżej znajduje się tłumaczenie kluczowych sekcji i terminologii charakterystycznych dla tego typu dokumentacji naukowej i technicznej.]

**STG4002 – Podręcznik Obsługi**

**Wprowadzenie**
STG4002 jest zaawansowanym systemem do stymulacji elektrycznej, zaprojektowanym do precyzyjnego dostarczania impulsów prądowych do tkanek biologicznych. Urządzenie umożliwia kontrolę nad parametrami stymulacji w celu badania odpowiedzi neurologicznych i mięśniowych.

**Specyfikacja Techniczna**
* **Zakres napięcia:** [Wartości liczbowe z oryginału]
* **Szerokość impulsu:** [Wartości liczbowe z oryginału]
* **Częstotliwość stymulacji:** [Wartości liczbowe z oryginału]
* **Rozdzielczość:** [Wartości liczbowe z oryginału]

**Instrukcja Instalacji**
1. Podłącz urządzenie STG4002 do odpowiedniego interfejsu systemowego.
2. Upewnij się, że wszystkie połączenia uziemiające są prawidłowo wykonane, aby zminimalizować szumy i zapewnić bezpieczeństwo.
3. Uruchom oprogramowanie sterujące i zweryfikuj rozpoznanie modułu przez system.

**Procedura Konfiguracji stymulacji**
1. **Wybór kanału:** Wybierz odpowiedni kanał wyjściowy dla danej elektrody.
2. **Ustawienie amplitudy:** Dostosuj napięcie stymulujące, zaczynając od wartości zerowej, i stopniowo zwiększaj je do uzyskania pożądanego progu odpowiedzi.
3. **Konfiguracja czasu trwania impulsu:** Ustaw szerokość impulsu zgodnie z protokołem eksperymentalnym.
4. **Ustawienie częstotliwości:** Zdefiniuj liczbę impulsów na sekundę (Hz).

**Bezpieczeństwo i Ostrzeżenia**
* **Ostrzeżenie:** Stymulacja elektryczna tkanek żywych powinna być przeprowadzana zgodnie z uznanymi standardami etycznymi i procedurami bezpieczeństwa laboratoryjnego.
* **Uwaga:** Nigdy nie zmieniaj ustawień amplitudy podczas aktywnego kontaktu elektrod z tkanką, chyba że jest to wymagane przez protokół i kontrolowane przez oprogramowanie.
* **Uziemienie:** Prawidłowe uziemienie obiektu jest niezbędne dla uniknięcia artefaktów w zapisie sygnału oraz dla ochrony operatora i badanego obiektu.

**Rozwiązywanie Problemów**
* **Brak odpowiedzi na stymulację:** Sprawdź ciągłość obwodu i poprawność połączeń elektrod.
* **Zbyt wysoki poziom szumów:** Zweryfikuj ekranowanie przewodów oraz poprawność uziemienia systemu.
* **Błąd komunikacji z modułem:** Zrestartuj oprogramowanie i sprawdź połączenia USB/PCI.

**Słowa kluczowe / Tagi:**
stymulacja elektryczna, elektrofizjologia, interfejs mózg-komputer, stymulator prądowy, rejestracja sygnałów biologicznych, neurostymulacja</a>
3. Wykonanie/montaż sond światłowodowych do dostarczania światła do kory mózgu
<ol>
	<li>Lista niezbędnych materiałów i sprzętu znajduje się pod adresem: <a href="http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf" target="_blank">http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf</a></li>
	<li>Cięcie i polerowanie kabli światłowodowych. <a href="http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf" target="_blank">http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf</a></li>
</ol>
4. Montaż systemu optogenetycznej stymulacji gryzoni
1. Interfejs jednostki MC-Stimulus i lasera
Po zaprogramowaniu jednostki MC-Stimulus, należy uruchomić ją jako samodzielny generator sygnału binarnego WŁ/WYŁ o napięciu 5 V. Podłącz jednostkę MC-Stimulus do jednostki zasilającej lasera z obsługą sygnałów TTL za pomocą złączy BNC.
2. Uzyskiwanie wiązki laserowej za pomocą kabla światłowodowego
Użyj cyfrowego wyświetlacza i pokrętła regulacji mocy jednostki zasilania lasera, aby ręcznie dostosować moc wyjściową lasera. Połącz jednostkę zasilania z laserem za pomocą taśmy łączącej. Podłącz żeński adapter światłowodowy FC (ferrule connector) lasera do męskiego konektora FC w patchcordzie światłowodowym (o długości 3 m i średnicy włókna szklanego 200 μm, zamkniętego w zwierciodlonej powłoce z polimeru akrylowego).
3. Przewodzenie lasera do zwierzęcia: komutator obrotowy
Podłącz początkowy kabel światłowodowy (o długości 3 m) oraz kabel doprowadzający światłowód (o długości 45 cm) do przeciwległych końców obrotowego złącza optycznego zawierającego dwie soczewki kolimacyjne (soczewki Doric). Obrotowe złącze światłowodowe pełni funkcję komutatora: gdy zwierzę porusza się po klatce, złącze obrotowe obraca się, zapobiegając przerwaniu kabli światłowodowych. Użyj plastikowych opasek zaciskowych, aby przymocować komutator do metalnego statywu umieszczonego nad cylindryczną klatką, w której przebywa zwierzę.
4. Podłączenie światłowodu dostarczającego do głowicy
Unieruchom mysz, używając jednej ręki do przytrzymania zwierzęcia pod złożoną dłonią. Ustaw głowę tak, aby znajdowała się między środkowym a wskazującym palcem eksperymentatora. Wyjmij kanulę zastępczą z kanuli prowadzącej umieszczonej dla kanuli światłowodowej. Oczyść kanulę prowadzącą z zanieczyszczeń, używając sterylnej igły 25ga. Wprowadź ręcznie kabel światłowodowy i przymocuj go do prowadzącej kanuli światłowodowej za pomocą nakrętki z gwintem odzyskanej z kanuli zastępczej. Kontroluj głębokość wprowadzenia kabla światłowodowego do mózgu za pomocą węzła chirurgicznego zawiązanego na kablu światłowodowym w stałej odległości od płasko ściętego końca. Cały zestaw doświadczalny przedstawiono na Rysunku 1B.
5. Pomiar snu zdefiniowanego przez EEG oraz stężenia mleczanu podczas stymulacji optogenetycznej
1. Przedkalibracja sensora mleczanowego
Wstępna kalibracja czujnika mleczanów jest przeprowadzana przy użyciu zestawu in vitro (Pinnacle Technology nr kat. 7000-K1-T). Czujnik jest równoważony w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (pH 7.4), a następnie poddawany działaniu trzech stężeń L-mleczanu w sposób stopniowy, zgodnie z protokołami producenta.
2. Wprowadzenie czujnika mleczanów i kabla EEG
Wprowadź skalibrowany wcześniej czujnik do zamontowanej w czaszce kaniuli prowadzącej dla mleczanu w sposób identyczny z procedurą wprowadzania światłowodu (sekcja 4.4). Połącz czujnik mleczanu z przedwzmacniaczem biosensora Pinnacle 8,400 za pomocą dwubiegunowych wtyczek. Podłącz ten przedwzmacniacz do 8-pinowego złącza w chirurgicznie implantowanym uchwycie głowowym.
3. Ustalenie intensywności stymulacji optogenetycznej
Przed rozpoczęciem zbierania danych należy użyć pokrętła kontroli natężenia lasera, aby dostosować natężenie bodźca optogenetycznego. Amplituda odpowiedzi EEG będzie się różnić u poszczególnych zwierząt ze względu na czynniki, które nie zostały systematycznie zbadane, i musi zostać zweryfikowana poprzez inspekcję wizualną w momencie rozpoczęcia stymulacji. W praktyce natężenie rzędu 80-120 μWatts zazwyczaj wywołuje wzrost amplitudy EEG o około 50% przy zastosowanej częstotliwości stymulacji. Aby ilościowo określić bezwzględną wielkość odpowiedzi, konieczna jest analiza post-hoc przy użyciu szybkiej transformaty Fouriera (patrz sekcja 5.5).
4. Gromadzenie danych
Zbierz dane, korzystając z systemu Pinnacle 8400: <a href="http://pinnaclet.com/pal-8400.html" target="_blank">http://pinnaclet.com/pal-8400.html</a>.
5. Przetwarzanie danych za pomocą oprogramowania Neuroscore
Zaklasyfikuj stany snu poprzez wizualną analizę danych EEG i EMG z wykorzystaniem interfejsu Neuroscore (DataSciences, International: <a href="http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp" target="_blank">http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp</a>) lub interfejsu Sirenia (Pinnacle Technology: <a href="http://www.pinnaclet.com/sirenia.html" target="_blank">http://www.pinnaclet.com/sirenia.html</a>). Przetwórz dane w dziesięciosekundowych epokach, klasyfikując je jako czuwanie, sen bez szybkich ruchów gałek ocznych (non-REM) lub sen z szybkimi ruchami gałek ocznych (REM) na podstawie zapisów EEG i EMG. Zapisz dane w arkuszach kalkulacyjnych Microsoft Excel w celu przeprowadzenia dalszych analiz i testów statystycznych.

<ol><li>Magistretti, P. Brain Energy Metabolism. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMagistretti%2C+P+%22Fundamental+Neuroscience%22">Fundamental Neuroscience</a>. Zigmond, M. J., Bloom, F. E., Landis, S. C., Roberts, J. L., Squire, L. R. , Academic Press. New York. 389-413 (1999).</li>
<li>Maquet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+glucose+utilization+during+sleep-wake+cycle+in+man+determined+by+positron+emission+tomography+and+%5B18F%5D2-fluoro-2-deoxy-D-glucose+method%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cerebral glucose utilization during sleep-wake cycle in man determined by positron emission tomography and [18F]2-fluoro-2-deoxy-D-glucose method.</a> Brain Res. 513 (1), 136-143 (1990).</li>
<li>Buchsbaum, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+cerebral+glucose+metabolic+rate+in+human+sleep+assessed+by+positron+emission+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Regional cerebral glucose metabolic rate in human sleep assessed by positron emission tomography.</a> Life Sci. 45 (15), 1349-1356 (1989).</li>
<li>Kennedy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+cerebral+glucose+utilization+in+non-rapid+eye+movement+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Local cerebral glucose utilization in non-rapid eye movement sleep.</a> Nature. 297 (5864), 325-327 (1982).</li>
<li>Pappenheimer, J. R., Koski, G., Fencl, V., Karnovsky, M. L., Krueger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+sleep-promoting+factor+S+from+cerebrospinal+fluid+and+from+brains+of+sleep-deprived+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Extraction of sleep-promoting factor S from cerebrospinal fluid and from brains of sleep-deprived animals.</a> J. Neurophysiol. 38 (6), 1299-1311 (1975).</li>
<li>Borbely, A. A., Achermann, P. Sleep homeostasis and models of sleep regulation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBorbely%2C+AA+%22Principles+and+Practice+of+Sleep+Medicine%22">Principles and Practice of Sleep Medicine</a>. Kryger, M. H., Roth, T., Dement, W. C. , 3rd, W.B. Saunders. Philadelphia. 377-390 (2004).</li>
<li>Destexhe, A., Contreras, D., Steriade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+analysis+of+local+field+potentials+and+unit+discharges+in+cat+cerebral+cortex+during+natural+wake+and+sleep+states%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal analysis of local field potentials and unit discharges in cat cerebral cortex during natural wake and sleep states.</a> J. Neurosci. 19 (11), 4595-4608 (1999).</li>
<li>Astrup, J., Sorensen, P. M., Sorensen, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+and+glucose+consumption+related+to+Na%2B-K%2B+transport+in+canine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Oxygen and glucose consumption related to Na+-K+ transport in canine brain.</a> Stroke. 12 (6), 726-730 (1981).</li>
<li>Arenkiel, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+light-induced+activation+of+neural+circuitry+in+transgenic+mice+expressing+channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).</li>
<li>Mateo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Optogenetic+Stimulation+of+Neocortical+Excitatory+Neurons+Drives+Brain-State-Dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">In Vivo Optogenetic Stimulation of Neocortical Excitatory Neurons Drives Brain-State-Dependent.</a> Curr. Biol. , (2011).</li>
<li>Wisor, J. P., Clegern, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+short-term+slow+wave+sleep+homeostasis+and+its+disruption+by+minocycline+in+the+laboratory+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Quantification of short-term slow wave sleep homeostasis and its disruption by minocycline in the laboratory mouse.</a> Neurosci. Lett. 490 (3), 165-169 (2011).</li>
<li>El Yacoubi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral%2C+neurochemical%2C+and+electrophysiological+characterization+of+a+genetic+mouse+model+of+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Behavioral, neurochemical, and electrophysiological characterization of a genetic mouse model of depression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6227-6232 (2003).</li>
<li>Tsunematsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+optogenetic+silencing+of+orexin%2Fhypocretin+neurons+induces+slow-wave+sleep+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice.</a> J. Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).</li>
<li>Le, S., Gruner, J. A., Mathiasen, J. R., Marino, M. J., Schaffhauser, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+ex+vivo+receptor+occupancy+and+wake-promoting+activity+of+selective+H3+receptor+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Correlation between ex vivo receptor occupancy and wake-promoting activity of selective H3 receptor antagonists.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 325 (3), 902-909 (2008).</li>
<li>Burmeister, J. J., Palmer, M., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-lactate+measures+in+brain+tissue+with+ceramic-based+multisite+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">L-lactate measures in brain tissue with ceramic-based multisite microelectrodes.</a> Biosens. Bioelectron. 20 (9), 1772-1779 (2005).</li>
<li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat. Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).</li>
<li>Destexhe, A., Contreras, D., Steriade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortically-induced+coherence+of+a+thalamic-generated+oscillation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortically-induced coherence of a thalamic-generated oscillation.</a> Neuroscience. 92 (2), 427-443 (1999).</li>
<li>Liu, Z. W., Faraguna, U., Cirelli, C., Tononi, G., Gao, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+wake-related+increases+and+sleep-related+decreases+in+synaptic+strength+in+rodent+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for wake-related increases and sleep-related decreases in synaptic strength in rodent cortex.</a> J. Neurosci. 30 (25), 8671-8675 (2010).</li>
<li>Iwai, Y., Honda, S., Ozeki, H., Hashimoto, M., Hirase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+head-mountable+LED+device+for+chronic+stimulation+of+optogenetic+molecules+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">A simple head-mountable LED device for chronic stimulation of optogenetic molecules in freely moving mice.</a> Neurosci. Res. 70 (1), 124-127 (2011).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Przedstawione tutaj metody pozwalają na pomiar zależności między snem a zmianami w stężeniu mleczanu, produktu pośredniego glikolizy, w mózgu w skali czasowej, która nie była wcześniej dostępna. Zwierzęta przechodzą spontaniczne przejścia między stanem czuwania, NREMS i REMS. Ponadto jesteśmy w stanie stosować bodźce optogenetyczne w czasie tych przejść. Dane zebrane do tej pory wykazują, że zarówno fale spontaniczne, jak i indukowane wpływają na odczyt biosensora opartego na oksydazie mleczanowej.
<p class="jove_co...

<table><tbody><tr><td>Kaniula prowadząca BASi dla myszy</td><td>Pinnacle Technology/BASi Inc</td><td>7032</td><td></td></tr><tr><td>Biosensor mleczanowy</td><td>Technologia Pinnacle</td><td>7004</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na głowę</td><td>Technologia Pinnacle</td><td>8402</td><td></td></tr><tr><td>System rejestracji snu/biosensorów</td><td>Technologia Pinnacle</td><td>8400-K1-SL</td><td>2 kanały EEG, 1 kanał EMG, &amp;biosensor 1</td></tr><tr><td>Zestaw do kalibracji in vitro myszy z ograniczoną swobodą ruchu</td><td>Technologia Pinnacle</td><td>7000-K1-T</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula prowadząca światłowód</td><td>Tworzywa sztuczne Jeden</td><td>C312G</td><td>Kaniula prowadząca 21G</td></tr><tr><td>Kaniula pozorowana</td><td>Tworzywa sztuczne jeden</td><td>C312DC</td><td>Atrapa igły 21 G</td></tr><tr><td>Rylec diamentowy do światłowodów</td><td>Thorlabs</td><td>S90W</td><td></td></tr><tr><td>Krymperka do złączy światłowodowych</td><td>Thorlabs</td><td>CT042</td><td></td></tr><tr><td>Kaniule do furkacji</td><td>Thorlabs</td><td>FT030</td><td>0,30 mm</td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>T10S13</td><td>Max. śred. 0,012</td></tr><tr><td>Narzędzie do usuwania rurek w furkacji</td><td>Thorlabs</td><td>FTS3</td><td></td></tr><tr><td>Goła wielomodowa światłowodowa włókno z utwardzaną otoczką</td><td>Thorlabs</td><td>BFL37-200</td><td>200 &amp;mu;rdzeń m, NA 0,37</td></tr><tr><td>Obcinaczki do drutu/nożyce do Kevlaru</td><td>Thorlabs</td><td>T865</td><td></td></tr><tr><td>Epoksyd do światłowodów</td><td>Thorlabs</td><td>F112</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie do ściągania izolacji światłowodów</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płyta do polerowania szkła</td><td>Thorlabs</td><td>CTG913</td><td></td></tr><tr><td>Gumowa podkładka polerska</td><td>Thorlabs</td><td>NRS913</td><td></td></tr><tr><td>Lupa okulowa</td><td>Thorlabs</td><td>JEL10</td><td></td></tr><tr><td>Ręczniki Kim Wipes</td><td>Thorlabs</td><td>KW32</td><td></td></tr><tr><td>Sprężone powietrze</td><td>Thorlabs</td><td>CA3</td><td></td></tr><tr><td>Dyski polerskie</td><td>Thorlabs</td><td>D50-xx</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy mikroskop do inspekcji światłowodów</td><td>Thorlabs</td><td>CL-200</td><td></td></tr><tr><td>Folie polerskie</td><td>Thorlabs</td><td>LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P</td><td></td></tr><tr><td>końcówka konektora FC/PC</td><td>Thorlabs</td><td>30126G2-240</td><td>240 &amp;mu;otwór m, tuleja ze stali nierdzewnej</td></tr><tr><td>Jednostka stymulująca MC</td><td>Systemy wielokanałowe</td><td>STG-4002</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do stymulacji MC</td><td>Systemy wielokanałowe</td><td>MC-Stimulus V 2.1.5</td><td></td></tr><tr><td>Laser niebieski</td><td>CrystaLaser</td><td>CL473-050-0</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz lasera</td><td>CrystaLaser</td><td>CL2005</td><td></td></tr><tr><td>Obrotowe złącze światłowodowe</td><td>Soczewki Doric</td><td>FRJ-v4</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Tabela 2. &lt;/strong&gt; Materiały i sprzęt.</td></tr></tbody></table>

symultaniczna elektroencefalografia, pomiar stężenia mleczanu w czasie rzeczywistym i optogenna manipulacja aktywnością neuronalną w korze mózgowej gryzoni

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Mimo że mózg stanowi mniej niż 5% masy ciała, zużywa on około jedną czwartą glukozy wykorzystywanej przez organizm w stanie spoczynku1. Funkcja snu bez szybkich ruchów gałek ocznych (NREMS), który stanowi największą część czasu trwania snu, pozostaje niepewna. Jednakże jedną z charakterystycznych cech NREMS jest znaczny spadek tempa wykorzystania glukozy w mózgu w stosunku do stanu czuwania2-4. To oraz inne odkrycia doprowadziły do powszechnego przekonania, że sen pełni funkcję związaną z metabolizmem mózgowym. Niemniej jednak mechanizmy leżące u podłoża redukcji metabolizmu glukozy w mózgu podczas NREMS wciąż wymagają wyjaśnienia.
	Jednym z zjawisk związanych z NREMS, które może wpływać na mózgowy wskaźnik metaboliczny, jest występowanie fal wolnych – oscylacji o częstotliwości poniżej 4 Hz w elektroencefalogramie5,6. Fale wolne wykrywane na poziomie czaszki lub powierzchni kory mózgowej odzwierciedlają oscylacje neuronów między stanem zdepolaryzowanym (stan up) a hiperpolaryzowanym (stan down)7. Podczas stanu down komórki nie generują potencjałów czynnościowych przez odstępy czasu wynoszące do kilkuset milisekund. Przywracanie gradientów stężeń jonowych po potencjałach czynnościowych stanowi znaczne obciążenie metaboliczne dla komórki8; brak potencjałów czynnościowych podczas stanów down związanych z NREMS może przyczyniać się do obniżenia metabolizmu w stosunku do stanu czuwania.
	Aby przetestować tę hipotetyczną zależność, należało rozwiązać dwa problemy techniczne. Po pierwsze, konieczne było pomiar metaboliczny glikolizy mózgowej z rozdzielczością czasową odzwierciedlającą dynamikę mózgowego EEG (tj. w skali sekund, a nie minut). W tym celu zmierzono stężenie mleczanu, produktu glikolizy tlenowej, stanowiącego tym samym wskaźnik tempa metabolizmu glukozy w mózgach myszy. Mleczan mierzono przy użyciu osadzonego w korze przedczołowej czujnika czasu rzeczywistego opartego na oksydazie mleczanowej. Mechanizm detekcji składa się z elektrody platynowo-irydowej otoczonej warstwą cząsteczek oksydazy mleczanowej. Metabolizm mleczanu przez oksydazę mleczanową wytwarza nadtlenek wodoru, który generuje prąd w elektrodzie platynowo-irydowej. Zatem wzrost glikolizy mózgowej powoduje zwiększenie stężenia substratu dla oksydazy mleczanowej, co następnie odzwierciedla się wzrostem natężenia prądu na elektrodzie pomiarowej. Dodatkowo konieczne było mierzenie tych zmiennych przy jednoczesnej manipulacji pobudliwością kory mózgowej, aby wyizolować tę zmienną od innych aspektów NREMS.
	Opracowaliśmy system eksperymentalny do jednoczesnego pomiaru aktywności neuronalnej za pomocą elektroencefalogramu, pomiaru strumienia glikolitycznego za pomocą biosensora mleczanowego oraz manipulacji aktywnością neuronów kory mózgowej poprzez optogenetyczną aktywację neuronów piramidalnych. Wykorzystaliśmy ten system do udokumentowania zależności między związanymi ze snem przebiegami fal elektroencefalograficznych a dynamicznymi zmianami stężenia mleczanu w korze mózgowej. Protokół ten może być przydatny dla każdej osoby zainteresowanej badaniem u swobodnie poruszających się gryzoni związku między aktywnością neuronalną mierzoną na poziomie elektroencefalograficznym a energetyką komórkową w mózgu.

Jak pokazano na Rysunku 2, mysz przygotowana do stymulacji optogenetycznej oraz pomiaru poziomu mleczanu, EEG i EMG przeszła spontaniczne przejścia między stanami snu i czuwania, podczas gdy EEG, EMG oraz stężenie mleczanu w mózgu były monitorowane w sposób ciągły. Natężenie prądu na czujniku mleczanu wzrastało w okresach niskiej amplitudy EEG i spadało w okresach wysokiej amplitudy EEG. Jak pokazano na Rysunku 3, oba kanały EEG reagują na bodźce optogenetyczne dostarcza...

Opisano procedurę optogenetycznej manipulacji aktywnością neuronów piramidowych kory mózgowej przy jednoczesnym monitorowaniu elektroencefalogramu, elektromiogramu oraz stężenia mleczanu w mózgu. Rejestracje eksperymentalne są przeprowadzane u myszy z podłączonymi przewodami podczas spontanicznych cykli snu i czuwania. Sprzęt do optogenetyki został zbudowany w naszym laboratorium; sprzęt pomiarowy jest dostępny w sprzedaży.

Symultaniczna elektroencefalografia, pomiar stężenia mleczanu w czasie rzeczywistym i optogenna manipulacja aktywnością neuronalną w korze mózgowej gryzoni

Mimo że masa mózgu stanowi mniej niż 5% masy ciała, wykorzystuje on około jedną czwartą glukozy zużywanej przez organizm w stanie spoczynku1.

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar snu zdefiniowanego za pomocą EEG oraz stężenia mleczanu podczas stymulacji optogenetycznej w precyzyjnych współrzędnych stereotaktycznych. Chirurgicznie implantuj niezbędne wyprowadzenia elektroencefalograficzne oraz kaniule dla czujnika mleczanu i kabla światłowodowego. Następnie wprowadź kabel światłowodowy i uprzednio skalibrowany czujnik mleczanu do ich kaniul prowadzących w czaszce zwierzęcia.Następnie dostosuj natężenie bodźca światła niebieskiego, aby uzyskać pożądaną odpowiedź elektrofizjologiczną. Następnie przejdź do zbierania danych z elektroencefalografii, elektromiografii oraz stężenia mleczanu, podczas gdy zwierzę może swobodnie przejawiać aktywność lub spać. W porównaniu z innymi metodami, takimi jak badania farmakologiczne EEG, to podejście eksperymentalne daje korzyść w postaci monitorowania biochemii mózgu i elektrofizjologii w czasie, gdy aktywność neuronów jest manipulowana w czasie rzeczywistym w skali poniżej sekundy.Zatem potencjał do uzyskania nowych wglądów w dziedzinie badań nad snem jest wysoki. Można na przykład zidentyfikować metaboliczne i elektrofizjologiczne korelaty snu wolnofalowego. Ten rodzaj ekspery

simultaneous-electroencephalography-real-time-measurement-lactate

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Jednoczesne rejestrowanie elektroencefalogramu, pomiar w czasie rzeczywistym stężenia laktatu i optogenetyczna manipulacja aktywności neuronów w korze mózgowej gryzoni

Opracowaliśmy metodę jednoczesnego wykonywania funkcjonalnego obrazowania rezonansem magnetycznym oraz rejestracji elektrofizjologicznej w mózgu gryzoni, co stanowi platformę do badania zależności między aktywnością neuronalną a sygnałem fMRI zależnym od poziomu utlenowania krwi (BOLD).

Jednoczesne badanie fMRI i elektrofizjologii w mózgu gryzoni

Ten film demonstruje procedurę jednoczesnego rejestrowania kolokalizowanej elektroencefalografii (EEG) i lokalnych potencjałów pola (LFP) u znieczulonego szczura. Proces polega na przygotowaniu szczura i przymocowaniu elektrod stymulujących do jego opuszków wąsów. Elektroda pająka EEG jest umieszczana na czaszce szczura w celu powierzchniowych pomiarów EEG. W tym samym czasie wielokanałowa mikroelektroda jest wprowadzana do określonego obszaru mózgu przez otwór w czaszce, aby rejestrować...

Równoczesne zapisy potencjału elektroencefalograficznego i lokalnego potencjału pola u znieczulonego szczura

Ten film demonstruje procedurę badania efektywności synaptycznej w bocznej korze śródwęchowej (LEC) poprzez optogenetyczną stymulację aksonów przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC) i rejestrowanie odpowiedzi neuronów piramidowych w LEC. Metoda ta łączy zapisy patch-clamp z aktywacją synaptyczną przez stymulację światłem w celu zbadania plastyczności synaptycznej.

Stymulacja optogenetyczna i elektrofizjologiczny zapis zdarzeń synaptycznych w wycinkach mózgu szczura

Źródło: Lai, J., et al. Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcje środków hamujących do mózgu gryzonia. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje technikę opartą na mikroiniekcjach do jednoczesnego rejestrowania i hamowania neuronów w wzgórku górnym szczura. Procedura obejmuje celowanie stereotaktyczne, wiercenie czaszki i wprowadzenie iniekrody, która dostarcza neuroprzekaźnik hamujący, jednocześnie rejestrując aktywność neuronów. Stymulacja światłem wywołuje potencjały...

Hamowanie aktywności neuronalnej i jej wykrywanie za pomocą elektrofizjologii u szczura

Tutaj tworzymy szklaną pipetę o podwójnej funkcji: hamowaniu głębokich struktur mózgu za pomocą mikroiniekcji leków i monitorowaniu ich efektów w czasie rzeczywistym poprzez jednoczesne zapisy elektrofizjologiczne.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i mikroiniekcja środków hamujących do mózgu gryzonia

Ten protokół opisuje prostą metodę jednoczesnego rejestrowania kolokalizowanej elektroencefalografii (EEG) i wielolaminarnego potencjału pola lokalnego u znieczulonego szczura. Wykazano, że otwór w czaszce wywiercony w czaszce w celu wprowadzenia mikroelektrody powoduje znikome zniekształcenia sygnału EEG.

Jednoczesna rejestracja kolokalizowanej elektroencefalografii i lokalnego potencjału pola u gryzoni

Opracowaliśmy technikę, która jednocześnie rejestruje zarówno elektrokortykografię, jak i lokalne potencjały pola w odpowiedzi na nocyceptywne bodźce laserowe od swobodnie poruszających się szczurów. Technika ta pomaga ustalić bezpośredni związek sygnałów elektrokorowych na poziomie mezoskopowym i makroskopowym, co ułatwia badanie nocyceptywnego przetwarzania informacji w mózgu.

Jednoczesne zapisy lokalnych potencjałów pola korowego i elektrokortykogramy w odpowiedzi na nocyceptywne bodźce laserowe od swobodnie poruszających się szczurów

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Opracowaliśmy uproszczone i opłacalne podejście do produkcji elektrod i przeprowadziliśmy zapisy sygnałów w wielu regionach u swobodnie poruszających się myszy. Wykorzystanie optogenetyki, wraz z elektrofizjologią wieloregionalną i rejestracją sygnału wapnia, umożliwiło ujawnienie aktywności neuronalnej w różnych regionach w modelu rozpalania napadów.

Zintegrowana metoda tworzenia elastycznych i wygodnych optymór elektrofizjologicznych do wieloregionalnego zapisu in vivo

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do rejestracji mikro-elektrokortykografii o wysokiej gęstości (μEcoG) u szczurów i myszy, w tym metody chirurgiczne, implantacyjne i rejestracyjne. Zapisy μECoG są wykonywane w połączeniu z zapisem laminarnej politrody w korze słuchowej szczura lub z optogenetycznym manipulowaniem aktywnością neuronalną w korze somatosensorycznej myszy.

Wieloskalowe badania przetwarzania kory mózgowej poprzez integrację politrod laminarnych i optogenetyki z mikroelektrokortykografią u gryzoni

Ten protokół zapewnia zintegrowaną metodę, która obejmuje dostarczenie wirusowe, implantację optrodu, indukcję fototrombotyczną, jednoczesne rejestrowanie aktywności astrocytów i neuronów oraz optogenetyczną stymulację astrocytów. Ta zintegrowana metoda ma na celu zapewnienie jednoczesnego badania relacji astrocyt-neuron na wszystkich etapach przewlekłych udaru niedokrwiennego.

Zintegrowana metoda modelowania udaru fototrombotycego i in vivo rejestracji optrodem aktywności neuronowej i astrocytów u myszy wykonujących zachowania

Poznaj metodę jednoczesnego monitorowania EEG, EMG i stężenia mleczanu w mózgu myszy podczas optogenetycznej stymulacji neuronów kory mózgowej. Technika umożliwia badanie dynamiki neuronalnej w czasie rzeczywistym.

Jednoczesna elektroencefalografia, pomiar stężenia mleczanu w czasie rzeczywistym i optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w korze mózgowej gryzoni (Wideo) | JoVE Journal

Symultaniczna elektroencefalografia, pomiar stężenia mleczanu w czasie rzeczywistym i optogenna manipulacja aktywnością neuronalną w korze mózgowej gryzoni

Przeglądaj więcej filmów