Jednoczesna elektroencefalografia, pomiar stężenia mleczanu w czasie rzeczywistym i optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w korze mózgowej gryzoni

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar zdefiniowanego w EEG snu i stężenia mleczanu podczas stymulacji optogenetycznej w precyzyjnych współrzędnych stereotaktycznych. Chirurgicznie wszczepić niezbędne elektroencefalograficzne przewody i kaniule do czujnika mleczanowego i światłowodowego. Następnie włóż światłowodowy i wstępnie skalibrowaną sondę mleczanową do kaniul prowadzących w czaszce zwierzęcia.

Następnie dostosuj intensywność bodźca światła niebieskiego, aby osiągnąć pożądaną odpowiedź elektrofizjologiczną. Następnie przystąp do zbierania danych elektroencefalograficznych, elektromiograficznych i stężenia mleczanu, podczas gdy zwierzę może spontanicznie zachowywać się i/lub spać. W porównaniu z innymi metodami, takimi jak farmakologiczne badania EEG, to eksperymentalne podejście ma tę zaletę, że monitoruje biochemię i elektrofizjologię mózgu, podczas gdy aktywność neuronów jest manipulowana w czasie rzeczywistym w skali poniżej sekundy.

Tak więc potencjał do uzyskania nowych spostrzeżeń w dziedzinie badań nad snem jest duży. Na przykład można zidentyfikować metaboliczne i elektrofizjologiczne czynniki towarzyszące senowi wolnofalowemu. Ten rodzaj eksperymentu może być również stosowany w innych dziedzinach neuronauki, takich jak uczenie się i pamięć, plastyczność synaptyczna czy zaburzenia napadowe.

Technika chirurgiczna jest trudna technicznie. Wymaga to sporej zręczności, ale można to osiągnąć poprzez praktykę. W tej wizualnej demonstracji powtórzę krytyczne kroki niektórych skomplikowanych procedur chirurgicznych, które uzupełnią pisemny opis.

Gdy zwierzę dojdzie do siebie po operacji, wyzwaniem jest prawidłowe włożenie czujnika mleczanu i światłowodowego. Jonathan i ja pokażemy, jak używać twardej ręki podczas krępowania zwierzęcia do włożenia tych dwóch delikatnych elementów wyposażenia. Na koniec pokażemy, jak zoptymalizować odpowiedź EEG, dostosowując intensywność bodźca w czasie rzeczywistym.

W tym eksperymencie użyj myszy transgenicznych, które wyrażają wrażliwy na niebieskie światło kanał kationowy. Kanał przyjmuje się w dwóch neuronach kory mózgowej. Najpierw znieczulij mysz za pomocą 5% izofu fluoru, 95% tlenu do indukcji, utrzymując znieczulenie 3% izofem fluoru, 97% tlenu.

Wykonaj przyśrodkowe nacięcie na szczycie czaszki od spomiędzy oczu do tyłu czaszki. Oczyść czaszkę wodą utlenioną i sterylną solą fizjologiczną. Zlokalizuj i oznacz B i Lambda w celu wyznaczenia współrzędnych stereotaktycznych dla konfiguracji bodźców optogenetycznych elektrod, zagruntuj otwory na za pomocą szybkoobrotowej wiertarki dentystycznej z wiertłem kulkowym 0,5 milimetra, a następnie wiertłem kulkowym 0,7 milimetra.

Włóż kelo gramowe elektrody do otworów za pomocą płaskiego śrubokręta ręcznego. Napędzaj je około czterech do pięciu obrotów, aby uzyskać żądaną głębokość. Przytrzymaj kaniule prowadzące na miejscu za pomocą kaniuli stereotaktycznej, a następnie przymocuj je do czaszki i kotew za pomocą cementu akrylowego Aby zachować drożność, każda kaniula prowadząca powinna zawierać atrapę kaniuli lub stylik od czasu operacji do czasu eksperymentów.

Po umieszczeniu EEG i kaniul prowadzących w czaszce połącz je ze sobą cienką warstwą dentystycznego cementu akrylowego. Po związaniu cementu umieść plastikowy łącznik nad wysuszonym kopcem cementu sprzedawanym na końcach przewodów wychodzących z przewodów EEG do styków na plastikowym łączniku w przypadku, gdy drut prowadzi w cemencie. Następnie przeciągnij druty elektromiogramu przez mięśnie jądra, wsuwając je do cylindra igły o rozmiarze 21.

Przebity przez mięsień wiąże podwójny węzeł chirurgski, nylonowy szew z pięcioma zerami wokół tych drutów, tuż dystalnie do miejsca, w którym wychodzą szew mięśniowy z powrotem do siebie, ze skórą, która została cofnięta, aby uzyskać dostęp do tkanki mięśniowej z pojedynczymi przerwanymi węzłami chirurgicznymi za pomocą odwrotnego cięcia P trzy igły i pięć zerowych szwów nylonowych. Po zaprogramowaniu jednostki stymulacyjnej mc uruchom ją jako samodzielny generator sygnału jako pięciowoltowy binarny sygnał włączania/wyłączania. Podłącz jednostkę stymulacyjną mc do jednostki zasilającej lasera z włączonym TTL za pomocą złączy BNC.

Podłącz jednostkę zasilania lasera do lasera za pomocą taśmowego. Podłącz również laser do męskiego złącza FC na pierwotnym światłowodowym. Podłącz źródłowy światłowodowy do złącza obrotowego.

Komutator Światłowodowe złącze obrotowe służy jako komutator. Gdy zwierzę porusza się po klatce, przegub obrotowy obraca się, aby zapobiec pęknięciu światłowodowych z powodu momentu obrotowego. Za pomocą plastikowych opasek kablowych przymocuj komutator do metalowego stojaka umieszczonego nad cylindryczną klatką, w której trzymane jest zwierzę.

Unieruchom, używając jednej ręki, aby przypiąć mysz pod złożoną dłonią. Ustaw głowę między palcem środkowym a wskazującym eksperymentatora. Teraz oczyść kaniulę prowadzącą z zanieczyszczeń, zanieczyszczeń za pomocą sterylnej igły o rozmiarze 25.

Następnie włóż ręcznie światłowodowy i przymocuj go do kaniuli prowadnicy światłowodowej za pomocą gwintowanej nakrętki. Kontroluj głębokość wprowadzenia światłowodowego do mózgu za pomocą węzła szwu zawiązanego na światłowodowym w ustalonej odległości od płaskiego rozszczepionego końca. Czujnik jest utożsamiany z roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem i poddawany stopniowemu działaniu trzech stężeń Lleczanu L.

Zgodnie z protokołami producenta, włóż wstępnie skalibrowany czujnik do zamontowanej na czaszce kaniuli prowadzącej mleczan w sposób identyczny jak procedura wprowadzania światłowodowego. Podłącz czujnik mleczanu do przedwzmacniacza biosensora pinnacle 8, 400 z bipolarnymi złączami wtykowymi. Następnie podłącz ten przedwzmacniacz do ośmiopinowego złącza na chirurgicznie wszczepionym mocowaniu głowicy.

Przed zebraniem danych należy za pomocą pokrętła regulacji intensywności lasera wyregulować intensywność bodźca optogenetycznego. Amplituda odpowiedzi EEG będzie się różnić u różnych zwierząt ze względu na czynniki, które nie były systematycznie badane. Dlatego konieczne jest dostosowanie intensywności bodźca optogenetycznego i sprawdzenie, czy odpowiedź EEG jest odpowiednia, gdy pożądana odpowiedź zostanie osiągnięta.

Zbieraj dane za pomocą systemu Pinnacle 8 400 z wynikiem neuro. Interfejs SEIA klasyfikuje stany snu poprzez wizualną inspekcję procesu danych EEG i EMG. Dane w dziesięciu sekundach epoki jako budzenie bez szybkich ruchów gałek ocznych, sen lub szybki sen z ruchami gałek ocznych na podstawie EEG i EMG.

Ta konfiguracja bodźca optogenetycznego biosensora pokazuje chirurgicznie wszczepione elektrody EEG, czujnik mleczanu i kaniulę do stymulacji optogenetycznej. Przy braku stymulacji optogenetycznej mysz ta zapadała w spontaniczny sen. Przejścia w stan czuwania, podczas gdy E-E-G-E-M-G i stężenie mleczanu w mózgu były stale monitorowane w stanie czuwania i dwóch podtypów snu.

Szybki ruch gałek ocznych i nieszybki ruch gałek ocznych są definiowane na podstawie EEG i EMG. Co ciekawe, prąd biosensora mleczanowego wzrasta w funkcji EEG o niskiej amplitudzie i spada w funkcji EEG o wysokiej amplitudzie. Oba kanały EEG reagują na bodźce optogenetyczne dostarczane w korze czołowej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak chirurgicznie wszczepić mysz w celu jednoczesnej manipulacji optogenetycznej i pomiaru elektroencefalogramu, elektromiogramu i stężenia mleczanu w mózgu. Po opanowaniu tę technikę chirurgiczną można prawidłowo wykonać w ciągu 90 do 120 minut. Pamiętaj, aby stale monitorować oddech zwierzęcia jako miernik głębokości znieczulenia.

Jeśli zwierzę oddycha rzadziej niż raz na cztery do pięciu sekund, znieczulenie może być zbyt głębokie. Jeśli zwierzę oddycha częściej niż raz na dwie sekundy, znieczulenie może być zbyt lekkie. Należy pamiętać o podjęciu odpowiednich środków ostrożności podczas stosowania gazowego środka znieczulającego z fluoru.

Należy zapewnić odpowiednią wentylację na sali operacyjnej, aby chronić siatkówkę przed laserem używanym do stymulacji optogenetycznej. Załóż okulary ochronne lub zamknij zwierzę w szczelnej szafce. Będziesz chciał poćwiczyć wszczepianie biosensora mleczanowego i światłowodowego w pełni wybudzonej myszy.

Myszy nie przestrzegają tych procedur i muszą być unieruchomione. Krępowanie nie może być jednak tak silne, aby zranić zwierzę lub uniemożliwić oddychanie.