Name: Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Poznaj metodę optogenetyczną badania transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu w ostrych plasterkach mózgu gryzoni. Technika ta umożliwia selektywną stymulację synaps i analizę plastyczności neuronalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez grant Wellcome 206401/Z/17/Z. Chcielibyśmy podziękować Zafarowi Baszirowi za jego fachowe mentoring oraz dr Clair Booth za pomoc techniczną i komentarze do manuskryptu.

<ol><li>Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+and+memory%3A+an+evaluation+of+the+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).</li>
<li>Poorthuis, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+modulation+of+the+prefrontal+cortex+by+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors.</a> Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).</li>
<li>Scala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+4+of+mouse+neocortex+differs+in+cell+types+and+circuit+organization+between+sensory+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas.</a> Nature Communications. 10 (1), 4174(2019).</li>
<li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+overlap+of+parvalbumin+and+somatostatin+expressing+interneurons+in+mouse+presubiculum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum.</a> Frontiers in Neural Circuits. 9, 20(2015).</li>
<li>Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection-specific+neuromodulation+of+medial+prefrontal+cortex+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons.</a> Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).</li>
<li>Whitaker, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+modulation+of+intrinsic+excitability+in+rat+prelimbic+cortex+neuronal+ensembles+and+non-ensembles+after+operant+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning.</a> Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).</li>
<li>Skrede, K. K., Westgaard, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transverse+hippocampal+slice%3A+a+well-defined+cortical+structure+maintained+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro.</a> Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).</li>
<li>van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomy+of+memory%3A+an+interactive+overview+of+the+parahippocampal-hippocampal+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).</li>
<li>Cruikshank, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamic+control+of+layer+1+circuits+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex.</a> Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
<li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+channelrhodopsins+for+fast+neuronal+stimulation+at+low+light+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+patch-clamp+recordings+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), (2016).</li>
<li>Booker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+acute+brain+slices+from+the+dorsal+pole+of+the+hippocampus+from+adult+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).</li>
<li>Anderson, W. W., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capabilities+of+the+WinLTP+data+acquisition+program+extending+beyond+basic+LTP+experimental+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).</li>
<li>Basu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+of+hippocampal+activity%2C+plasticity%2C+and+memory+by+entorhinal+cortex+long-range+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition.</a> Science. 351 (6269), (2016).</li>
<li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li>
<li>Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+in+prefrontal+cortex+induced+by+coordinated+synaptic+transmission+arising+from+reuniens%2Frhomboid+nuclei+and+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex+Communications%22%5BJournal%5D)">Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus.</a> Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).</li>
<li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).</li>
<li>Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+of+biocytin-filled+and+processed+sections+for+neurochemical+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).</li>
<li>Jones, B. F., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cingulate+cortex+projections+to+the+parahippocampal+region+and+hippocampal+formation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat.</a> Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).</li>
<li>Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediodorsal+and+ventromedial+thalamus+engage+distinct+L1+circuits+in+the+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex.</a> Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).</li>
<li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition%2C+excitation+and+bistable+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).</li>
<li>Mattis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+for+applying+optogenetic+tools+derived+from+direct+comparative+analysis+of+microbial+opsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins.</a> Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).</li>
<li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals%3A+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).</li>
<li>Marshel, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+layer-specific+critical+dynamics+triggering+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception.</a> Science. 365 (6453), (2019).</li>
<li>Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotypes+1%2C+8%2C+and+9+share+conserved+mechanisms+for+anterograde+and+retrograde+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport.</a> Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).</li>
<li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transduction+efficiency%2C+tropism+and+axonal+transport+of+AAV+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+8+and+9+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLoS One. 8 (9), 76310(2013).</li>
<li>Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+labeling+of+inhibitory+and+excitatory+cortical+neurons+by+endogenous+tropism+of+adeno-associated+virus+and+lentivirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors.</a> Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).</li>
<li>Dimidschstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+viral+strategy+for+targeting+and+manipulating+interneurons+across+vertebrate+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).</li>
<li>Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+tracing+success+depends+critically+on+helper+virus+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6(2020).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.+7th+edn%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn</a>. , Academic Press. (2013).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22Paxinos+and+Franklin%27s+the+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%2C+Compact.+5th+edn%22">Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn</a>. , Academic Press. (2019).</li>
<li>Nabavi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+memory+with+LTD+and+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineering a memory with LTD and LTP.</a> Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).</li>
<li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li>
<li>Xia, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+and+Thalamic+Interaction+with+Amygdala-to-Accumbens+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses.</a> Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).</li>
<li>Anisimova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spike-timing-dependent+plasticity+rewards+synchrony+rather+than+causality%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality.</a> BioRxiv. , (2021).</li>
<li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus+coeruleus+and+dopaminergic+consolidation+of+everyday+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory.</a> Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje metodę badania wysoce specyficznych projekcji synaptycznych dalekiego zasięgu przy użyciu kombinacji chirurgii stereotaktycznej w celu dostarczenia AAV kodujących konstrukty optogenetyczne i elektrofizjologii w ostrych wycinkach mózgu (ryc. 1). Razem techniki te oferują narzędzia do charakteryzowania fizjologii i plastyczności obwodów mózgowych z dużą precyzją w dalekiego zasięgu i anatomicznie rozproszonych ścieżkach, które wcześniej były niedostępne prz...

Zrozumienie fizjologii synaps i tego, jak przechodzą one zmiany plastyczne, jest fundamentalne dla zrozumienia, jak funkcjonują sieci mózgowe w zdrowym mózgu1, oraz jak działają nieprawidłowo w zaburzeniach mózgu. Zastosowanie ostrych wycinków mózgu ex vivo pozwala na rejestrację aktywności elektrycznej synaps z pojedynczych neuronów o wysokim stosunku sygnału do szumu przy użyciu nagrań z całych komórek. Kontrola potencjału błonowego i prosta manipulacja farmakologiczna pozwala na izolację podtypów receptorów. Nagrania te mogą być wykonane z wyjątkową szczegółowością w celu identyfikacji neuronu postsynaptycznego, w tym pozycji laminarnej i subregionalnej2, morfologia komórkowa3, obecność markerów molekularnych4, jego projekcje aferentne5, a nawet jeśli był ostatnio aktywny6.
Osiągnięcie specyficzności presynaptycznych danych wejściowych jest jednak nieco trudniejsze. Konwencjonalna metoda wykorzystuje elektrody stymulacyjne do wzbudzania aksonów, które biegną w określonej blaszce. Przykładem tego jest hipokamp, gdzie miejscowa stymulacja w warstwie promienistej aktywuje synapsy, które rzutują z podpola CA3 do CA17. W tym przypadku specyficzność presynaptyczna jest osiągana, ponieważ wejście CA3 reprezentuje jedyne wejście pobudzające zlokalizowane w warstwie promienistej, które rzutuje na komórki piramidalne CA18. Ten wysoki stopień specyficzności wejściowej, który można osiągnąć przy konwencjonalnej elektrycznej presynaptycznej aktywacji aksonów CA3-CA1, jest jednak wyjątkiem, który znajduje odzwierciedlenie w intensywnych badaniach, którym poddano tę synapsę. W innych obszarach mózgu aksony z wielu szlaków aferentnych współistnieją w tej samej blaszce, na przykład w warstwie 1 kory nowej9, uniemożliwiając w ten sposób stymulację presynaptyczną specyficzną dla danych wejściowych za pomocą konwencjonalnych elektrod stymulujących. Jest to problematyczne, ponieważ różne wejścia synaptyczne mogą mieć rozbieżne właściwości fizjologiczne; W związku z tym ich kostymulacja może prowadzić do błędnej charakterystyki fizjologii synaptycznej.
Pojawienie się optogenetyki, genetycznego kodowania światłoczułych białek błonowych (opsyn), takich jak rodopsyna kanałowa-2 (ChR2), pozwoliło na znaczne rozszerzenie możliwości badania izolowanych projekcji synaptycznych między regionami mózgu10,11. W tym miejscu opisujemy uogólnione i tanie rozwiązanie do badania fizjologii i plastyczności synaps dalekiego zasięgu. Konstrukty optogenetyczne są dostarczane w bardzo specyficzny sposób przy użyciu wektorów wirusowych, co pozwala na niezwykle precyzyjną kontrolę interesującego nas regionu presynaptycznego. Projekcje eferentne będą wyrażać kanał aktywowany światłem, co pozwoli na aktywację tych włókien w obszarze docelowym. W ten sposób można badać dalekosiężne, anatomicznie rozproszone ścieżki, które nie mogą być niezależnie aktywowane przez tradycyjną, niespecyficzną stymulację elektryczną.
Opisujemy, jako przykładową ścieżkę, transdukcję przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC) za pomocą wirusów związanych z adenowirusami (AAV) kodującymi pobudzające opsyny kanału kationowego. Następnie opisujemy przygotowanie ostrych wycinków z bocznej kory śródwęchowej (LEC), zapisy patch-clamp z neuronów piramidowych warstwy 5 LEC oraz wywołaną światłem aktywację glutaminergicznego projekcji mPFC-LEC (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1). Opisujemy również ocenę histologiczną miejsca wstrzyknięcia w celu potwierdzenia lokalizacji interesującego regionu presynaptycznego i identyfikacji morfologii komórek postsynaptycznych.

<table><tbody><tr><td>Probówka 0,2 ml</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>12134102</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; Pipeta L</td><td>Gilson</td><td>FD10001</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>SARSTEDT</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>3-drogowy zawór luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-30600-02</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże 3,3&prime;-diaminobenzydyny (DAB)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>40x obiektyw</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>4-aminopirydyna</td><td>Hello Bio</td><td>HB1073</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw 4x</td><td>Olympus</td><td>PLN4X/0.1</td><td></td></tr><tr><td>AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry</td><td>Addgene</td><td>35512</td><td>Miano wirusa: 3,3x1013 GC/ml</td></tr><tr><td>Soczewka achromatyczna</td><td>Edmund Optics</td><td>49363</td><td>Skupia się na widmie widzialnym i bliskiej podczerwieni</td></tr><tr><td>Mikrowirówka stołowa</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1005*</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Kapilara ze szkła borokrzemianowego</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-6</td><td></td></tr><tr><td>Burr</td><td>Narzędzia do precyzyjnej nauki</td><td>19008-07</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>- Qimaging Retiga Electro</td><td>Photometrics</td><td>01-ELECTRO-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Carbachol</td><td>Tocris</td><td>2810</td><td></td></tr><tr><td>Peeling chirurgiczny z chlorheksydyną</td> Maszynka do strzyżenia <td>Vetasept</td><td>XHG008</td><td></td></tr><tr><td>Maszynki do strzyżenia</td><td>Andis</td><td>22445</td><td>AGC Super 2-biegowa maszynka do strzyżenia z odłączanym ostrzem</td></tr><tr><td>Kolimacyjna soczewka kondensatora</td><td>ThorLabs</td><td>ACL2520-A</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10011913</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>CsMeSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td>Rapid Electronics Ltd</td><td>84-4557</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do akwizycji danych</td><td>National Instruments</td><td>USB-6341 BNC</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne 500 nm długoprzepustowe</td><td>Edmund Optics</td><td>69899</td><td></td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne 600 nm długoprzepustowe</td><td>Edmund Optics</td><td>69901</td><td></td></tr><tr><td>Kostka zwierciadła dichroicznego</td><td>ThorLabs</td><td>CM1-DCH/M</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EGTA Millpore</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt elektrody z portem bocznym</td><td>HEKA</td><td>895150</td><td></td></tr><tr><td>Filtr</td><td>emisyjny Chroma</td><td>59022m</td><td></td></tr><tr><td>Filtr wzbudzenia</td><td>Chroma</td><td>ET570/20x</td><td></td></tr><tr><td>Żel pod oczy</td><td>Dechra</td><td>Lubrithal</td><td></td></tr><tr><td>Drobny pędzel</td><td>Naukowe Materiały laboratoryjne</td><td>BRU2052</td><td></td></tr><tr><td>Świat gilotyny</td><td>Instrumenty precyzyjne</td><td>DCAP</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór nadtlenku wodoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>30% (w/w)</td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Henry Schein</td><td>988-3245</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>k-glukonian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>Kinematyczna kostka filtra fluorescencyjnego</td><td>ThorLabs</td><td>DFM1T1</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik LED</td><td>ThorLabs</td><td>LEDD1B</td><td></td></tr><tr><td>Maść lidokainowa</td><td>Teva</td><td>80007150</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowiertarka</td><td>Aparat Harvard</td><td>75-1887</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz mikroelektrod</td><td>Instrumenty Sutter</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka do mikroiniekcji</td><td>Hamilton</td><td>7634-01/00</td><td></td></tr><tr><td>Igła do mikroiniekcji</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>Specyfikacja niestandardowa: rozstaw 33, długość 15mm, styl punktowy 4 - 12&deg;</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa do mikroiniekcji</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3T-1</td><td></td></tr><tr><td>Zamontowana niebieska dioda LED</td><td>ThorLabs</td><td>M470L5</td><td></td></tr><tr><td>Zamontowana zielona dioda LED</td><td>ThorLabs</td><td>M565L3</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4.H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NIR LED</td><td>OSRAM</td><td></td> <td>SFH4550Innym powszechnie stosowaną metodą jest refrakcyjne obrazowanie w podczerwieni warstwy, optyka z kontrastem interferencyjnym różnicowym (DIC)</td></tr><tr><td>Medium OCT</td><td>VWR International</td><td>RAYLLAMB/OCT</td><td>Optymalna temperatura cięcia medium</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz zaciskowy</td><td>Molecular Devices</td><td>700A</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>World Precision Instruments</td><td>Ministar</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe pokryte poli-L-lizyną</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>23-769-310</td><td></td></tr><tr><td>Komora nagraniowa</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela</td><td>Swann Morton</td><td>#24</td><td></td></tr><tr><td>Kotwica Slice</td><td>Warner Instruments</td><td>SHD-26-GH/15</td><td></td></tr><tr><td>Ramka stereotaktyczna</td><td>Kopf</td><td>Model 902</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktyczny uchwyt do mikrowiertarki</td><td>Harvard Apparatus</td><td>75-1874</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop chirurgiczny</td><td>Carl Zeiss</td><td>OPMI 1 FR pro</td><td></td></tr><tr><td>Suture</td><td>Ethicon</td><td>W577H</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy do zapisu wewnątrzkomórkowego rozwiązanie</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>171-0020</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian tetrodotoksyny</td><td>Hello Bio</td><td>HB1035</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10458842</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Pionowy mikroskop fluorescencyjny</td><td>Leica</td><td>DM6 B</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Medium montażowe z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw VECTASTAIN ABC-HRP Vector</td><td>Laboratories</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden Instruments</td><td>7000smz-2</td><td></td></tr><tr><td>WinLTP</td><td>https://www.winltp.com/</td> <td>wersja 2.32</td><td>Oprogramowanie do akwizycji danych</td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>aCSF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>roztwór <td></td><td></td><td></td><td>do cięcia sacharozy</td></tr><tr><td>PFA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intracellular?</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Badanie fizjologicznych właściwości określonych synaps w mózgu i tego, jak przechodzą one zmiany plastyczne, jest kluczowym wyzwaniem dla nowoczesnej neuronauki. Tradycyjne techniki elektrofizjologiczne in vitro wykorzystują stymulację elektryczną do wywołania transmisji synaptycznej. Główną wadą tej metody jest jej niespecyficzny charakter; Wszystkie aksony w obszarze elektrody stymulującej zostaną aktywowane, co utrudni przypisanie efektu do konkretnego połączenia aferentnego. Problem ten można rozwiązać, zastępując stymulację elektryczną stymulacją opartą na optogenetyce. Opisano metodę łączenia optogenetyki z zapisami in vitro patch-clamp. Jest to potężne narzędzie do badania zarówno podstawowej transmisji synaptycznej, jak i plastyczności synaptycznej precyzyjnie anatomicznie zdefiniowanych połączeń synaptycznych i ma zastosowanie do prawie każdej ścieżki w mózgu. W tym miejscu opisujemy przygotowanie i postępowanie z wektorem wirusowym kodującym białko rodopsyny kanałowej do chirurgicznego wstrzyknięcia do interesującego obszaru presynaptycznego (przyśrodkowa kora przedczołowa) w mózgu gryzonia i tworzenia ostrych wycinków dalszych regionów docelowych (boczna kora śródwęchowa). Przedstawiono również szczegółową procedurę łączenia zapisów patch-clamp z aktywacją synaps przez stymulację światłem w celu zbadania krótko- i długoterminowej plastyczności synaptycznej. Omawiamy przykłady eksperymentów, które osiągają specyficzność szlaku i komórki poprzez połączenie optogenetyki i znakowania komórek zależnych od Cre. Na koniec opisano histologiczne potwierdzenie interesującego regionu presynaptycznego wraz z znakowaniem biocytyny komórki postsynaptycznej, aby umożliwić dalszą identyfikację dokładnej lokalizacji i typu komórki.

W niniejszym protokole opisujemy sposób badania fizjologii i plastyczności synaptycznej dalekiego zasięgu z wykorzystaniem wirusowego dostarczania konstruktów optogenetycznych. Protokół ten można bardzo łatwo dostosować do badania niemal każdego połączenia dalekiego zasięgu w mózgu. Jako przykład opisujemy wstrzyknięcie AAV kodujących opsynę do mPFC szczura, przygotowanie skrawków tkanki z LEC, rejestrację patch-clamp z neuronów piramidowych warstwy 5 LEC oraz aktywację wywołaną światłem zakończeń mPFC w LEC (<strong cla...

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...

Wirusowo dostarczone konstrukty optogenetyczne pozwalają na szczegółową elektrofizjologiczną charakterystykę fizjologii i plastyczności określonych synaps w ostrych wycinkach mózgu. Podstawowymi zaletami optycznej aktywacji synaps jest możliwość badania szlaków dalekiego zasięgu oraz selektywna stymulacja aksonów, które nie są anatomicznie oddzielone. Procedurę zademonstruje dr Lisa Kinnavane, pracownik naukowy z naszego laboratorium.Na początek załaduj strzykawkę Hamilton do pompy strzykawkowej do mikroiniekcji przymocowanej do ruchomego ramienia zamontowanego na ramie stereotaktycznej. Następnie umieścić pięciomikrolitrową porcję wirusa w mikrowirówce. Obracaj probówkę przez kilka sekund i odpipetuj dwa mikrolitry preparatu wirusowego do pokrywki probówki.Aby napełnić strzykawkę preparatem wirusowym, należy obejrzeć końcówkę igły pod mikroskopem chirurgicznym. Następnie ręcznie umieścić bolus wirusa na końcu igły i wyjąć tłok strzykawki za pomocą elementów sterujących pompy. Ustaw objętość wtrysku pompy na 300 nanolitrów i natężenie przepływu na 100 nanolitrów na minutę.Uruchomić pompę i potwierdzić prawidłowy przepływ, obserwując kroplę wirusa na końcu igły. Wchłoń wirusa na wacik i wyczyść igłę 70% etanolem. Następnie, używając regulacyjnych na ramie stereotaktycznej, skieruj końcówkę igły do bregmy i zanotuj pomiary stereotaktyczne zaobserwowane na trzech skalach noniusza na ramie.Dodaj lub odejmij te odległości od współrzędnych bregma. Wykonaj otwór w kształcie zadziorów na powierzchni czaszki za pomocą mikrowiertła zamontowanego na ramieniu stereotaktycznym. Wbij igłę do mózgu w określonym z góry współrzędnym grzbietowo-brzusznym i wlej z góry określoną objętość preparatu wirusowego.Po infuzji należy pozostawić igłę na miejscu na 10 minut, aby umożliwić dyfuzję bolusa. Następnie wyjmij igłę i uruchom pompę, aby upewnić się, że igła nie jest zablokowana. Dwa tygodnie po wstrzyknięciu wirusa należy poddać szczura eutanazji, szybko wyciąć cały mózg i przenieść go do roztworu do cięcia sacharozy.Za pomocą metalowej łyżeczki podnieś mózg, wylej nadmiar roztworu i umieść go na bibule filtracyjnej. Za pomocą skalpela usuń móżdżek i przetnij mózg w płaszczyźnie koronalnej mniej więcej w połowie jego długości. Tylna połowa to blok tkankowy LEC.Zwróć blok tkankowy i pozostały mózg do roztworu do cięcia sacharozy. Następnie umieść kroplę kleju cyjanoakrylowego na stoliku wibratomu i rozprowadź ją cienką warstwą. Następnie za pomocą łyżeczki wybierz blok tkanki LEC i przenieś go na plaster kleju, tak aby przednie nacięcie koronalne przylegało.Zainstaluj stolik w komorze tkankowej wibratomu i szybko wlej wystarczającą ilość roztworu do cięcia sacharozy, aby zanurzyć tkankę. Po ustawieniu brzusznej powierzchni bloku tkankowego w kierunku ostrza, wytnij plastry o grubości 350 mikrometrów od brzusznej do grzbietowej, używając powolnej prędkości posuwania ostrza. Zazwyczaj można uzyskać siedem plasterków na półkulę.Przenieś plastry do komory na plastry. Następnie umieść komorę zbiorczą w łaźni wodnej o temperaturze 34 stopni Celsjusza na godzinę przed powrotem do temperatury pokojowej. Umieść pozostałą część mózgu w paraformaldehydzie na 48 godzin.W celu identyfikacji komórki docelowej umieść plasterek w komorze rejestracyjnej i unieruchom, używając kotwicy do cięcia. Przy małym powiększeniu, korzystając z oświetlenia w podczerwieni, przejdź do piątej warstwy LEC. Następnie zmień na obiektyw zanurzenia w wodzie o dużym powiększeniu i zidentyfikuj neurony piramidowe.Zaznacz położenie komórki na monitorze za pomocą taśmy. Następnie, aby utworzyć zacisk łaty na całe komórki, wyprodukuj mikropipetę ze szkła borokrzemianowego i napełnij ją roztworem do zapisu wewnątrzkomórkowego. Umieść napełnioną mikropipetę w uchwycie elektrody i zastosuj nadciśnienie, mocno w ustnik podłączony do bocznego portu uchwytu elektrody.Podnieś obiektyw mikroskopu tak, aby utworzyła się menisk i włóż elektrodę do menisku, aż będzie widoczny pod mikroskopem. Otwórz okno Seal Test (Test uszczelnienia) i sprawdź, czy rezystancja pipety wynosi od trzech do pięciu megaomów. Następnie dotknij zidentyfikowanej komórki końcówką pipety, powodując wgłębienie w błonie komórkowej.Następnie zastosuj podciśnienie poprzez zasysanie ustnika, zwiększając opór pipety. Kontynuuj stopniowe stosowanie podciśnienia, aż błona komórkowa pęknie, co spowoduje stany przejściowe pojemności całej komórki. Aby wprowadzić aktualną konfigurację cęgów, należy użyć zamontowanej diody LED skierowanej na ścieżkę światła mikroskopu z kostkami filtrującymi i odpowiednią optyką, a następnie przyłożyć impulsy świetlne do warstwy za pomocą obiektywu 40X.Dostarczaj ciągi wielu impulsów świetlnych z częstotliwością pięciu herców, 10 herców i 20 herców, aby zbadać właściwości uwalniania presynaptycznego. Aby biocytyna mogła wypełnić neuron, odczekaj co najmniej 15 minut po wejściu do całej konfiguracji komórki. W cęgach napięciowych monitoruj pojemność membrany i rezystancję wejściową.Następnie powoli wycofaj pipetę wzdłuż kąta natarcia z dala od somy komórki, obserwując powolny zanik stanów przejściowych pojemności i prądu błonowego, co wskazuje na ponowne uszczelnienie błony komórkowej i utworzenie łaty na zewnątrz na końcówce pipety. Umieść plasterek w paraformaldehydzie na 24-dołkowej płytce i inkubuj przez noc. Używając pożywki OCT, przymocuj blok tkanki do krążka próbki kriostatu.Aby zamrozić tkankę, umieść izopentan w odpowiednim pojemniku i zanurz krążek próbki, upewniając się, że tkanka znajduje się powyżej poziomu izopentanu. Następnie opuść pojemnik z izopentanem do ciekłego azotu i pozwól tkance zamarznąć. Po całkowitym zamrożeniu tkanki pozostaw blok tkanki w komorze kriostatu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na 30 minut, aby temperatura bloku się wyrównała.Po zrównoważeniu wytnij w kriostacie odcinki o grubości 40 mikrometrów i użyj drobnego pędzla, aby odprowadzić sekcje od ostrza. Przyklej te zamrożone sekcje do szkiełka mikroskopowego pokrytego poli-L-lizyną w temperaturze pokojowej, dotykając szkiełka do sekcji. Po dodaniu 150 mikrolitrów podłoża montażowego do każdego szkiełka, nałóż szkiełko nakrywkowe i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza, delikatnie naciskając szkiełko nakrywkowe.Przykryj szkiełka, aby chronić je przed fotowybielaniem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 12 godzin. Następnie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego zbadaj lokalizację miejsca wstrzyknięcia wirusa. W przypadku barwienia biocytyną inkubuj plastry w 3% nadtlenku wodoru w PBS przez 30 minut, aby zablokować wszelką aktywność endogennej peroksydazy.Następnie umyj plastry mózgu PBS, aż nie będą widoczne dalsze pęcherzyki tlenu. Następnie inkubuj plastry przez trzy godziny w 1% roztworze biotynylowanego kompleksu HRP w PBS zawierającym 0,1% Triton X-100. Po sześciu płukaniach PBS inkubuj każdą cząstkę w roztworze DAB, aż barwniki biocytyny struktur neuronalnych staną się widoczne.Zatrzymaj reakcję, przenosząc plastry do zimnego PBS. Następnie zamontuj plastry na szklanych szkiełkach mikroskopowych za pomocą pędzla. Po usunięciu nadmiaru PBS dodaj pożywkę montażową.Przykryj plastry szkiełkami nakrywkowymi i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu, jak pokazano wcześniej. Zdrowa komórka piramidalna została zlokalizowana i załatana. Jeśli wymagana jest identyfikacja komórek postsynaptycznych, komórka wyrażająca marker fluorescencyjny powinna zostać zlokalizowana za pomocą optyki szerokokątnej.Pojedyncze impulsy świetlne trwające dwie milisekundy skutkowały prostymi optogenetycznymi potencjałami postsynaptycznymi o kształcie fali. Krótkotrwałą plastyczność synapsy bada się poprzez zastosowanie pięcio-, 10- i 20-hercowych ciągów stymulacji świetlnej. Podczas badania długoterminowej plastyczności, dodanie cholinergicznego agonisty karbacholu do krążącego aCSF przez 10 minut spowodowało długotrwałą depresję, która była nadal widoczna 40 minut po usunięciu ligandu.Długość miejsca wstrzyknięcia badano histologicznie. Fluorescencyjny reporter mCherry był zlokalizowany w głębszych warstwach kory przedlimbicznej i podlimbicznej. Co więcej, barwienie komórki wypełnionej biocytyną potwierdziło jej lokalizację i morfologię.Krytycznymi etapami tego protokołu są dokładna transdukcja aferentnego obszaru mózgu, która może być zweryfikowana post hoc, oraz szybka sekcja mózgu podczas przygotowywania ostrych plastrów. Procedurę tę można łatwo połączyć ze znakowaniem fluorescencyjnym pojedynczego typu komórki, takiego jak określona podklasa interneuronów. Aby to zrobić, użyjemy transgenicznego zwierzęcia, które wyraża rekombinazę w tym konkretnym typie komórek.Wirusowo dostarczane konstrukty optogenetyczne umożliwiły szybki postęp w dziedzinie neuronauki o systemach i obwodach.

ex-vivo-optogenetic-interrogation-long-range-synaptic-transmission

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje procedurę badania efektywności synaptycznej w bocznej korze śródwęchowej (LEC) poprzez optogenetyczną stymulację aksonów przyśrodkowej kory przedczołowej (mPFC) i rejestrowanie odpowiedzi neuronów piramidowych w LEC. Metoda ta łączy zapisy patch-clamp z aktywacją synaptyczną przez stymulację światłem w celu zbadania plastyczności synaptycznej.

Stymulacja optogenetyczna i elektrofizjologiczny zapis zdarzeń synaptycznych w wycinkach mózgu szczura

Zależne od doświadczenia zmiany molekularne w neuronach są niezbędne dla zdolności mózgu do adaptacji w odpowiedzi na wyzwania behawioralne.  Opisano tutaj metodę obrazowania dwufotonowego in vivo, która umożliwia śledzenie takich zmian molekularnych w poszczególnych neuronach korowych za pomocą genetycznie kodowanych reporterów.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie zależnych od doświadczenia zmian molekularnych w neuronach korowych

Opisujemy metodę charakteryzowania funkcjonalnej topografii i właściwości synaptycznych obwodów przodomózgowia za pomocą podejścia optogenetycznego do fotostymulacji populacji neuronów in vitro.

Fotostymulacja optogenetycznie ukierunkowana obwodów przodomózgowia ze skaningiem laserowym

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Podejścia optogenetyczne są powszechnie używane do manipulowania aktywnością neuronalną i oceny konsekwencji dla funkcjonowania mózgu. W tym miejscu przedstawiono technikę, która po ekspresji in vivo aktywatora optycznego rodopsyny kanałowej pozwala na analizę ex vivo właściwości synaptycznych określonych połączeń neuronalnych dalekiego zasięgu i lokalnych połączeń nerwowych w obwodach związanych ze strachem.

Ex vivo Optogenetyczna analiza obwodów strachu w wycinkach mózgu

Ten protokół opisuje zestaw metod do identyfikacji specyficznej dla typu komórki funkcjonalnej łączności sygnałów dalekiego zasięgu z odległych obszarów mózgu za pomocą stymulacji optogenetycznej w wycinkach mózgu ex vivo.

Wewnątrzmózgowe zastrzyki stereotaktyczne in vivo do optogenetycznej stymulacji sygnałów wejściowych dalekiego zasięgu w wycinkach mózgu myszy

Ta metoda opisuje chroniczne przygotowanie, które umożliwia optyczny dostęp do hipokampa żywych myszy. Preparat ten może być stosowany do wykonywania podłużnego obrazowania optycznego plastyczności strukturalnej neuronów i plastyczności komórkowej wywołanej aktywnością przez okres kilku tygodni.

Podłużne obrazowanie dwufotonowe grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy

Obecny protokół demonstruje prostą metodę śledzenia projekcji glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki (VTA) do hipokampa. Fotostymulację neuronów glutaminianu VTA połączono z zapisem CA1, aby zademonstrować, w jaki sposób zakończenia glutaminianu VTA modulują przypuszczalną szybkość wypalania CA1 w piramidzie in vivo.

Połączone anatomiczne i funkcjonalne śledzenie in vivo zakończeń glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki w hipokampie

Opracowaliśmy uproszczone i opłacalne podejście do produkcji elektrod i przeprowadziliśmy zapisy sygnałów w wielu regionach u swobodnie poruszających się myszy. Wykorzystanie optogenetyki, wraz z elektrofizjologią wieloregionalną i rejestracją sygnału wapnia, umożliwiło ujawnienie aktywności neuronalnej w różnych regionach w modelu rozpalania napadów.

Zintegrowana metoda tworzenia elastycznych i wygodnych optymór elektrofizjologicznych do wieloregionalnego zapisu in vivo

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do rejestracji mikro-elektrokortykografii o wysokiej gęstości (μEcoG) u szczurów i myszy, w tym metody chirurgiczne, implantacyjne i rejestracyjne. Zapisy μECoG są wykonywane w połączeniu z zapisem laminarnej politrody w korze słuchowej szczura lub z optogenetycznym manipulowaniem aktywnością neuronalną w korze somatosensorycznej myszy.

Wieloskalowe badania przetwarzania kory mózgowej poprzez integrację politrod laminarnych i optogenetyki z mikroelektrokortykografią u gryzoni

Protokół ten opisuje dwufazową metodę chirurgiczną mającą na celu stworzenie dużego, ponownie zamykalnego, oszczędzającego dura okno czaszkowe u myszy. Technika ta umożliwia przewlekłe, wielomodalne zapisy elektrofizjologiczne z rozproszonych, głębokich sieci mózgowych, takich jak Sieć Trybu Domyślnego, przez kilka tygodni.

Protokół chirurgiczny dla dużego, zamykalnego okna czaszkowego umożliwiającego podłużne, wielomodalne rejestrowanie elektrofizjologii sieci domyślnej myszy

Poznaj metodę optogenetyczną badania transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu w ostrych plasterkach mózgu gryzoni. Technika ta umożliwia selektywną stymulację synaps i analizę plastyczności neuronalnej.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej (Wideo) | JoVE Journal

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Przeglądaj więcej filmów