Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Wirusowo dostarczone konstrukty optogenetyczne pozwalają na szczegółową elektrofizjologiczną charakterystykę fizjologii i plastyczności określonych synaps w ostrych wycinkach mózgu. Podstawowymi zaletami optycznej aktywacji synaps jest możliwość badania szlaków dalekiego zasięgu oraz selektywna stymulacja aksonów, które nie są anatomicznie oddzielone. Procedurę zademonstruje dr Lisa Kinnavane, pracownik naukowy z naszego laboratorium.

Na początek załaduj strzykawkę Hamilton do pompy strzykawkowej do mikroiniekcji przymocowanej do ruchomego ramienia zamontowanego na ramie stereotaktycznej. Następnie umieścić pięciomikrolitrową porcję wirusa w mikrowirówce. Obracaj probówkę przez kilka sekund i odpipetuj dwa mikrolitry preparatu wirusowego do pokrywki probówki.

Aby napełnić strzykawkę preparatem wirusowym, należy obejrzeć końcówkę igły pod mikroskopem chirurgicznym. Następnie ręcznie umieścić bolus wirusa na końcu igły i wyjąć tłok strzykawki za pomocą elementów sterujących pompy. Ustaw objętość wtrysku pompy na 300 nanolitrów i natężenie przepływu na 100 nanolitrów na minutę.

Uruchomić pompę i potwierdzić prawidłowy przepływ, obserwując kroplę wirusa na końcu igły. Wchłoń wirusa na wacik i wyczyść igłę 70% etanolem. Następnie, używając regulacyjnych na ramie stereotaktycznej, skieruj końcówkę igły do bregmy i zanotuj pomiary stereotaktyczne zaobserwowane na trzech skalach noniusza na ramie.

Dodaj lub odejmij te odległości od współrzędnych bregma. Wykonaj otwór w kształcie zadziorów na powierzchni czaszki za pomocą mikrowiertła zamontowanego na ramieniu stereotaktycznym. Wbij igłę do mózgu w określonym z góry współrzędnym grzbietowo-brzusznym i wlej z góry określoną objętość preparatu wirusowego.

Po infuzji należy pozostawić igłę na miejscu na 10 minut, aby umożliwić dyfuzję bolusa. Następnie wyjmij igłę i uruchom pompę, aby upewnić się, że igła nie jest zablokowana. Dwa tygodnie po wstrzyknięciu wirusa należy poddać szczura eutanazji, szybko wyciąć cały mózg i przenieść go do roztworu do cięcia sacharozy.

Za pomocą metalowej łyżeczki podnieś mózg, wylej nadmiar roztworu i umieść go na bibule filtracyjnej. Za pomocą skalpela usuń móżdżek i przetnij mózg w płaszczyźnie koronalnej mniej więcej w połowie jego długości. Tylna połowa to blok tkankowy LEC.

Zwróć blok tkankowy i pozostały mózg do roztworu do cięcia sacharozy. Następnie umieść kroplę kleju cyjanoakrylowego na stoliku wibratomu i rozprowadź ją cienką warstwą. Następnie za pomocą łyżeczki wybierz blok tkanki LEC i przenieś go na plaster kleju, tak aby przednie nacięcie koronalne przylegało.

Zainstaluj stolik w komorze tkankowej wibratomu i szybko wlej wystarczającą ilość roztworu do cięcia sacharozy, aby zanurzyć tkankę. Po ustawieniu brzusznej powierzchni bloku tkankowego w kierunku ostrza, wytnij plastry o grubości 350 mikrometrów od brzusznej do grzbietowej, używając powolnej prędkości posuwania ostrza. Zazwyczaj można uzyskać siedem plasterków na półkulę.

Przenieś plastry do komory na plastry. Następnie umieść komorę zbiorczą w łaźni wodnej o temperaturze 34 stopni Celsjusza na godzinę przed powrotem do temperatury pokojowej. Umieść pozostałą część mózgu w paraformaldehydzie na 48 godzin.

W celu identyfikacji komórki docelowej umieść plasterek w komorze rejestracyjnej i unieruchom, używając kotwicy do cięcia. Przy małym powiększeniu, korzystając z oświetlenia w podczerwieni, przejdź do piątej warstwy LEC. Następnie zmień na obiektyw zanurzenia w wodzie o dużym powiększeniu i zidentyfikuj neurony piramidowe.

Zaznacz położenie komórki na monitorze za pomocą taśmy. Następnie, aby utworzyć zacisk łaty na całe komórki, wyprodukuj mikropipetę ze szkła borokrzemianowego i napełnij ją roztworem do zapisu wewnątrzkomórkowego. Umieść napełnioną mikropipetę w uchwycie elektrody i zastosuj nadciśnienie, mocno w ustnik podłączony do bocznego portu uchwytu elektrody.

Podnieś obiektyw mikroskopu tak, aby utworzyła się menisk i włóż elektrodę do menisku, aż będzie widoczny pod mikroskopem. Otwórz okno Seal Test (Test uszczelnienia) i sprawdź, czy rezystancja pipety wynosi od trzech do pięciu megaomów. Następnie dotknij zidentyfikowanej komórki końcówką pipety, powodując wgłębienie w błonie komórkowej.

Następnie zastosuj podciśnienie poprzez zasysanie ustnika, zwiększając opór pipety. Kontynuuj stopniowe stosowanie podciśnienia, aż błona komórkowa pęknie, co spowoduje stany przejściowe pojemności całej komórki. Aby wprowadzić aktualną konfigurację cęgów, należy użyć zamontowanej diody LED skierowanej na ścieżkę światła mikroskopu z kostkami filtrującymi i odpowiednią optyką, a następnie przyłożyć impulsy świetlne do warstwy za pomocą obiektywu 40X.

Dostarczaj ciągi wielu impulsów świetlnych z częstotliwością pięciu herców, 10 herców i 20 herców, aby zbadać właściwości uwalniania presynaptycznego. Aby biocytyna mogła wypełnić neuron, odczekaj co najmniej 15 minut po wejściu do całej konfiguracji komórki. W cęgach napięciowych monitoruj pojemność membrany i rezystancję wejściową.

Następnie powoli wycofaj pipetę wzdłuż kąta natarcia z dala od somy komórki, obserwując powolny zanik stanów przejściowych pojemności i prądu błonowego, co wskazuje na ponowne uszczelnienie błony komórkowej i utworzenie łaty na zewnątrz na końcówce pipety. Umieść plasterek w paraformaldehydzie na 24-dołkowej płytce i inkubuj przez noc. Używając pożywki OCT, przymocuj blok tkanki do krążka próbki kriostatu.

Aby zamrozić tkankę, umieść izopentan w odpowiednim pojemniku i zanurz krążek próbki, upewniając się, że tkanka znajduje się powyżej poziomu izopentanu. Następnie opuść pojemnik z izopentanem do ciekłego azotu i pozwól tkance zamarznąć. Po całkowitym zamrożeniu tkanki pozostaw blok tkanki w komorze kriostatu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na 30 minut, aby temperatura bloku się wyrównała.

Po zrównoważeniu wytnij w kriostacie odcinki o grubości 40 mikrometrów i użyj drobnego pędzla, aby odprowadzić sekcje od ostrza. Przyklej te zamrożone sekcje do szkiełka mikroskopowego pokrytego poli-L-lizyną w temperaturze pokojowej, dotykając szkiełka do sekcji. Po dodaniu 150 mikrolitrów podłoża montażowego do każdego szkiełka, nałóż szkiełko nakrywkowe i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza, delikatnie naciskając szkiełko nakrywkowe.

Przykryj szkiełka, aby chronić je przed fotowybielaniem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 12 godzin. Następnie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego zbadaj lokalizację miejsca wstrzyknięcia wirusa. W przypadku barwienia biocytyną inkubuj plastry w 3% nadtlenku wodoru w PBS przez 30 minut, aby zablokować wszelką aktywność endogennej peroksydazy.

Następnie umyj plastry mózgu PBS, aż nie będą widoczne dalsze pęcherzyki tlenu. Następnie inkubuj plastry przez trzy godziny w 1% roztworze biotynylowanego kompleksu HRP w PBS zawierającym 0,1% Triton X-100. Po sześciu płukaniach PBS inkubuj każdą cząstkę w roztworze DAB, aż barwniki biocytyny struktur neuronalnych staną się widoczne.

Zatrzymaj reakcję, przenosząc plastry do zimnego PBS. Następnie zamontuj plastry na szklanych szkiełkach mikroskopowych za pomocą pędzla. Po usunięciu nadmiaru PBS dodaj pożywkę montażową.

Przykryj plastry szkiełkami nakrywkowymi i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu, jak pokazano wcześniej. Zdrowa komórka piramidalna została zlokalizowana i załatana. Jeśli wymagana jest identyfikacja komórek postsynaptycznych, komórka wyrażająca marker fluorescencyjny powinna zostać zlokalizowana za pomocą optyki szerokokątnej.

Pojedyncze impulsy świetlne trwające dwie milisekundy skutkowały prostymi optogenetycznymi potencjałami postsynaptycznymi o kształcie fali. Krótkotrwałą plastyczność synapsy bada się poprzez zastosowanie pięcio-, 10- i 20-hercowych ciągów stymulacji świetlnej. Podczas badania długoterminowej plastyczności, dodanie cholinergicznego agonisty karbacholu do krążącego aCSF przez 10 minut spowodowało długotrwałą depresję, która była nadal widoczna 40 minut po usunięciu ligandu.

Długość miejsca wstrzyknięcia badano histologicznie. Fluorescencyjny reporter mCherry był zlokalizowany w głębszych warstwach kory przedlimbicznej i podlimbicznej. Co więcej, barwienie komórki wypełnionej biocytyną potwierdziło jej lokalizację i morfologię.

Krytycznymi etapami tego protokołu są dokładna transdukcja aferentnego obszaru mózgu, która może być zweryfikowana post hoc, oraz szybka sekcja mózgu podczas przygotowywania ostrych plastrów. Procedurę tę można łatwo połączyć ze znakowaniem fluorescencyjnym pojedynczego typu komórki, takiego jak określona podklasa interneuronów. Aby to zrobić, użyjemy transgenicznego zwierzęcia, które wyraża rekombinazę w tym konkretnym typie komórek.

Wirusowo dostarczane konstrukty optogenetyczne umożliwiły szybki postęp w dziedzinie neuronauki o systemach i obwodach.