22 grudnia 2015
Implantacja autologicznych i allogenicznych przeszczepów kostnych stanowi akceptowane metody leczenia dużych ubytków kości twarzoczaszki. Jednak wpływ składu przeszczepu na wzajemne oddziaływanie między neowaskularyzacją, różnicowaniem komórek i tworzeniem kości jest niejasny. Przedstawiamy protokół obrazowania multimodalnego, którego celem jest wyjaśnienie współzależności angiogenezy i osteogenezy w pobliżu przeszczepu.
Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie integracji przeszczepów kości czaszki pod kątem regeneracji kości i neowaskularyzacji przy użyciu metod obrazowania multimodalnego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, takie jak sprzężenie angiogenezy z osteogenezą. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona określenie 3D trójki naczyniowej w wysokiej rozdzielczości i pozwala na badanie całego narządu, który demonstruje procedurę, którą będzie Doron Vic, doktorant w moim laboratorium Po eutanazji siedmio- do ośmiotygodniowej myszy morskiej Bab.
Zgodnie z protokołem tekstowym użyj maszynki do strzyżenia włosów, aby ogolić obszar kalwarii w kierunku przeciwnym do kierunku wzrostu włosów. Nałóż 70% izopropanol na tuszę, głowę do dezynfekcji. Następnie użyj skalpela numer 11, aby przeciąć skórę głowy i usunąć okostną za pomocą wiertła dentystycznego i zęba o średnicy wewnętrznej 4,5 milimetra.
Oderwij okrągły fragment kości kalwaryjnej. Przenieś fragment kości do 100-milimetrowego plastikowego naczynia zawierającego sterylną sól fizjologiczną. W tym momencie obserwuj krew i tkankę miękką przyczepioną do fragmentu kości za pomocą zakrzywionej pęsety.
Trzymaj jeden fragment kości na raz i użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby dokładnie go przetrzeć. Usunięcie tkanki mózgowej, tkanek miękkich i krwi. Użyj cienkich nożyczek, aby delikatnie odciąć wszelkie wióry kostne, które pozostają przyczepione do przeszczepu, aby przeszczep miał idealnie zaokrąglony kształt.
Zanurz każdy przeszczep raz w 15-mililitrowej probówce zawierającej 70% etanolu i dwa razy w 15-mililitrowej probówce zawierającej PBS, aby zmyć etanol. Zamroź przeszczep w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w probówkach kriogenicznych przez co najmniej tydzień po zamrożeniu. Upewnij się, że przeszczep allogeniczny wydaje się przezroczysty, pracując z transgenicznymi myszami biorcy, które wyrażają lucyferazy pod kontrolą promotora osteokalcyny.
Po znieczuleniu siedmio- do ośmiotygodniowej samicy myszy za pomocą środków znieczulających do wstrzykiwań i sprawdzeniu sedacji. Użyj maszynki do strzyżenia włosów w kierunku przeciwnym do kierunku wzrostu włosów, aby ogolić okolicę kalwarii. Zastosuj depilator, aby usunąć wszelkie resztki sierści i użyj suchej gazy, aby wytrzeć go po nie więcej niż dwóch minutach.
Następnie użyj gazy nasączonej solą fizjologiczną, aby wytrzeć obszar. Zdezynfekuj skórę głowy, nakładając podskórnie 5% chlorheksydyny. Wstrzyknąć pięć miligramów na kilogram karprofenu rozcieńczonego w 200 mikrolitrach soli fizjologicznej.
Nałóż maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu i przez cały czas trzymaj zwierzę na poduszce termicznej. Następnie umieść zwierzę pod lornetką operacyjną. Następnie za pomocą cienkich nożyczek i pęsety wykonaj pęsetą owalne nacięcie skóry głowy o długości jednego centymetra.
Przytrzymaj okostną i użyj cienkich nożyczek, aby ją odciąć wiertłem dentystycznym i pięciomilimetrową średnicą zewnętrzną tr udoskonalić ubytek nazębny dwa milimetry przed szwem lambdoidalnym, aby uniknąć penetracji opony twardej. Wywierć trzy czwarte drogi do kości i użyj szpatułki, aby odłączyć fragment kości. Jednym z krytycznych kroków w protokole jest usunięcie lokalizacji wady.
Uszkodzenie szwu labo doprowadzi do masywnego krwawienia. Dlatego należy zachować ostrożność, aby nie zakłócić leżącej pod spodem twardości i strzałki górnej. Aby wszczepić autoprzeszczep.
Użyj 10 mililitrów sterylnej soli fizjologicznej na 10-milimetrowej plastikowej płytce, aby umyć fragment kości. Usuń skrzepy krwi bez usuwania tkanek miękkich, aby wcześniej wszczepić odwilż przeszczepu allogenicznego i znormalizować próbkę do temperatury pokojowej. Następnie umyj fragment kości zakrzywioną pęsetą.
Umieść przeszczep kostny w ubytku tak, aby nie dotykał marginesów ubytku. Następnie za pomocą żelu fibrynowego przyklej przeszczep do kości gospodarza. Zszyj skórę czterema szwami Vicryl i nałóż jod powidonu na cięcie chirurgiczne.
Zaznacz ucho myszy i wstrzyknij 0,25 miligrama na kilogram antysedanu. Aby odwrócić znieczulające działanie mięsa. Opiekę pooperacyjną należy przeprowadzić zgodnie z protokołem tekstowym.
Przygotuj heparynizowaną sól fizjologiczną, ważąc 2000 jednostek heparyny sodowej i przenosząc do 50-mililitrowej probówki. Dodaj 20 mililitrów sterylnej soli fizjologicznej do probówki i wstrząśnij. Dobrze napełnij 20-mililitrową strzykawkę z blokadą przynęty 15 mililitrami podgrzanej heparynizowanej soli fizjologicznej i podłącz strzykawkę do zestawu żył skóry głowy o rozmiarze 23.
Umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej i ustawić pompę na 10 mililitrów na jeden mililitr na minutę. Po znieczuleniu myszy zgodnie z protokołem tekstowym potwierdź sedację szczyptą palca u nogi i zabezpiecz mysz. Grzbietem do płyty mocującej owiniętej chłonną wkładką powierzchniową.
Następnie odetnij skórę od brzucha do szyi. Przetnij ścianę brzucha aż do wyrostka mieczykowatego. Następnie przetnij klatkę piersiową wzdłuż jej bocznej części, upewniając się, że serce jest całkowicie odsłonięte, a serce i płuca nie są uszkodzone.
Użyj hemostatu, aby cofnąć mostek. Włóż igłę motylkową trzy milimetry do lewej komory. Następnie za pomocą trzysekundowego kleju przyklej igłę do serca i ściany klatki piersiowej Wprowadzenie igły motylkowej do lewej komory jest delikatną procedurą.
Staraj się unikać wkładania do prawej komory lub zbyt głęboko do lewej komory, ponieważ przeniknie to do tylnej ściany serca. Następnie natychmiast aktywuj pompę. Po minucie należy wyciąć żyłę cva dolną w celu obniżenia ciśnienia w układzie naczyniowym.
Przechyl deskę tak, aby płyny spływały z głowy. Udana perfuzja spowoduje oczyszczenie wątroby i naczyń krwionośnych. Teraz perfuzja 10 mililitrów 4% formaldehydu.
Unikanie przenikania pęcherzyków powietrza do układu naczyniowego. Gdy perfuzja jest zakończona, co oznacza usztywnienie ogona, użyj 10 mililitrów heparynizowanej soli fizjologicznej, aby wypłukać formaldehyd. Przygotować nieprzezroczysty środek kontrastowy zgodnie z instrukcjami producenta.
Mieszając rozcieńczalnik złożony i utwardzacz w plastikowej tubie, należy perfaktorować zwierzę środkiem kontrastowym w tempie jednego mililitra na minutę. Tętnice wieńcowe, jelitowe i wątrobowe powinny zmienić kolor na żółty po zakończeniu perfuzji. Przyciąć rurkę do igły motylkowej i zawinąć tuszę w papier, aby zapobiec wyciekowi roztworu do okolicy kalwarii.
Umieść zwierzę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc, aby umożliwić polimeryzację następnego dnia. Aby wypreparować okolicę kości nazębnej, użyj skalpela, aby przeciąć skórę tak bokiem, jak to możliwe, unikając uszkodzenia interesującego obszaru czaszki. Zlokalizuj przeszczep kostny, a następnie użyj cienkich nożyczek, aby przeciąć kość czaszki w odległości 10 milimetrów od przeszczepu.
Za pomocą mikrotomografu komputerowego. Ustaw pole widzenia na 20,5 milimetra, energię promieniowania rentgenowskiego na 55 KVP, intensywność na 145 mikroamperów, tysiąc projekcji na 360 stopni i czas całkowania 200 milisekund. Zeskanuj izolowaną próbkę kości łydkowej.
Obserwuj zrekonstruowane w 2D warstwy, które zostały wygenerowane przez oprogramowanie do mikrotomografii komputerowej. Upewnij się, że prawidłowo zeskanowałeś obszar zainteresowania, a następnie zlokalizuj ubytek kalwarii. Jeśli perfuzjonowane naczynia są łatwe do zidentyfikowania, należy użyć 6% kwasu trichlorooctowego rozcieńczonego w wodzie podwójnie destylowanej.
Aby odwapnić próbkę, należy ją ponownie zeskanować, używając tych samych parametrów, które właśnie opisano. Zlokalizuj szew lambdoid w zrekonstruowanych wycinkach 2D. Zdefiniuj cylindryczną objętość będącą przedmiotem zainteresowania lub VOI o wysokości dwóch milimetrów i średnicy ośmiu milimetrów, która jest styczna do szwu.
Jest to anatomiczne miejsce ubytku. Obok segmentacji kości od tkanki miękkiej. Ustaw dolny próg na 130 i zastosuj ograniczony filtr gaussowski 3D, aby częściowo stłumić szumy w głośnościach.
Wygeneruj rekonstrukcję 3D. Upewnij się, że VOI jest prawidłowo ustawiony za pomocą oprogramowania IPL i obiektu DT. Funkcja Peram generuje mapę grubości.
Ta funkcja opisuje objętość naczynia dla każdej średnicy naczynia, przeprowadzaj obrazowanie i mikrotomografię komputerową. Zgodnie z protokołem tekstowym, jak pokazano tutaj, siedem dni po operacji, tomografia komputerowa wykazała znacznie większą objętość naczyń krwionośnych o małej i średniej średnicy, które odżywiały cały obszar przeszczepu u myszy, które otrzymały autografy, w przeciwieństwie do myszy otrzymujących alloprzeszczepy, w których naczynia wydawały się przenikać z zewnątrz. Ponadto obrazowanie fluorescencyjne wykazało znacznie wyższą perfuzję krwi u zwierząt leczonych autografem.
Do 14 dnia drzewo naczyniowe w alloprzeszczepie osiąga całą bliskość wszystkich przeszczepów. Jednak objętość naczynia była znacznie mniejsza w porównaniu z grupą Autographt. Różnica ta była najbardziej widoczna, gdy porównano naczynia o średnicy od 0,08 do 0,1 milimetra, jak widać tutaj 28 dni po operacji, objętość naczyń krwionośnych powróciła do wartości wyjściowej siedem dni po operacji.
Grupa autoprzeszczepów wykazała znacznie większą mineralizację kości, co zaobserwowano za pomocą obrazowania fluorescencyjnego przy użyciu sondy skierowanej na hydroksyapatyt. Kość uformowała się w całej odległości przeszczepu w tej grupie, podczas gdy w grupie alloprzeszczepu tworzyła się tylko na brzegach ubytków, co oznaczono kształtem pierścienia 56 dni po operacji, objętość kości była znacznie większa, a grubość przeszczepu była znacznie większa u zwierząt, które otrzymały autografy w porównaniu z przeszczepami allogenicznymi Po opanowaniu tę technikę chirurgiczną można wykonać w około 25 minut. Po tej procedurze można wykonać obrazowanie fluorescencyjne przy użyciu innych prób, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład aktywność osteoklastów i zaangażowanie odpowiedzi immunologicznej.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obrazować regenerację kości w podstawowej angiogenezie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
To badanie przedstawia multimodalny protokół obrazowania do badania integracji przeszczepów kości czaszki, koncentrując się na związku między neowaskularyzacją a regeneracją kości. Technika ma na celu wyjaśnienie powiązania osteogenezy i angiogeneszy w leczeniu ubytków kości czaszkowo-twarzowych.
This multimodal imaging approach enables quantitative assessment of osteogenesis-angiogenesis coupling, a critical factor in bone graft integration and regenerative medicine outcomes. By providing high-resolution 3D vascular and bone formation data, the method supports target validation and mechanistic de-risking in preclinical bone healing studies. It offers predictive value for evaluating graft efficacy and informing go/no-go decisions in osteoinductive therapeutic development.
The method integrates across the discovery continuum, supporting hypothesis testing in early discovery, assay standardization in screening, and mechanistic validation in preclinical stages.