Tomografia komputerowa i obrazowanie optyczne sprzężenia osteogeneza-angiogeneza w celu oceny integracji autoprzeszczepów kości czaszki i alloprzeszczepów

Ogólnym celem niniejszej procedury jest monitorowanie integracji przeszczepów kości czaszki pod kątem regeneracji kości i neowaskularyzacji przy użyciu multimodalnych podejść obrazowych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, takie jak sprzężenie osteogenezy i angiogenezy. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona wysoką rozdzielczość 3D struktury naczyń krwionośnych i umożliwia badanie całego narządu; procedura zostanie przeprowadzona przez Dorona Vica, doktoranta w moim laboratorium, po eutanazji myszy szczepu BALB/c w wieku od siedmiu do ośmiu tygodni.

Zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć maszynki do strzyżenia, aby ogolić obszar sklepienia czaszki pod włos. Na tułów i głowę zwłok należy nanieść 70% izopropanolu w celu dezynfekcji. Następnie, używając skalpela nr 11, należy naciąć skórę skalpu i usunąć okostną za pomocą wiertarki stomatologicznej z wiertłem o średnicy wewnętrznej 4,5 mm.

Odseparuj okrągły fragment kości sklepienia czaszki. Przenieś fragment kości do plastikowej szalki o średnicy 100 milimetrów zawierającej sterylną sól fizjologiczną. Na tym etapie za pomocą pęsety zakrzywionej usuń krew i tkankę miękką przylegającą do fragmentu kości.

Przechwytuj po jednym fragmencie kości i za pomocą aplikatora z bawełnianym końcem dokładnie go przemywaj, usuwając wszelką tkankę mózgową, tkankę miękką oraz krew. Używając precyzyjnych nożyczek, delikatnie odetnij wszelkie odłamki kostne, które pozostały przyczepione do przeszczepu, aby uzyskał on idealnie zaokrąglony kształt.

Zanurz każdy przeszczep raz w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 70% etanol oraz dwukrotnie w probówkach o pojemności 15 ml zawierających PBS, aby wypłukać etanol. Zamroź allograft w zamrażarce w temperaturze -80 °C w probówkach kriogenicznych na co najmniej jeden tydzień. Pracując z biorczymi myszami transgenicznymi, które wykazują ekspresję lucyferazy pod kontrolą promotora osteokalcyny, upewnij się, że allograft jest przezroczysty.

Po znieczuleniu samicy myszy w wieku od siedmiu do ośmiu tygodni przy użyciu środków znieczulających do podania wstrzykniętego oraz zweryfikowaniu sedacji, należy użyć trymera do włosów, goląc regiony sklepienia czaszki pod włos. Następnie należy zastosować preparat do depilacji w celu usunięcia pozostałości sierści, a po upływie nie więcej niż dwóch minut wytrzeć go suchą gazą.

Następnie należy przetrzeć ten obszar gazą nasączoną solą fizjologiczną. Skórę głowy odkaźyć poprzez podskórne podanie 5% chlorheksydyny. Wstrzyknąć carprofen w dawce 5 mg/kg, rozpuszczony w 200 µL soli fizjologicznej.

Nanieś maść do oczu, aby zapobiec wysychaniu, i przez cały czas utrzymuj zwierzę na podkładce termicznej. Następnie umieść zwierzę pod okularami chirurgicznymi. Dalej, używając precyzyjnych nożyczek i pęsety, wykonaj w skórze czaszki nacięcie owalne o długości jednego centymetra.

Przytrzymaj okostną i za pomocą precyzyjnych nożyczek odetnij ją, a następnie używając wiertarki stomatologicznej i wiertła korygującego o średnicy zewnętrznej 5 mm, wykonaj ubytek w czaszce na 2 mm przed szwem lambdoidalnym, aby uniknąć przebicia opony twardej. Wywierć otwór na trzy czwarte grubości kości i za pomocą szpatułki odseparuj fragment kostny. Krytycznym krokiem w protokole jest precyzyjne wyznaczenie lokalizacji ubytku.

Uszkodzenie szwu laboratoryjnego doprowadzi do masywnego krwawienia. Należy zatem zachować ostrożność, aby nie uszkodzić znajdującej się poniżej twardówki oraz zatoki górnej. W celu wszczepienia autoprzeszczepu.

Użyj 10 ml sterylnej soli fizjologicznej w 10 mm plastikowej płytce, aby wypłukać fragment kości. Usuń skrzepy krwi, nie usuwając tkanek miękkich, aby zaimplantować wcześniej rozmrożony allograft i doprowadzić próbkę do temperatury pokojowej. Następnie wypłucz fragment kości za pomocą zakrzywionej pęsety.

Umieść przeszczep kostny w ubytku w taki sposób, aby nie dotykał on jego krawędzi. Następnie, używając żelu fibrynowego, przyklej przeszczep do kości biorcy. Zaszyj skórę szwem Vicryl 4-0 i zastosuj povidon jodowy na nacięcie chirurgiczne.

Zaznaczyć ucho myszy i wstrzyknąć 0,25 mg/kg anty-sedanu w celu odwrócenia działania anestetycznego medetomidolu. Prowadzić opiekę pooperacyjną zgodnie z protokołem tekstowym.

Przygotuj sól fizjologiczną z heparyną, odważając 2000 jednostek heparyny sodowej i przenosząc ją do probówki o pojemności 50 ml. Do probówki dodaj 20 ml sterylnej soli fizjologicznej i wymieszaj. Napełnij starannie strzykawkę Luer-Lock o pojemności 20 ml za pomocą 15 ml podgrzanej soli fizjologicznej z heparyną, a następnie podłącz strzykawkę do zestawu do wkłuć w żyłę skórną o rozmiarze 23G.

Przymocuj strzykawkę do pompy strzykawkowej i ustaw pompę na 10 milliliters z prędkością one milliliter per minute. Po znieczuleniu myszy zgodnie z protokołem tekstowym, potwierdź sedację poprzez uciśnięcie palca u nogi i unieruchom mysz na grzbiecie na desce stabilizacyjnej owiniętej chłonną wyściółką.

Następnie nacięto skórę od brzucha do szyi. Przecięto ścianę brzucha aż do wyrostka mieczowatego. Następnie przecięto klatkę piersiową wzdłuż jej bocznej strony, upewniając się, że serce jest w pełni odsłonięte, a serce i płuca nie zostały uszkodzone.

Użyj kleszczyków hemostatycznych do odciągnięcia mostka. Wprowadź igłę motylkową na trzy milimetry do lewej komory. Następnie, używając kleju trzechsekundowego, przyklej igłę do serca i ściany klatki piersiowej. Wprowadzenie igły motylkowej do lewej komory jest procedurą delikatną.

Należy unikać wprowadzania kaniuli do prawej komory lub zbyt głęboko do lewej komory, aby nie przebić tylnej ściany serca. Następnie należy niezwłocznie uruchomić pompę. Po minucie należy przeprowadzić sekcję żyły głównej dolnej w celu odbarczenia naczyń krwionośnych.

Przechyl deskę tak, aby płyny odpływały od głowy. Prawidłowa perfuzja spowoduje oczyszczenie wątroby i naczyń krwionośnych. Następnie przeprowadzono perfuzję 10 milliliters 4%formaldehyde.

Należy zapobiegać przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do naczyń krwionośnych. Po zakończeniu perfuzji, o czym świadczy usztywnienie ogona, należy użyć 10 mililitrów soli fizjologicznej z heparyną, aby wypłukać formaldehyd. Przygotuj radiokontrastowy środek kontrastowy zgodnie z instrukcją producenta.

Po wymieszaniu rozcieńczalnika związku i utwardzacza w plastikowej probówce, przeprowadź perfuzję zwierzęcia środkiem kontrastowym z prędkością 1 ml na minutę. Po zakończeniu perfuzji tętnice wieńcowe, jelitowe i wątrobowe powinny zmienić kolor na żółty. Odetnij dren prowadzący do igły motylkowej i owiń truchło papierem, aby zapobiec wyciekowi roztworu do obszaru sklepienia czaszki.

Przechowywać zwierzę w temperaturze czterech stopni Celsius overnight, aby umożliwić polimeryzację następnego dnia. W celu wycięcia obszaru sklepienia czaszki, należy użyć skalpela, aby naciąć skórę tak bocznie, jak to możliwe, unikając uszkodzenia docelowego regionu czaszki. Zlokalizować przeszczep kostny, a następnie za pomocą precyzyjnych nożyczek wyciąć kość czaszki w odległości 10 milimetrów od przeszczepu.

Użycie skanera mikro-CT. Ustaw pole widzenia na 20.5 mm, energię promieniowania rentgenowskiego na 55 kVp, natężenie na 145 µA, tysiąc projekcji na 360 stopni oraz czas integracji wynoszący 200 ms. Przeprowadź skanowanie wyizolowanej próbki kości sklepienia czaszki.

Przeanalizuj zrekonstruowane przekroje 2D wygenerowane przez oprogramowanie do mikro-tomografii komputerowej (micro CT). Upewnij się, że obszar zainteresowania został prawidłowo zeskanowany, a następnie zlokalizuj defekt czaszki. Jeśli perfundowane naczynia są łatwo identyfikowalne, zastosuj 6% kwas trójchlorooctowy rozcieńczony w wodzie dwukrotnie destylowanej.

Aby przeprowadzić dekalcyfikację próbki, ponownie przeskanuj ją, stosując parametry opisane powyżej. Zlokalizuj szew jagodnicowy na zrekonstruowanych przekrojach 2D. Wyznacz cylindryczny obszar zainteresowania (VOI) o wysokości 2 mm i średnicy 8 mm, który będzie styczny do szwu.

Jest to miejsce anatomiczne wystąpienia wady. Następnie należy wyodrębnić kość z tkanki miękkiej. Ustaw próg dolny na 130 i zastosuj ograniczony filtr Gaussa 3D, aby częściowo stłumić szumy w wolumenach.

Wygeneruj rekonstrukcję 3D. Upewnij się, że obszar zainteresowania (VOI) jest odpowiednio ustawiony przy użyciu oprogramowania IPL oraz obiektu DT. Funkcja Peram generuje mapę grubości.

Funkcja ta opisuje objętość naczyń dla każdej średnicy naczyń poddanych obrazowaniu i mikrotomografii komputerowej. Zgodnie z protokołem tekstowym, jak pokazano tutaj, siedem dni po operacji badanie CT wykazało znacznie większą objętość małych i średnich naczyń krwionośnych odżywiających cały obszar przeszczepu u myszy, które otrzymały autografty, w przeciwieństwie do myszy, które otrzymały allografty, u których naczynia zdawały się przenikać z zewnątrz. Ponadto obrazowanie fluorescencyjne wykazało znacznie wyższą perfuzję krwi u zwierząt leczonych autograftami.

Do 14. dnia drzewo naczyniowe w alloprzeszczepie objęło cały obszar graftu. Jednak objętość naczyń była znacznie niższa w porównaniu z grupą Autograft. Różnica ta była najbardziej widoczna przy porównaniu naczyń o średnicach od 0,08 do 0,1 milimetra; jak widać tutaj, 28 dni po operacji objętość naczyń powróciła do poziomu wyjściowego siedem dni po zabiegu.

W grupie z autoszczepem wykazano znacznie większą mineralizację kości, co potwierdzono obrazowaniem fluorescencyjnym z użyciem sondy skierowanej na hydroksyapatyt. Kość w tej grupie formowała się w całym obszarze wokół szczepu, podczas gdy w grupie z alloszczepem formowała się ona jedynie na obrzeżach defektu, tworząc kształt pierścienia 56 dni po operacji; objętość kości była znacznie większa, a grubość szczepu znacznie większa u zwierząt, które otrzymały autoszczepy w porównaniu do alloszczepów. Po opanowaniu techniki ta procedura chirurgiczna może zostać wykonana w około 25 minut. Po tym zabiegu można przeprowadzić obrazowanie fluorescencyjne z użyciem innych sond w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące aktywności osteoklastów i zaangażowania odpowiedzi immunologicznej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć sposób obrazowania regeneracji kości oraz towarzyszącej jej angiogenezy.