Name: Testy specyficznej szybkości wzrostu i zdolności wiązania komórkowego rotawirusa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Poznaj metody pomiaru specyficznej szybkości wzrostu i zdolności wiązania komórkowego rotawirusa przy użyciu testu plakowego i RT-qPCR. Protokoły te umożliwiają ocenę różnic fenotypowych między szczepami wirusa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez projekt "The Sanitation Value Chain: Designing Sanitation Systems as Eco-Community Value System", ResearchInstitute for Humanity and Nature (RIHN, Project No.14200107).

1. Przygotowanie podłoża
<ol>
	<li>Aby przygotować pożywkę do hodowli komórkowych (pożywkę zawierającą surowicę), dodaj 4,7 g proszku Eagle's MEM do 500 ml wody destylowanej. Autoklawać w temperaturze 120 °C przez 20 minut i pozostawić pożywkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Dodać płodową surowicę bydlęcą (końcowe stężenie: 10%), L-glutaminę (2 mM), penicylinę Streptomycynę (1%) i wodorowęglan sodu (1,125 g/l). Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.</li>
	<li>Przygotować pożywkę wolną od surowicy do namnażania wirusa, jak opisano w kroku 1.1, ale bez płodowej surowicy bydlęcej. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.</li>
	<li>W przypadku testu płytki nazębnej wysterylizuj 100 ml pożywki MEM Eagle'a (niezawierającej czerwieni fenolowej) w autoklawie. Pozostaw pożywkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie dodaj 2% FBS, 2% penicyliny Streptomycyny, 4 mM L-Glutaminy i 2,25 g/L NaHCO3. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>W celu oznaczenia płytki nazębnej wysterylizuj 100 ml 2,5% żelu agarozowego w autoklawie. Żel należy przygotować tego samego dnia, w którym przeprowadza się test płytki nazębnej. Przechowywać żel w temperaturze 47 °C w łaźni wodnej.</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Wyjmij krioprobówkę zawierającą linie komórkowe MA104 z pojemnika na ciekły azot. Umieścić krioprobówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby rozmrozić komórki. Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do 20 ml pożywki zawierającej surowicę w kolbie T75. Inkubować kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 lub 3 dni. 
	nuta: Końcowe stężenie komórek w zawiesinie wynosi około 106 komórek/ml.</li>
	<li>Gdy monowarstwa komórkowa osiągnie 80% zbieżności, usuń supernatant i umyj komórki dwukrotnie 5 ml 1x PBS Dulbecco (sól fizjologiczna buforowana fosforanem).</li>
	<li>Dodać 4 ml 0,05% trypsyny-EDTA do kolby i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut w celu odłączenia komórek od kolby. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 190 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki (10-6 komórek) w 1 ml pożywki zawierającej surowicę przygotowanej w 1.1. Rozcieńczyć zawieszone komórki 100-krotnie pożywką.</li>
	<li>Dodać 3 ml rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do każdej studzienki odpowiednio 6-dołkowej (do testu płytki blaszkowej) lub 24-dołkowej (do testu wiązania komórek). Inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 pod nasyconą parą przez 2 lub 3 dni. 
	nuta: Kolba T75 jest odpowiednia do pobierania próbek w czasie, ponieważ objętość próbki supernatantu (1 ml) może być zignorowana w porównaniu z całkowitą objętością supernatantu (30 ml). Tymczasem zakaźne miano wirusa w każdym supernatancie mierzy się za pomocą testu płytki nazębnej, który zwykle przeprowadza się przy użyciu płytki 6-dołkowej. Do testu wiązania komórek wykorzystuje się 24-dołkową płytkę.</li>
</ol>
3. Specyficzne tempo wzrostu rotawirusa
UWAGA: Rotawirus Rh (RRV, genotyp: G3P[3]) jest wykorzystywany w tym protokole, ponieważ RRV może szybko i łatwo tworzyć blaszki z komórkami MA104.
<ol>
	<li>Umieścić probówkę zawierającą 1 ml zawiesiny wirusa (107 pfu/ml) w podłożu bez surowicy przechowywanej w temperaturze -80 °C w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do rozmrożenia. Dodać 1 μg/μl trypsyny z trzustki świń do 1 ml zawiesiny wirusa (końcowe stężenie trypsyny wynosi 4 μg/ml), a następnie odwirować. Zawiesinę wirusa inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 pod nasyconą parą przez 30 min. 
	nuta: Można stosować trypsynę z innych źródeł, ale jej wpływ na zakaźność rotawirusa musi być wcześniej przetestowany.</li>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę aktywowanego wirusa pożywką bez surowicy, aby dostosować mnogość infekcji (MOI) do 0,1 pfu/komórkę.</li>
	<li>Dodać 1 ml rozcieńczonej zawiesiny wirusa do linii komórkowych MA104 (80% zlewających się) w kolbie T75 3 dni po posiewie komórek (2.1), inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę i delikatnie wstrząsać kolbą co 15 minut.</li>
	<li>Następnie dodać do kolby 30 ml pożywki bez surowicy zawierającej 0,13 μg/ml trypsyny z trzustki świni. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 pod nasyconą parą.</li>
	<li>Zebrać 1 ml supernatantu w kolbie po 0, 6, 12, 18, 24 i 36 (i/lub 48) godzinach po zakażeniu (hpi) i zastąpić supernatant w probówkach o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety.</li>
	<li>Przeprowadzić zamrażanie (-80 °C) i trzykrotnie roztopić w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Następnie odwirować probówki o stężeniu 12 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant.</li>
	<li>Przefiltrować supernatant za pomocą destylowanego filtra 0,2 μm w celu usunięcia frakcji komórkowej. Przechowywać supernatant w temperaturze -80 °C w lodówce do czasu nałożenia go na test płytki rozsiewającej w celu zmierzenia miana wirusa.</li>
	<li>Umieścić probówki zawierające zebrany supernatant (krok 3.5) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Dodać 4 μg/ml trypsyny do 1 ml 10-krotnie rozcieńczonej próbki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Podczas 30-minutowej inkubacji w ppkt 3.8, w celu rozpoczęcia testu płytki nazębnej w celu pomiaru miana wirusa uzyskanego z próbek pobranych w czasie (etap 3.5), należy dwukrotnie przemyć komórki MA104 na 6-dołkowej płytce z 2 ml 1x PBS po usunięciu pożywki zawierającej surowicę.</li>
	<li>Seryjnie rozcieńczyć inkubowane próbki pożywką pozbawioną surowicy i zaszczepić 1 ml rozcieńczonej próbki do każdej studzienki. Inkubować płytkę przez 90 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 pod nasyconą parą i delikatnie wstrząsać płytką co 15 minut.</li>
	<li>Po inkubacji wyjąć inokulum z płytki 6-dołkowej. Dodać 4 μg/ml trypsyny do podłoża przygotowanego w (krok 1.3). Delikatnie, ale natychmiast dodaj 3 ml pożywki zmieszanej z żelem agarozowym (w stosunku 1:1) do każdego dołka.</li>
	<li>Przechowywać płytkę w temperaturze pokojowej przez ponad 10 minut (do momentu, gdy żel agarozowy stanie się stały) i inkubować przez 2 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 pod nasyconą parą. 
	nuta: Wlej pożywkę zmieszaną z agarem od krawędzi studzienki.</li>
	<li>Dodać 1 ml 0,015% obojętnego roztworu czerwonego rozcieńczonego 1x PBS do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 pod nasyconą parą. Usunąć barwnik po 3 godzinach i inkubować przez 1 dzień w temperaturze 37 °C i 5% CO2 pod nasyconą parą.</li>
	<li>Następnego dnia policz liczbę blaszek w każdej studzience i oblicz pfu/ml. Dokładnie sprawdź zbieg komórek przed testem płytki, aby upewnić się, że liczba płytek jest znana.</li>
</ol>
4. Test wiązania komórek
UWAGA: Ten protokół jest oparty na raporcie Gillinga13.
<ol>
	<li>Dodać 1 μg/μl trypsyny z trzustki świni do 1 ml zawiesiny wirusa (końcowe stężenie trypsyny wynosi 4 μg/ml), a następnie przeszukać wir (w taki sam sposób jak w ppkt 2.1). Rozcieńczyć zawiesinę wirusa pożywką bez surowicy, aby dostosować MOI do 1 pfu/komórkę.</li>
	<li>Następnie przemyć komórki MA104 dwukrotnie na 24-dołkowej płytce 1 ml soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS; 2,53 g/l zasady Tris, 6,54 g/l NaCl, 0,3 g/l KCl, 0,046 g/l Na2HPO4, aż do osiągnięcia 1 l z wodą destylowaną).</li>
	<li>Zaszczepić 100 μl rozcieńczonej zawiesiny wirusa do każdego dołka na 24-dołkowej płytce z komórkami i inkubować w temperaturze 4 °C przez 90 minut, delikatnie wstrząsając co 15 minut.</li>
	<li>Usunąć inokulum wirusa i dwukrotnie przemyć komórki 1 ml TBS. Aby wyekstrahować dwuniciowy (ds) RNA rotawirusa, dodaj 140 μl 1x PBS i 560 μl buforu do ekstrakcji RNA (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki. Odpowiednio wymieszać pipetą (około 10 razy lub do momentu, gdy nie będzie widać zamglenia lub zanieczyszczenia komórek w buforze).</li>
	<li>Po odzyskaniu dwuniciowego RNA (dsRNA) zgodnie z protokołem producenta, należy umieścić probówki o pojemności 1,5 ml zawierające ekstrakt dsRNA na bloku grzewczym w temperaturze 95 °C na 5 minut w celu denaturacji dsRNA, a następnie natychmiast umieścić probówki na lodzie i inkubować przez ponad 2 minuty.</li>
	<li>Zsyntetyzuj cDNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji (patrz Tabela materiałów). Dodać 4 μl roztworu RNA denaturowanego wirusa do probówki PCR zawierającej 16 μl mieszaniny (tabela 1) i dokładnie wymieszać pipetą, aby nie powstawały pęcherzyki. Zakręć rurkami.</li>
	<li>Przeprowadzić odwrotną transkrypcję za pomocą termocyklera w warunkach przedstawionych w Tabeli 2. Jeśli cDNA nie zostanie natychmiast zużyte, probówkę PCR zawierającą cDNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.</li>
	<li>Użyj starterów do ilościowego PCR (Forward; 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3', Reverse; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')14 i sondy wprowadzającej wygaszacz (qPCR Probes; 5'-/FAM/ATGAGCACA/quencher/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/TAMRA/-3'), celując w region 963 – 1049 segmentu genomu NSP3 rotawirusa (szczep ST3, GenBank: X81436). 
	UWAGA: Quencher jest wstawiany do sondy zaprojektowanej przez Zeng et al.14</li>
	<li>Rozcieńczyć wzorcowy plazmid szeregowo (101 do 106 kopii/ml) wodą klasy PCR do mieszaniny qPCR (tabela 3) i przygotować mieszaninę wzorcową (20 μl / próbkę) do qPCR zgodnie z tabelą 4.</li>
	<li>Dodać 20 μl mieszanki wzorcowej do dołka 96-dołkowej płytki PCR, a następnie wymieszać 5 μl próbek cDNA lub 5 μl wzorcowego plazmidu, pipetując 10 razy. Rozpocząć reakcję systemu qPCR zgodnie z warunkami przedstawionymi w tabeli 4.</li>
	<li>Aby obliczyć genom rotawirusa związany z powierzchnią komórki MA104, należy przeprowadzić regresję liniową między wartościami Ct a znaną liczbą genomu standardowego plazmidu i oszacować liczbę genomu próbki. Następnie obliczyć stosunek liczby wirionów wiążących się z komórkami (Gt) do tych w początkowym inokulum (G0).</li>
</ol>

<ol><li>Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rna+Virus+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Rna Virus Mutations.</a> Annual review of microbiology. 51, 151-178 (1997).</li>
<li>Gouvea, V., Brantly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+rotavirus+a+population+of+reassortants%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Is rotavirus a population of reassortants?</a> Trends in Microbiology. 3, 159-162 (1995).</li>
<li>Rachmadi, A. T., Kitajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-chlorine+disinfection+as+a+selection+pressure+on+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Free-chlorine disinfection as a selection pressure on norovirus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84, (2018).</li>
<li>Ghosh, S., Kobayashi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genomic+analysis+of+rotavirus+strains%3A+current+status+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Whole-genomic analysis of rotavirus strains: current status and future prospects.</a> Future Microbiology. 6, 1049-1065 (2011).</li>
<li>Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Steele, A. D., Duque, J., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2008+estimate+of+worldwide+rotavirus-associated+mortality+in+children+younger+than+5+years+before+the+introduction+of+universal+rotavirus+vaccination+programmes%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">2008 estimate of worldwide rotavirus-associated mortality in children younger than 5 years before the introduction of universal rotavirus vaccination programmes: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Infectious Diseases. 12, 136-141 (2008).</li>
<li>Franco, M. A., Angel, J., Greenberg, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+and+correlates+of+protection+for+rotavirus+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Immunity and correlates of protection for rotavirus vaccines.</a> Vaccine. 24, 2718-2731 (2006).</li>
<li>Santos, N., Hoshino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+distribution+of+rotavirus+serotypes%2F+genotypes+and+its+implication+for+the+development+and+implementation+of+an+effective+rotavirus+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Global distribution of rotavirus serotypes/ genotypes and its implication for the development and implementation of an effective rotavirus vaccine.</a> Reviews in Medical Virology. 15, 29-56 (2005).</li>
<li>Matthijnssens, J., Heylen, E., Zeller, M., Rahman, M., Lemey, P., Van Ranst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylodynamic+analyses+of+rotavirus+genotypes+G9+and+G12+underscore+their+potential+for+swift+global+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Phylodynamic analyses of rotavirus genotypes G9 and G12 underscore their potential for swift global spread.</a> Molecular Biology and Evolution. 27, 2431-2436 (2010).</li>
<li>Mukhopadhya, I., Murdoch, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+molecular+epidemiology+of+rotavirus+infection+after+introduction+of+monovalent+rotavirus+vaccination+in+Scotland%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Changing molecular epidemiology of rotavirus infection after introduction of monovalent rotavirus vaccination in Scotland.</a> Vaccine. 35, 156-163 (2017).</li>
<li>Londrigan, S. L., Hewish, M. J., Thomson, M. J., Sanders, G. M., Mustafa, H., Coulson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+rotaviruses+in+continuous+human+and+monkey+cell+lines+that+vary+in+their+expression+of+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Growth of rotaviruses in continuous human and monkey cell lines that vary in their expression of integrins.</a> Journal of General Virology. 81, 2203-2213 (2000).</li>
<li>Hewish, M. J., Takada, Y., Coulson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+a2b1+and+a4b1+can+mediate+SA11+rotavirus+attachment+and+entry+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Integrins a2b1 and a4b1 can mediate SA11 rotavirus attachment and entry into cells.</a> Journal of Virology. 74, 228-236 (2000).</li>
<li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+the+bacterial+growth+curve%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Applied and Environmental Microbiology. 56, 1875-1881 (1990).</li>
<li>Gilling, D. H., Kitajima, M., Torrey, J. R., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+antiviral+action+of+plant+antimicrobials+against+murine+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of antiviral action of plant antimicrobials against murine norovirus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80, 4898-4910 (2014).</li>
<li>Zeng, S. Q., Halkosalo, A., Salminen, M., Szakal, E. D., Puustinen, L., Vesikari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+quantitative+RT-PCR+for+the+detection+of+rotavirus+in+acute+gastroenteritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">One-step quantitative RT-PCR for the detection of rotavirus in acute gastroenteritis.</a> Journal of Virological Methods. 153, 238-240 (2008).</li>
<li>Rolsma, M. D., Gelberg, H. B., Kuhlenschmidt, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+for+evaluation+of+rotavirus-cell+interactions%3A+identification+of+an+enterocyte+ganglioside+fraction+that+mediates+group+A+porcine+rotavirus+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Assay for evaluation of rotavirus-cell interactions: identification of an enterocyte ganglioside fraction that mediates group A porcine rotavirus recognition.</a> Journal of Virology. 68, 258-268 (1994).</li>
<li>Brüssow, H., Hilpert, H., Walther, I., Sidoti, J., Mietens, C., Bachmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+milk+immunoglobulins+for+passive+immunity+to+infantile+rotavirus+gastroenteritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bovine milk immunoglobulins for passive immunity to infantile rotavirus gastroenteritis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 25, 982-986 (1987).</li>
<li>Outzen, H., Berglund, G. I., Smalås, A. O., Willassen, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+and+pH+sensitivity+of+trypsins+from+Atlantic+salmon+%28Salmo+salar%29+in+comparison+with+bovine+and+porcine+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+B+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Temperature and pH sensitivity of trypsins from Atlantic salmon (Salmo salar) in comparison with bovine and porcine trypsin.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - B Biochemistry and Molecular Biology. 115B, 33-45 (1996).</li>
<li>Saxena, K., Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Intestinal+Enteroids%3A+a+New+Model+To+Study+Human+Rotavirus+Infection%2C+Host+Restriction%2C+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90, 43-56 (2016).</li>
<li>Yin, Y., Bijvelds, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+rotavirus+infection+and+antiviral+therapy+using+primary+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Modeling rotavirus infection and antiviral therapy using primary intestinal organoids.</a> Antiviral Research. 123, 120-131 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nasz protokół pomiaru specyficznego tempa wzrostu jest łatwiejszy niż poprzednie i może być dostosowany do innych wirusów, chyba że ich system hodowli komórkowej nie został jeszcze ustalony. W tym badaniu użyliśmy RRV (G3P[3]), ponieważ szczep ten może tworzyć płytki łatwiej niż ludzkie rotawirusy przy użyciu linii komórkowych MA104. Niektóre ludzkie szczepy rotawirusów nie mogą tworzyć płytki nazębnej w tej linii komórkowej. Dlatego zamiast testu płytki nazębnej, dla wielu szczepów rotawirusa można zastosować test jednostki tworzącej ognisko (FFU)15 lub test mediany dawki zakaźnej w kulturze tkankowej(TCID50). Przedstawiony protokół określania właściwej szybkości wzrostu może być stosowany dla innych typów wirusów, ale nie jest odpowiedni dla wirusów, dla których nie ustalono systemu hodowli komórkowych. Przed rozpoczęciem eksperymentu dotyczącego określonej szybkości wzrostu lepiej jest wiedzieć z wyprzedzeniem, kiedy miano zakaźne wirusa zaczyna rosnąć i osiąga fazę stacjonarną we wstępnym teście. W przypadku obecności zbyt wielu blaszek miażdżycowych, test płytki należy przeprowadzić ponownie po zmianie szybkości rozcieńczenia próbek wirusa. Godziny po infekcji (hpi) na pobranie próbek są również ważne, ponieważ nachylenie fazy wzrostu wykładniczego może być niedoszacowane, jeśli zostanie pominięty właściwy punkt czasowy do osiągnięcia fazy stacjonarnej. W aproksymacji za pomocą zmodyfikowanego modelu Gompertza zawsze należy obliczyć i sprawdzić współczynnik determinacji. Jeżeli dopasowanie do zmodyfikowanego modelu Gompertza jest niskie, preferowane mogą być inne modele wzrostu, takie jak zmodyfikowany model logistyczny12 .
Podczas obchodzenia się z komórkami, podczas usuwania pożywki lub inokulum wirusa, PBS do przemywania lub żel agarozowy do oznaczania płytki płytki musi być niezwłocznie dodany do każdego dołka płytki do hodowli komórkowej, aby zapobiec wysuszeniu komórek. W tym samym czasie należy delikatnie wlać PBS lub agarozę do komórek, aby nie oderwały się od studzienek. Ten krok jest najważniejszy w obu testach (krok 3.9 i 3.11). Jeśli test płytki nazębnej zawiera zbyt wiele próbek, zalecamy podzielenie żelu agarozowego (zalecane jest 100 ml każdego maksimum) na kilka średnich butelek i utrzymywanie butelek w cieple do momentu tuż przed użyciem, ponieważ żel agarozowy zestala się w ciągu około 10 minut w temperaturze pokojowej. Ponieważ trypsyna jest wrażliwa na wysokie temperatury17, roztwór trypsyny należy dodać do pożywki i agarozy do testu płytki nazębnej po odpowiednim schłodzeniu.
W teście wiązania komórek inkubacja w celu wiązania wirusa z komórkami musi być przeprowadzona w temperaturze 4 °C, aby zapobiec inwazji komórek. Zgodnie z metodą Gillinga13 komórki są podatne na wysychanie w niskich temperaturach, dlatego podczas inkubacji konieczne jest delikatne potrząsanie co 15 minut. Zastosowany tutaj zestaw do ekstrakcji RNA można zastąpić innymi zestawami. Nachylenie krzywej wzorcowej w RT-qPCR powinno wynosić około 3,3, a współczynnik determinacji powinien być większy niż 0,98. W porównaniu z mikroskopem fluorescencyjnym do wizualizacji lokalizacji wirusów w komórkach, test jest szybszy i łatwiejszy w użyciu, ponieważ wiązanie substancji fluorescencyjnych z wirusami nie jest konieczne.
Ostatnio ludzki enteroid jelitowy (HIE), wykazujący podobny skład komórkowy i funkcję jak ludzki nabłonek przewodu pokarmowego, stał się dostępny do rozmnażania rotawirusa18. Zastosowanie HIE może umożliwić nam ocenę specyficznego tempa wzrostu i zdolności wiązania komórek szczepów rotawirusa, które nie są hodowane w hodowli. Ponadto, oba opisane tutaj eksperymenty mogą być zastosowane do oceny wpływu leku na oba fenotypy19. Przedstawione tu protokoły pozwalają na ilościowe omówienie zmian wartości parametrów fenotypu szczepów rotawirusa w różnych warunkach.

Wirusy RNA tworzą genetycznie zróżnicowaną populację, znaną jako quasispecies1, ze względu na ich szybkość mutacji,2, która jest wyższa niż u organizmów opartych na DNA. Na strukturę populacji w quasi-gatunkach wpływają czynniki genetyczne populacji, w tym mutacje, presja selekcyjna i dryf genetyczny. Szczepy w obrębie jednej linii genetycznej mogą wykazywać różne fenotypy ze względu na różnorodność genetyczną. Na przykład Rachmadi i wsp. wykazali, że wrażliwość na wolny chlor była różna wśród szczepów mysiego norowirusa, które pochodziły ze szczepu S7-PP33.
Rotawirusy (rodzaj rotawirusów w rodzinie Reoviridae) to bezotoczkowe wirusy ds RNA tworzące quasispecies2. Oprócz opisanych powyżej czynników genetycznych populacji, reasortacja genomu wpływa na różnorodność genetyczną rotawirusa, ponieważ wirus ten ma 11 segmentowanych genomów4. Rotawirusy powodują biegunkę głównie wśród niemowląt, a zgony niemowląt w 2013 roku oszacowano na około 250 0005. Dwie szczepionki są używane w kilku krajach i okazały się skuteczne w zmniejszaniu obciążenia związanego z infekcją rotawirusową, ale niektórzy badacze dyskutują obecnie o obecności mutantów uciekających przed szczepionką6,7,8,9. Charakterystyka tych mutantów jest ważna dla zrozumienia mechanizmów ucieczki ze szczepionki.
Tutaj prezentujemy protokoły dla dwóch testów do oceny specyficznego tempa wzrostu i zdolności wiązania komórek rotawirusa, aby zrozumieć różnice fenotypowe między szczepami/mutantami. Krzywa wzrostu rotawirusów została przedstawiona w poprzednich raportach10, ale parametry wzrostu, takie jak określona szybkość wzrostu, zwykle nie są mierzone. Przeprowadzony wcześniej test wiązania komórek obejmuje technikę barwienia immunofluorescencyjnego11. Pokazujemy tutaj łatwiejsze metody wykorzystania testu płytki nazębnej i RT-qPCR, które pozwalają nam ilościowo omówić różnicę w fenotypach wirusa. Metody te są odpowiednie do charakterystyki fenotypów rotawirusów i mogą ostatecznie przyczynić się do budowy nowych szczepionek skutecznych dla wielu genotypów.

<table><tbody><tr><td>7500 System Real Time PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Agar-EPI</td><td>Nakalai Tesque, Inc</td><td>01101-34</td><td>Test płytki nazębnej</td></tr><tr><td>Wodorofosforan disodowy</td><td>Wako Pure Chemical Corporation</td><td>194-02875</td><td>Test wiązania komórek</td></tr><tr><td>Eagle's MEM "Nissui" <img alt="One" src="/files/ftp_upload/58821/01.jpg"></td><td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>_05900</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Eagle's MEM "Nissui" <img alt="Two" src="/files/ftp_upload/58821/02.jpg"></td><td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>_05901</td><td>Test płytki nazębnej</td></tr><tr><td>EasYFlask 75 cm2</td><td>Thermo Scientific</td><td>156499</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Bydło płodowe Serim, kwalifikowane, regiony zatwierdzone przez USDA</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td>Hodowla komórkowa i test płytki nazębnej</td></tr><tr><td>Startery do przodu / do tyłu</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>L-glutamina, 200 mM Roztwór</td><td>Gibco</td><td>2530081</td><td>Hodowla komórkowa i test płytki nazębnej</td></tr><tr><td>Neutralny czerwony</td><td>Wako Pure Chemical Corporation</td><td>140-00932</td><td>Test płytki nazębnej</td></tr><tr><td>PBS (-) "Nissui"</td><td>Nissui Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>_05913</td><td>Hodowla komórkowa i test płytki nazębnej</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna, Liguid</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Hodowla komórkowa i test płytki nazębnej</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Wako Pure Chemical Corporation</td><td>163-03545</td><td>Test wiązania komórek</td></tr><tr><td>Premix ExTaq (Perfect Real Time)</td><td>TAKARA Bio Inc.</td><td>Zestaw</td> odczynników <td>qPCR</td></tr><tr><td>PrimeScriptTN RT (Perfect Real Time)</td><td>TAKARA Bio Inc.</td><td>RR037A Synteza</td><td>cDNA</td></tr><tr><td>Sondy PrimeTime qPCR Laboratoria</td><td>Medyczne i Biologiczne Co., Ltd.</td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>QIAamp Wirusowy zestaw RNA Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>52904</td><td>Ekstrakcja RNA</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Wako Pure Chemical Corporation</td><td>199-05985</td><td>Hodowla komórkowa i test płytki nazębnej</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Wako Pure Chemical Corporation</td><td>198-01675</td><td>Test wiązania komórek</td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych Płytka 24-dołkowa</td><td>TPP</td><td>92024</td><td>Test wiązania komórek</td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych Płytka 6-dołkowa</td><td>TPP</td><td>92006</td><td>Test płytki nazębnej</td></tr><tr><td>Baza Trizma base</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T1503</td><td>Test wiązania komórek</td></tr><tr><td>Trypsyna z trzustki świni</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T0303-1G</td><td>Aktywuj dla rotawirusa</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Pionowy 96-dołkowy termocykler</td><td>Synteza cDNA firmy Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

testy specyficznej szybkości wzrostu i zdolności wiązania komórkowego rotawirusa

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Rotawirus jest głównym czynnikiem etiologicznym biegunki dziecięcej. Jest to dwuniciowy (ds) wirus RNA i tworzy genetycznie zróżnicowaną populację, znaną jako quasigatunki, ze względu na wysoki wskaźnik mutacji. Tutaj opisujemy, jak mierzyć specyficzne tempo wzrostu i zdolność wiązania komórek rotawirusa jako jego fenotypy. Rotawirus jest traktowany trypsyną w celu rozpoznania receptora komórkowego, a następnie zaszczepiany w hodowli komórkowej MA104. Supernatant, w tym potomkowie wirusa, jest pobierany z przerwami. Test płytki miażdżycowej stosuje się w celu potwierdzenia miana wirusa (jednostka tworząca płytkę: pfu) każdego pobranego supernatantu. Specyficzną szybkość wzrostu szacuje się poprzez dopasowanie danych dotyczących przebiegu w czasie pfu/ml do zmodyfikowanego modelu Gompertza. W teście wiązania komórek, komórki MA104 w 24-dołkowej płytce są zakażone rotawirusem i inkubowane przez 90 minut w temperaturze 4 °C w celu adsorpcji rotawirusa do receptorów komórkowych. Niska temperatura powstrzymuje rotawirusa przed inwazją na komórkę gospodarza. Po umyciu w celu usunięcia niezwiązanych wirionów, RNA jest ekstrahowane z wirionów przyłączonych do receptorów komórkowych, a następnie następuje synteza cDNA i ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR). Protokoły te mogą być stosowane do badania różnic fenotypowych między szczepami wirusa.

Przegląd dwóch protokołów dotyczących szybkości wzrostu specyficznego oraz testu wiązania komórkowego dla szczepów RRV oczyszczonych metodą plackową przedstawiono odpowiednio na Rysunku 1A i 2A.
W teście szybkości wzrostu swoistego końcowy miano wirusa przekracza 107 pfu/mL podczas namnażania w kolbie T75. Jeśli maksymalne stężenie jest niższe niż 107 pfu/mL, komórki MA104 mogły nie osiągnąć pełnej konfluencji lub RRV nie zostało odpowiednio aktywowane trypsyną. Do szacowania szybkości wzrostu swoistego na podstawie danych o jednostkach zakaźnych dostępne są niektóre modele wzrostu. W niniejszym protokole jako przykład zastosowano zmodyfikowany model Gompertza12; 
<img alt="Równanie wykładniczego zaniku, formuła, metoda analizy, badania naukowe, modelowanie danych." src="/files/ftp_upload/58821/58821eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie">
gdzie N0 (104 pfu/mL w niniejszym badaniu) i Nt (104 do 108 pfu/mL) to miana zakaźne wirusa (pfu/mL) odpowiednio w czasie 0 i t (przykład: 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, A to wartość asymptotyczna [log(N∞/N0)] (przykład: od 3 do 4), µ to specyficzna szybkość wzrostu [1/h], e to stała Neperowa, a λ to okres lag [h]. Parametry modelu są wyznaczane za pomocą funkcji solvera oprogramowania analitycznego, która minimalizuje sumę kwadratów różnic między wartościami obserwowanymi a modelowanymi. W przykładzie na Rysunku 1B, stosując metodę najmniejszych kwadratów do zmodyfikowanego modelu Gompertza, specyficzną szybkość wzrostu (µ) oszacowano na 0,197 [1/h], a okres lag (λ) na 6,61 [h], natomiast stosunek względny miana wirusa w fazie stacjonarnej do miana początkowego (w skali logarytmicznej) (A) wyniósł 3,15 [log (N∞/N0)]. Przebadaliśmy łącznie 6 klonów rotawirusa, a oszacowane wartości specyficznej szybkości wzrostu mieściły się w zakresie od 0,19 do 0,27 [1/h]. Wartości te są wiarygodne, ponieważ współczynniki determinacji w dopasowaniu modelu przekraczały 0,98.
Wiązanie wirionów RRV do powierzchni komórek wynosiło około 103 kopii/mL (wydajność wiązania wynosiła około 1%) przy zastosowaniu płytki 24-dołkowej do testu wiązania komórkowego (Ryc. 2B). Test ten jest zazwyczaj przeprowadzany trzykrotnie dla każdej próbki; jeśli w próbce zaobserwowano dużą wariancję liczby kopii, mogą wystąpić problemy takie jak nadmierne płukanie lub niewystarczająca aktywacja RRV przez trypsynę. Wartość Ct w qPCR przekraczająca około 36,0 jest niepożądana i uznaje się ją za wartość poniżej granicy wykrywalności w naszych warunkach qPCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Objętość/ 1 reakcja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 x Bufor PrimeScript</td>
			<td>4.0 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT Enzyme Mix I</td>
			<td>1.0 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starter Oligo dT</td>
			<td>1.0 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Losowe 6-mery</td>
			<td>4.0 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dejonizowana woda destylowana</td>
			<td>6.0 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>próbka ssRNA</td>
			<td>4.0 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suma</td>
			<td>20.0 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Skład mieszaniny głównej (master mix) do syntezy cDNA genomu rotawirusa.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Temperatura [°C]</td>
			<td>Czas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>42</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>85</td>
			<td>5 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>∞</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Warunki reakcji dla syntezy cDNA genomu rotawirusa.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Objętość/1 reakcja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premix Taq</td>
			<td>12.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Startery bezpośrednie (10 µM)</td>
			<td>0.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>starter odwrotny (10 µM)</td>
			<td>0.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonda (10 µM)</td>
			<td>0.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barwnik referencyjny II</td>
			<td>0.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dejonizowana woda destylowana</td>
			<td>5.5 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>próbka cDNA</td>
			<td>5.0 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>łącznie</td>
			<td>25 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Skład master mixu do ilościowego PCR genomu rotawirusa A.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Temperatura [°C]</td>
			<td>Czas</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>94</td>
			<td>20 s</td>
			<td rowspan="2">45 cykli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60</td>
			<td>1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>72</td>
			<td>5 min</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Warunki reakcji dla ilościowego PCR genomu rotawirusa A.
<img alt="Eksperyment namnażania rotawirusów z testem plackowym i wykresem krzywej wzrostu; analiza swoistej szybkości wzrostu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczna analiza szacowania wzrostu rotawirusów oraz krzywa wzrostu rotawirusów. (A) Jednostkę zakaźną rotawirusa mierzy się za pomocą testu plackowego. (B) Krzywą (niebieska linia) przybliżono za pomocą zmodyfikowanego modelu Gompertza na podstawie danych zaobserwowanych w naszym laboratorium (białe kółka). Swoista szybkość wzrostu [µ]; 0.197 [h-1], okres lag (λ); 6.61 [h], względny miano wirusa w fazie stacjonarnej w stosunku do miana początkowego (skala logarytmiczna) (A); 3.15 [log (N∞/N0)]. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat inokulacji rotawirusa w komórkach MA104; ekstrakcja RNA, metoda RT-qPCR; wykres wydajności wiązania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schematyczny przegląd i reprezentatywny wynik testu wiązania komórkowego pięciu szczepów RRV oczyszczonych z placków w naszym laboratorium. (A) Płytka do hodowli komórkowej zinokulowana rotawirusem jest inkubowana w temperaturze 4 °C w celu zahamowania inwazji wirusa do komórek. Po inkubacji i usunięciu cząsteczek wirusowych niewiązanych z komórkami, za pomocą RT-qPCR określa się liczbę genomów pochodzących z cząsteczek wirusowych związanych z powierzchnią komórki. (B) Wynik testu wiązania komórkowego przedstawiono jako wydajność wiązania (%), która stanowi stosunek związanych cząsteczek wirusowych do tych obecnych w inokulum. Pogrubiony słupek: mediana, końce pól: odchylenie kwartylowe, końce linii: maksimum i minimum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj prezentujemy dwa protokoły, jeden do pomiaru specyficznego tempa wzrostu, a drugi do zdolności wiązania komórek rotawirusa za pomocą testu płytki nazębnej i RT-qPCR. Protokoły te są dostępne w celu potwierdzenia różnic w fenotypach między szczepami rotawirusa.

Testy specyficznej szybkości wzrostu i zdolności wiązania komórkowego rotawirusa

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

Za pomocą przedstawionych tutaj testów można ocenić różnicę w fenotypie między szczepami rotawirusa, w których izolowane są unikalne szczepy. W szczególności badana jest zmiana fenotypowa szczepów rotawirusa opornych na środki dezynfekcyjne. Aby uzyskać wyraźne wyniki ilościowe za pomocą testu płytki nazębnej, konieczne jest wybranie odpowiedniej kombinacji szczepu rotawirusa i surowicy, w której rotawirus jest dobrze przystosowany do surowicy.Procedurę zademonstruje Syun-suke Kadoya, doktorant z mojego laboratorium. Wyjmij rurkę CryoTube zawierającą linie komórkowe MA104 z pojemnika z ciekłym azotem. Umieść rurkę CryoTube w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby rozmrozić komórki.Dodać jeden mililitr zawiesiny komórkowej do 20 mililitrów pożywki zawierającej surowicę w kolbie T75. Inkubować kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez dwa do trzech dni. Gdy monowarstwa komórek osiągnie 80% konfluencji, usuń supernatant i umyj komórki dwukrotnie pięcioma mililitrami 1X Dulbecco's PBS.Dodać cztery mililitry 0,05% trypsyny-EDTA do kolby i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby odłączyć komórki od kolby. Przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki i odwiruj przy 190 g przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w jednym mililitrze pożywki zawierającej surowicę.Następnie rozcieńczyć zawieszone komórki 100-krotnie pożywką. Dodać trzy mililitry rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do każdego dołka sześciodołkowej płytki do testu płytki płytki. Dodać jeden mililitr rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do każdego dołka 24-dołkowej płytki w celu przeprowadzenia testu wiązania komórek.Inkubuj płytki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% nienasyconej pary CO2 przez dwa lub trzy dni. Przenieść probówkę zawierającą jeden mililitr zawiesiny wirusa w podłożu bez surowicy z miejsca przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu rozmrożenia. Dodaj jeden mikrogram na mikrolitr trypsyny z trzustki świni do jednego mililitra zawiesiny wirusa, a następnie wiruj.Zawiesinę wirusa inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% nienasyconej pary CO2 przez 30 minut. Rozcieńczyć zawiesinę aktywowanego wirusa pożywką bez surowicy, aby dostosować liczbę infekcji lub MOI do 0,1 pfu na komórkę. Dodać jeden mililitr rozcieńczonej zawiesiny wirusa do komórek MA104 w kolbie T75 trzy dni po posianiu komórek.Inkubować komórki z wirusem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, delikatnie potrząsając kolbą co 15 minut. Następnie dodać do kolby 30 mililitrów pożywki bez surowicy zawierającej cztery mikrogramy na mililitr trypsyny z trzustki świni. Inkubować kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% nienasyconej pary CO2.Zebrać jeden mililitr supernatantu w kolbie po zerze, sześciu, sześciu, 18, 24 i 36 godzinach po zakażeniu i zastąpić supernatant w typach 1,5 mililitra za pomocą pipety. Przeprowadź cykl zamrażania i rozmrażania w ciągu 15 minut w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, a następnie 15-minutowego topnienia w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie odwirować probówki o masie 12 600 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Zebrać supernatant. Przefiltrować supernatant za pomocą destylowanego filtra 0,2 mikrona, aby usunąć frakcję komórkową. Przechowywać supernatant w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu nałożenia go na test płytki w celu zmierzenia miana wirusa.Gdy będziesz gotowy do wykonania testu płytki nazębnej, umieść probówki zawierające zebrany supernatant w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj trypsynę do jednego mililitra 10-krotnie rozcieńczonej próbki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Podczas tej 30-minutowej inkubacji ostrożnie umyj komórki MA104 na sześciodołkowej płytce z dwoma mililitrami 1X PBS po usunięciu pożywki zawierającej surowicę.Inkubowane próbki należy seryjnie rozcieńczyć pożywką bez surowicy i zaszczepić jeden mililitr rozcieńczonej próbki do każdej studzienki. Inkubuj płytkę przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% nienasyconej pary CO2, delikatnie potrząsając płytką co 15 minut. Po inkubacji usunąć inokulum z płytki sześciodołkowej.Do przygotowanego podłoża dodać cztery mikrogramy na mililitr trypsyny. Delikatnie, ale natychmiast dodaj trzy mililitry pożywki zmieszanej z żelem agarozowym do każdej studzienki. Pozostaw żel agarozowy do zestalenia się w temperaturze pokojowej przez ponad 10 minut.Następnie inkubuj płytkę przez dwa dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% nienasyconej pary CO2. Następnie dodaj jeden mililitr 0,015% neutralnego czerwonego roztworu rozcieńczonego 1X PBS do każdej studzienki i inkubuj w tych samych warunkach. Usuń barwnik po trzech godzinach i kontynuuj inkubację przez jeden dzień.Następnego dnia policz liczbę blaszek w każdej studzience i oblicz pfu na mililitr. Dokładnie sprawdź zbieg komórek przed testem płytki, aby upewnić się, że liczba płytek jest znana. W teście wiązania komórek dodaj jeden mikrogram na mikrolitr trypsyny z trzustki świni do jednego mililitra zawiesiny wirusa, a następnie wiruj.Rozcieńczyć zawiesinę wirusa pożywką bez surowicy, aby dostosować MOI do jednego pfu na komórkę. Umyj komórki MA104 dwukrotnie w 24-dołkowej płytce z jednym mililitrem soli fizjologicznej buforowanej tris. Teraz zaszczepij komórki 100 mikrolitrami rozcieńczonej zawiesiny wirusa do każdego dołka 24-dołkowej płytki.Inkubować płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 90 minut, delikatnie wstrząsając co 15 minut. Usunąć inokulum wirusa i przemyć komórki dwukrotnie jednym mililitrem soli fizjologicznej buforowanej tris. Aby wyekstrahować dwuniciowy RNA rotawirusa, dodaj 140 mikrolitrów 1X PBS i 560 mikrolitrów buforu do ekstrakcji RNA do każdej studzienki.Odpowiednio wymieszać pipetą, aż do momentu, gdy nie będzie widać zamglenia komórek w buforze. Po odzyskaniu dwuniciowego RNA, zgodnie z protokołem producenta, umieść 1,5-mililitrowe probówki, zawierające dwuniciowy ekstrakt RNA, na bloku grzewczym w temperaturze 95 stopni Celsjusza na pięć minut, aby zdenaturować RNA. Następnie natychmiast umieść probówki na lodzie i inkubuj przez ponad dwie minuty.Zsyntetyzuj cDNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji. Dodać cztery mikrolitry roztworu zdenaturowanego wirusowego RNA do probówki PCR zawierającej 16 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej i dokładnie wymieszać pipetą, aby nie tworzyć pęcherzyków. Po odwirowaniu probówek wykonaj odwrotną transkrypcję za pomocą termocyklera.W przypadku ilościowego PCR należy użyć sondy wprowadzającej wygaszacz ukierunkowanej na region 963 do 1,049 segmentu genomu NSP3 rotawirusa. Seryjnie rozcieńczyć standardowy plazmid wodą klasy PCR i przystąpić do przygotowania mieszanki wzorcowej do ilościowego PCR. Dodaj 20 mikrolitrów mieszanki wzorcowej do dołków 96-dołkowej płytki PCR.Następnie wymieszaj pięć mikrolitrów próbek cDNA lub pięć mikrolitrów standardowego plazmidu, pipetując 10 razy. Wykonaj ilościowy PCR zgodnie z warunkami w protokole tekstowym. Na koniec oblicz genom rotawirusa związany z powierzchnią komórki MA104 zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Pokazana tutaj jest krzywa wzrostu rotawirusa. Stosując metodę najmniejszych kwadratów do zmodyfikowanego modelu Gompertza, szacuje się, że właściwa szybkość wzrostu wynosi 0,197, a okres opóźnienia wynosi 6,61 godziny. Względne miano wirusa w fazie stacjonarnej w stosunku do miana początkowego wynosi 3,15.Spośród sześciu badanych klonów rotawirusa szacunkowe wartości specyficznego tempa wzrostu wahały się od 0,19 do 0,27. Te szacowane wartości są wiarygodne, ponieważ współczynnik wartości determinacji w dopasowaniu modelu jest większy niż 0,98. Wynik testu wiązania komórek jest wyświetlany jako wydajność wiązania, która jest stosunkiem związanych cząstek wirusa do tych obecnych w inokulum.Nasze wiriony RV wiążące się z powierzchniami komórek wynoszą około 10 000 kopii na mililitr przy wydajności wiązania około 1% przy użyciu 24-dołkowej płytki do testu wiązania komórek. Ponieważ hodowane komórki są wrażliwe na stresy fizyczne, należy uważać, aby delikatnie, ale szybko wlać bufor i agar. Zasadniczo wprowadzono nowy system dla wirusów.Za pomocą tego systemu możemy ocenić rzeczywistą zdolność wiązania komórek i właściwe tempo wzrostu za pomocą instrumentów. Nasz protokół jest korzystny w pomiarze cechy fenotypowej. Sprawdzając różne nowo pojawiające się szczepy, możesz pomóc w ocenie nowych szczepionek przeciwko wirusom.Wirusy są oznaczone jako patogeny BSL-2, więc do przeprowadzenia tej procedury konieczne będzie przygotowanie pomieszczeń eksperymentalnych BSL-2.

assays-for-specific-growth-rate-cell-binding-ability

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

Source: Philip, A. A., et. al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates a plaque assay technique to monitor rotavirus infection in epithelial cells. Trypsin activation enhances viral entry, and staining highlights viable cells, enabling visualization of infection-induced plaques.

Visualizing Trypsin-Activated Rotavirus Infection Using a Plaque Assay

Source: Philip, A. A., et al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the isolation of rotavirus double-stranded RNA from clarified cell lysates. It further illustrates the separation and visualization of genome segments through polyacrylamide gel electrophoresis.

Isolation and Visualization of Rotavirus Genome via Gel Electrophoresis

Source: Kadoya, S., Sano, D. Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the use of a plaque assay to assess the rotavirus growth curve. The method involves infecting host cells with diluted virus, overlaying with agarose to restrict spread, and staining to visualize plaques formed by viral replication. By counting plaque-forming units at defined time points, the resulting growth curve reveals the lag, exponential, and...

Assessing Rotavirus Growth Curve by Plaque Assay

Ten film przedstawia test do pomiaru przeciwciał neutralizujących przeciwko syncytialnemu wirusowi oddechowemu (RSV). Wstępna inkubacja z surowicą zawierającą przeciwciała neutralizujące RSV neutralizuje cząsteczki wirusa, zmniejszając infekcję komórkową i tworzenie się blaszek miażdżycowych. Komórki zakażone wirusem są następnie poddawane utrwalaniu, blokowaniu i znakowaniu przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem w celu wizualizacji płytki nazębnej. Proces ten umożliwia identyfikację...

Test do pomiaru miana przeciwciał neutralizujących specyficznego dla syncytialnego wirusa oddechowego

Ten film demonstruje test do ilościowego oznaczania ludzkich cząsteczek wirusopodobnych do norowirusa (VLP) wiążących się z ludzkimi bakteriami jelitowymi. Zawiesiny bakteryjne miesza się z VLP i inkubuje, aby umożliwić tworzenie kompleksów VLP-bakterii. Kompleksy są następnie znakowane przeciwciałami specyficznymi dla VLP znakowanymi fluoroforem, a następnie wizualizacją i kwantyfikacją opartą na cytometrii przepływowej w celu zidentyfikowania procentu bakterii związanych z VLP.

Test do ilościowego określenia wiązania ludzkich norowirusów VLP z bakteriami jelitowymi

Pierwszym krokiem w cyklu życia arenawirusa jest dołączenie cząsteczek wirusa do komórek gospodarza. Przedstawiamy ilościowy test oparty na (q)RT-PCR do ultraczułego wykrywania i ilościowego oznaczania zdarzeń związanych z przyłączeniem arenawirusa.

Bardzo czuły test do pomiaru przyłączenia komórki arenawirusa

To badanie opisuje wysokoprzepustowy, oparty na obrazowaniu test mikroneutralizacji w celu określenia miana przeciwciał neutralizujących specyficznych dla syncytialnego wirusa oddechowego (RSV). Ten format testu został przetestowany na różnych typach próbek.

Ulepszony i wysokoprzepustowy test mikroneutralizacji syncytialnego wirusa oddechowego (RSV)

Opisujemy metodę generowania i amplifikacji genetycznie modyfikowanych syncytialnych wirusów oddechowych (RSV) oraz zoptymalizowany test płytki nazębnej dla RSV. Ilustrujemy ten protokół, tworząc dwa rekombinowane wirusy, które odpowiednio umożliwiają ilościowe określenie replikacji RSV i analizę na żywo ciał inkluzyjnych RSV i dynamiki granulek związanych z ciałami inkluzyjnymi.

Wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych

Generowanie rekombinowanych rotawirusów z plazmidowego DNA dostarcza niezbędnego narzędzia do badania replikacji i patogenezy rotawirusów oraz rozwoju wektorów ekspresyjnych rotawirusów i szczepionek. W niniejszym artykule opisano uproszczone podejście genetyki odwrotnej do generowania rekombinowanych rotawirusów, w tym szczepów eksprymujących fluorescencyjne białka reporterowe.

Uproszczona metoda genetyki odwrotnej do odzyskiwania rekombinowanych rotawirusów wykazujących ekspresję białek reporterowych

Poznaj metody pomiaru specyficznej szybkości wzrostu i zdolności wiązania komórkowego rotawirusa przy użyciu testu plakowego i RT-qPCR. Protokoły te umożliwiają ocenę różnic fenotypowych między szczepami wirusa.

Testy specyficznej szybkości wzrostu i zdolności wiązania komórkowego rotawirusa

Przeglądaj więcej filmów