Testy specyficznej szybkości wzrostu i zdolności wiązania komórkowego rotawirusa
28 stycznia 2019
Tutaj prezentujemy dwa protokoły, jeden do pomiaru specyficznego tempa wzrostu, a drugi do zdolności wiązania komórek rotawirusa za pomocą testu płytki nazębnej i RT-qPCR. Protokoły te są dostępne w celu potwierdzenia różnic w fenotypach między szczepami rotawirusa.
Za pomocą przedstawionych tutaj testów można ocenić różnicę w fenotypie między szczepami rotawirusa, w których izolowane są unikalne szczepy. W szczególności badana jest zmiana fenotypowa szczepów rotawirusa opornych na środki dezynfekcyjne. Aby uzyskać wyraźne wyniki ilościowe za pomocą testu płytki nazębnej, konieczne jest wybranie odpowiedniej kombinacji szczepu rotawirusa i surowicy, w której rotawirus jest dobrze przystosowany do surowicy.
Procedurę zademonstruje Syun-suke Kadoya, doktorant z mojego laboratorium. Wyjmij rurkę CryoTube zawierającą linie komórkowe MA104 z pojemnika z ciekłym azotem. Umieść rurkę CryoTube w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby rozmrozić komórki.
Dodać jeden mililitr zawiesiny komórkowej do 20 mililitrów pożywki zawierającej surowicę w kolbie T75. Inkubować kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez dwa do trzech dni. Gdy monowarstwa komórek osiągnie 80% konfluencji, usuń supernatant i umyj komórki dwukrotnie pięcioma mililitrami 1X Dulbecco's PBS.
Dodać cztery mililitry 0,05% trypsyny-EDTA do kolby i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby odłączyć komórki od kolby. Przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki i odwiruj przy 190 g przez pięć minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w jednym mililitrze pożywki zawierającej surowicę.
Następnie rozcieńczyć zawieszone komórki 100-krotnie pożywką. Dodać trzy mililitry rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do każdego dołka sześciodołkowej płytki do testu płytki płytki. Dodać jeden mililitr rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do każdego dołka 24-dołkowej płytki w celu przeprowadzenia testu wiązania komórek.
Inkubuj płytki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% nienasyconej pary CO2 przez dwa lub trzy dni. Przenieść probówkę zawierającą jeden mililitr zawiesiny wirusa w podłożu bez surowicy z miejsca przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu rozmrożenia. Dodaj jeden mikrogram na mikrolitr trypsyny z trzustki świni do jednego mililitra zawiesiny wirusa, a następnie wiruj.
Zawiesinę wirusa inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% nienasyconej pary CO2 przez 30 minut. Rozcieńczyć zawiesinę aktywowanego wirusa pożywką bez surowicy, aby dostosować liczbę infekcji lub MOI do 0,1 pfu na komórkę. Dodać jeden mililitr rozcieńczonej zawiesiny wirusa do komórek MA104 w kolbie T75 trzy dni po posianiu komórek.
Inkubować komórki z wirusem w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, delikatnie potrząsając kolbą co 15 minut. Następnie dodać do kolby 30 mililitrów pożywki bez surowicy zawierającej cztery mikrogramy na mililitr trypsyny z trzustki świni. Inkubować kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% nienasyconej pary CO2.
Zebrać jeden mililitr supernatantu w kolbie po zerze, sześciu, sześciu, 18, 24 i 36 godzinach po zakażeniu i zastąpić supernatant w typach 1,5 mililitra za pomocą pipety. Przeprowadź cykl zamrażania i rozmrażania w ciągu 15 minut w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, a następnie 15-minutowego topnienia w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie odwirować probówki o masie 12 600 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Zebrać supernatant. Przefiltrować supernatant za pomocą destylowanego filtra 0,2 mikrona, aby usunąć frakcję komórkową. Przechowywać supernatant w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu nałożenia go na test płytki w celu zmierzenia miana wirusa.
Gdy będziesz gotowy do wykonania testu płytki nazębnej, umieść probówki zawierające zebrany supernatant w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj trypsynę do jednego mililitra 10-krotnie rozcieńczonej próbki i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Podczas tej 30-minutowej inkubacji ostrożnie umyj komórki MA104 na sześciodołkowej płytce z dwoma mililitrami 1X PBS po usunięciu pożywki zawierającej surowicę.
Inkubowane próbki należy seryjnie rozcieńczyć pożywką bez surowicy i zaszczepić jeden mililitr rozcieńczonej próbki do każdej studzienki. Inkubuj płytkę przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% nienasyconej pary CO2, delikatnie potrząsając płytką co 15 minut. Po inkubacji usunąć inokulum z płytki sześciodołkowej.
Do przygotowanego podłoża dodać cztery mikrogramy na mililitr trypsyny. Delikatnie, ale natychmiast dodaj trzy mililitry pożywki zmieszanej z żelem agarozowym do każdej studzienki. Pozostaw żel agarozowy do zestalenia się w temperaturze pokojowej przez ponad 10 minut.
Następnie inkubuj płytkę przez dwa dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% nienasyconej pary CO2. Następnie dodaj jeden mililitr 0,015% neutralnego czerwonego roztworu rozcieńczonego 1X PBS do każdej studzienki i inkubuj w tych samych warunkach. Usuń barwnik po trzech godzinach i kontynuuj inkubację przez jeden dzień.
Następnego dnia policz liczbę blaszek w każdej studzience i oblicz pfu na mililitr. Dokładnie sprawdź zbieg komórek przed testem płytki, aby upewnić się, że liczba płytek jest znana. W teście wiązania komórek dodaj jeden mikrogram na mikrolitr trypsyny z trzustki świni do jednego mililitra zawiesiny wirusa, a następnie wiruj.
Rozcieńczyć zawiesinę wirusa pożywką bez surowicy, aby dostosować MOI do jednego pfu na komórkę. Umyj komórki MA104 dwukrotnie w 24-dołkowej płytce z jednym mililitrem soli fizjologicznej buforowanej tris. Teraz zaszczepij komórki 100 mikrolitrami rozcieńczonej zawiesiny wirusa do każdego dołka 24-dołkowej płytki.
Inkubować płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 90 minut, delikatnie wstrząsając co 15 minut. Usunąć inokulum wirusa i przemyć komórki dwukrotnie jednym mililitrem soli fizjologicznej buforowanej tris. Aby wyekstrahować dwuniciowy RNA rotawirusa, dodaj 140 mikrolitrów 1X PBS i 560 mikrolitrów buforu do ekstrakcji RNA do każdej studzienki.
Odpowiednio wymieszać pipetą, aż do momentu, gdy nie będzie widać zamglenia komórek w buforze. Po odzyskaniu dwuniciowego RNA, zgodnie z protokołem producenta, umieść 1,5-mililitrowe probówki, zawierające dwuniciowy ekstrakt RNA, na bloku grzewczym w temperaturze 95 stopni Celsjusza na pięć minut, aby zdenaturować RNA. Następnie natychmiast umieść probówki na lodzie i inkubuj przez ponad dwie minuty.
Zsyntetyzuj cDNA za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji. Dodać cztery mikrolitry roztworu zdenaturowanego wirusowego RNA do probówki PCR zawierającej 16 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej i dokładnie wymieszać pipetą, aby nie tworzyć pęcherzyków. Po odwirowaniu probówek wykonaj odwrotną transkrypcję za pomocą termocyklera.
W przypadku ilościowego PCR należy użyć sondy wprowadzającej wygaszacz ukierunkowanej na region 963 do 1,049 segmentu genomu NSP3 rotawirusa. Seryjnie rozcieńczyć standardowy plazmid wodą klasy PCR i przystąpić do przygotowania mieszanki wzorcowej do ilościowego PCR. Dodaj 20 mikrolitrów mieszanki wzorcowej do dołków 96-dołkowej płytki PCR.
Następnie wymieszaj pięć mikrolitrów próbek cDNA lub pięć mikrolitrów standardowego plazmidu, pipetując 10 razy. Wykonaj ilościowy PCR zgodnie z warunkami w protokole tekstowym. Na koniec oblicz genom rotawirusa związany z powierzchnią komórki MA104 zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Pokazana tutaj jest krzywa wzrostu rotawirusa. Stosując metodę najmniejszych kwadratów do zmodyfikowanego modelu Gompertza, szacuje się, że właściwa szybkość wzrostu wynosi 0,197, a okres opóźnienia wynosi 6,61 godziny. Względne miano wirusa w fazie stacjonarnej w stosunku do miana początkowego wynosi 3,15.
Spośród sześciu badanych klonów rotawirusa szacunkowe wartości specyficznego tempa wzrostu wahały się od 0,19 do 0,27. Te szacowane wartości są wiarygodne, ponieważ współczynnik wartości determinacji w dopasowaniu modelu jest większy niż 0,98. Wynik testu wiązania komórek jest wyświetlany jako wydajność wiązania, która jest stosunkiem związanych cząstek wirusa do tych obecnych w inokulum.
Nasze wiriony RV wiążące się z powierzchniami komórek wynoszą około 10 000 kopii na mililitr przy wydajności wiązania około 1% przy użyciu 24-dołkowej płytki do testu wiązania komórek. Ponieważ hodowane komórki są wrażliwe na stresy fizyczne, należy uważać, aby delikatnie, ale szybko wlać bufor i agar. Zasadniczo wprowadzono nowy system dla wirusów.
Za pomocą tego systemu możemy ocenić rzeczywistą zdolność wiązania komórek i właściwe tempo wzrostu za pomocą instrumentów. Nasz protokół jest korzystny w pomiarze cechy fenotypowej. Sprawdzając różne nowo pojawiające się szczepy, możesz pomóc w ocenie nowych szczepionek przeciwko wirusom.
Wirusy są oznaczone jako patogeny BSL-2, więc do przeprowadzenia tej procedury konieczne będzie przygotowanie pomieszczeń eksperymentalnych BSL-2.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokoły pomiaru specyficznej szybkości wzrostu oraz zdolności wiązania komórkowego rotawirusa z wykorzystaniem testów płyśkowych i RT-qPCR. Metody te są niezbędne do oceny różnic fenotypowych pomiędzy szczepami rotawirusa.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wirusologia
- Biologia komórki
- Mikrobiologia
Wstęp
- Rotawirus jest istotnym patogenem atakującym wiele gatunków.
- Zrozumienie różnic między szczepami jest kluczowe dla opracowania szczepionek.
- Charakterystyka fenotypowa pomaga w identyfikacji szczepów opornych.
- Analizy dostarczają ilościowych danych na temat zachowania wirusa.
Cel badania
- Opracowanie protokołów oceny wzrostu i wiązania rotawirusów.
- Różnicowanie szczepów rotawirusów na podstawie cech fenotypowych.
- Badanie szczepów rotawirusów opornych na środki dezynfekcyjne.
Zastosowane metody
- Metoda płytek do pomiaru miana wirusa.
- RT-qPCR do analizy wirusowego RNA.
- Techniki hodowli komórkowych z wykorzystaniem linii komórkowych MA104.
- Procedury inokulacji i inkubacji w badaniach wirusologicznych.
Główne wyniki
- Protokoły skutecznie różnicują szczepy rotawirusów.
- Wyniki ilościowe ujawniają tempo wzrostu oraz zdolności wiązania.
- Szczepy odporne na środki dezynfekcyjne wykazują wyraźne zmiany fenotypowe.
- Analizy dostarczają wiarygodnych danych do dalszych badań.
Wnioski
- Opracowane protokoły są skuteczne w badaniach nad rotawirusami.
- Zrozumienie różnic między szczepami może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych metodach w celu ich szerszego zastosowania.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ocena cech fenotypowych, takich jak specyficzna szybkość wzrostu i zdolność wiązania komórek, pozwala zespołom biofarmaceutycznym na minimalizację ryzyka przy walidacji celów przeciwwirusowych poprzez ilościowe określenie zakaźności specyficznej dla szczepu oraz dynamiki interakcji z gospodarzem. Analizy te wspierają wczesny etap odkrywania leków, dostarczając powtarzalnych, ilościowych wyników, które stanowią podstawę do identyfikacji wiodących związków oraz zwiększają pewność prognostyczną w ocenie kandydatów na leki przeciwwirusowe. Metodologia ta znajduje bezpośrednie zastosowanie w ocenie nowo pojawiających się szczepów rotawirusów w programach przesiewowych szczepionek lub terapii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pomiar kinetyki wzrostu specyficznej dla szczepu oraz wiązania receptorów w celu weryfikacji hipotez terapeutycznych i wyjaśnienia mechanizmów patogenezy wirusowej.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie zestandaryzowanych wyników testu plackowego oraz RT-qPCR w celu funkcjonalnej walidacji celów i biologicznej oceny ryzyka kandydatów na leki przeciwwirusowe.
- Wartość prognostyczna: Umożliwienie porównania fenotypowego szczepów opornych na środki dezynfekcyjne w celu wsparcia selekcji projektów z portfolio i wyboru wiodących związków w oparciu o mechanizm działania.
Przesiewy i opracowanie testów
- Gotowość testu: Generuje ilościowe dane dotyczące miana wirusa (pfu/mL) oraz wydajności wiązania, odpowiednie do wysokoprzepustowego przesiewu bibliotek związków przeciwko szczepom rotawirusa.
- Powtarzalność: Wykorzystuje hodowlę komórek MA104 oraz kontrolowaną aktywację trypsyną, aby zapewnić spójne warunki aktywacji i infekcji wirusowej w obrębie poszczególnych eksperymentów.
- Skalowalność: Protokół obsługuje formaty wielodołkowe (płytki 6-dołkowe dla testu plackowego, 24-dołkowe dla wiązania), co umożliwia równoległe porównywanie szczepów i ponowne wykorzystanie testu w procesach odkrywania leków przeciwwirusowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla jednostek chorobowych: Bezpośrednio mierzy cechy fenotypowe rotawirusa, głównego czynnika etiologicznego biegunki niemowląt, co wspiera dopasowanie biomarkerów translacyjnych w modelach przedklinicznych.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy wczesny screening fenotypowy z późniejszą oceną skuteczności, dostarczając mierzalnych parametrów wzrostu i wiązania w celu wyboru szczepu.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia podejmowanie decyzji typu go/no-go w oparciu o dane dotyczące specyficznych dla szczepu profili fenotypowych, co zmniejsza ryzyko biologiczne w opracowywaniu leków przeciwwirusowych.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Analiza ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, dostarczając ilościowych danych fenotypowych, które stanowią pomost między etapem walidacji celu a identyfikacją związków wiodących, w szczególności w programach przeciwwirusowych ukierunkowanych na wnikanie lub replikację wirusa.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących różnic między szczepami wirusa poprzez precyzyjny pomiar tempa wzrostu i zdolności wiązania do komórek jako fenotypów funkcjonalnych.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowane, ilościowe wyniki (pfu/mL w teście plackowym, liczba związanych kopii wirusa w RT-qPCR), które są niezbędne do rzetelnej oceny związków w badaniach przesiewowych leków przeciwwirusowych.
- Analityka: Wykorzystuje dopasowanie zmodyfikowanego modelu Gompertza oraz obliczenia wydajności wiązania w celu wygenerowania porównywalnych, statystycznie istotnych wskaźników do analizy porównawczej różnych szczepów.
- Badania translacyjne: Łączy przesiewanie fenotypowe z istotnością przedkliniczną poprzez charakteryzację szczepów mogących mieć wpływ na skuteczność szczepionek lub terapii.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny dryfu fenotypowego w kwazigatunkach rotawirusów, wspierając długoterminowy nadzór nad szczepami w procesie opracowywania leków przeciwwirusowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki ilościowej charakterystyce fenotypowej szczepów rotawirusów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność analizy poprzez zdefiniowane etapy hodowli komórkowej, aktywacji trypsyną i kwantyfikacji, umożliwiając spójność między laboratoriami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go dotyczących leków przeciwwirusowych poprzez dostarczenie danych o wzroście i wiązaniu specyficznych dla szczepów, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia biologicznego na późnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów na leki przeciwwirusowe z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o profilowanie fenotypowe pojawiających się lub opornych szczepów rotawirusów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu wirusologii, hodowli komórkowych oraz technik ilościowania molekularnego, w tym testu plackowego i RT-qPCR.
- Konieczny jest dostęp do zaplecza i aparatury poziomu biosafety level 2 (BSL-2) do pracy z wirusami, wirowania, detekcji fluorescencji oraz cyklowania termicznego.
- Niezbędna jest standaryzacja protokołów aktywacji trypsyną oraz optymalizacja MOI dla poszczególnych szczepów w celu zapewnienia porównywalnych warunków infekcji.
- W przypadku rozszerzenia analiz na inne linie komórkowe lub kultury pierwotne poza MA104 należy uwzględnić kwestie adaptacyjne.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wrażliwość na stres mechaniczny podczas przenoszenia naddatku oraz konieczność ścisłej kontroli temperatury podczas etapów adsorpcji wirusa i inkubacji.
