Tania analiza chodu do fenotypowania behawioralnego mysich modeli choroby nerwowo-mięśniowej
18 lipca 2019
Analiza śladów to tania alternatywa dla cyfrowych programów do analizy chodu dla badaczy kwantyfikujących nieprawidłowości ruchowe u myszy. Ze względu na swoją szybkość, prostotę i potencjał podłużny idealnie nadaje się do fenotypowania behawioralnego modeli mysich.
Analiza śladów stóp jest tanią alternatywą dla digitalizacji programów do analizy chodu dla badaczy kwantyfikujących nieprawidłowości ruchowe u myszy. Ze względu na swoją szybkość, prostotę i potencjał podłużny, metoda ta jest idealna do fenotypowania behawioralnego modeli mysich, w tym modeli chorób neurodegeneracyjnych, chorób nerwowo-mięśniowych lub udaru. Procedurę zademonstruje Virginia Wertman, technik badawczy z mojego laboratorium.
Przed rozpoczęciem eksperymentu należy zaaklimatyzować myszy, które były w pełni przytomne i czujne przez co najmniej pięć minut, do pomieszczenia testowego na 30 minut. Umieść tunel na pasku papieru, który jest nieco szerszy i dłuższy niż długość i szerokość tunelu. Zaznacz papier identyfikatorem myszy i datą testu.
W razie potrzeby dodaj nasiona słonecznika do komory celu, aby uzyskać motywację i mocno zakarp pierwszą mysz, która ma być przetestowana. Używając stożkowych końcówek pędzla o średnicy około 0,5 centymetra, pomaluj cały spód wszystkich palców u nóg i środek każdej przedniej łapy jednym nietoksycznym, zmywalnym kolorem farby na bazie wody. W podobny sposób pokryj tylne łapy kontrastową, nietoksyczną, zmywalną farbą na bazie wody.
Użyj czystego damp płótno, aby usunąć farbę, którą mysz dostanie się na inne części ciała, aby zapobiec smugom, które mogą przeszkadzać w zbieraniu danych. Następnie umieść mysz na początku tunelu. Pozwól myszy przejść przez całą drogę do komory bramki przed odzyskaniem zwierzęcia, aby delikatnie wyczyścić jego stopy zwilżoną wodą szmatką.
Następnie umieść mysz z powrotem w klatce domowej i wytrzyj obszar testowy i tunel środkiem dezynfekującym przed przetestowaniem następnego zwierzęcia. Aby uzyskać dokładne nachylenie, poczekaj, aż ślady stóp całkowicie wyschną, zanim wybierzesz kroki, które są konsekwentnie rozmieszczone z wyraźnymi, nierozmazanymi śladami. Aby wygenerować wystarczające dane dotyczące oceniania, muszą istnieć co najmniej dwa kolejne kroki z każdej stopy.
Nie dołączaj pierwszego i ostatniego odcisku stopy na papierze, ponieważ jest mało prawdopodobne, aby reprezentowały one normalny chód, ponieważ mysz zmieniała prędkość chodzenia. Aby zdefiniować długość kroku jako odległość między dwoma sekwencyjnymi śladami stóp utworzonymi przez tę samą stopę, użyj ołówka, aby narysować okrąg o długości od dwóch do czterech milimetrów wokół obszaru przedniej części stopy obu śladów kończyn przednich w jednym kroku i użyj linijki, aby narysować linię między okręgami. Zapisz odległość między dwoma odciskami od środka każdego okręgu, odpowiednio w prawo przed jednym lub w lewo przed i powtórz pomiar dla każdego z kroków, które można uzyskać.
Następnie uśrednij wszystkie indywidualne zarejestrowane odległości kroku dla każdej kończyny, uśredniając indywidualne wyniki w kohorcie, zgodnie z eksperymentalnie odpowiednimi potrzebami. Aby zdefiniować szerokość kroku jako odległość między lewą i prawą kończyną przednią lub kończyną tylną, narysuj i zmierz linię od zakreślonego obszaru przedniej części stopy jednej kończyny tylnej, która przecina się prostopadle z linią długości kroku na przeciwległej kończynie tylnej. Powtórz ten pomiar dla wszystkich odcisków kończyn tylnych, które można ocenić, i uśrednij pomiary.
Aby zdefiniować rozpiętość palców jako odległość między pierwszym a ostatnim palcem u nogi na pojedynczym odcisku kończyny przedniej lub tylnej, użyj suwmiarki, aby zmierzyć odległość między czubkiem pierwszego odcisku palca a czubkiem ostatniego odcisku palca. Następnie powtórz pomiar dla wszystkich odcisków kończyn tylnych, które można ocenić, i uśrednij pomiary. Przy wystarczającej liczbie zwierząt procedura ta jest w stanie wykryć różnice w chodzie między genotypami myszy w obrębie tego samego szczepu w czasie.
Na przykład pokazano reprezentatywne ślady obrazów odcisków stóp pobranych za pomocą mysiego modelu rdzeniowego i opuszkowego zaniku mięśni sprzężonego z chromosomem X, choroby neurodegeneracyjnej wpływającej na dolne neurony ruchowe i mięśnie szkieletowe. Analiza chodu przedobjawowych i poobjawowych samców myszy transgenicznych i kontrolnych z miotu ujawnia, że przed wystąpieniem choroby myszy transgeniczne wykazują podobną długość kroku, szerokość kroku i rozstaw palców u nóg w porównaniu z ich nietransgenicznymi kontrolami z miotu. Jednak po wystąpieniu choroby zwierzęta transgeniczne wykazują znacznie krótsze kroki.
Podobna analiza podłużna nie wykazała różnic w szerokości kroku w żadnym z badanych grup. Poobjawowe myszy transgeniczne mają również znacznie węższy rozstaw tylnych palców u nóg niż grupy kontrolne z miotu w tym samym wieku. Najlepsze efekty przyniesie odpowiednie nałożenie farby na łapy.
Pamiętaj, że tylko stopnie, które są konsekwentnie rozmieszczone z wyraźnymi, nierozmazanymi śladami, powinny być oceniane. Ta technika jest wystarczająco czuła, aby wykryć drobne zmiany w kroku. A dzięki nieinwazyjnemu podejściu umożliwia badanie grup w całej długości ich życia, prezentacji fenotypowej i interwencji terapeutycznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Analiza śladów stóp stanowi niedrogą alternatywę dla cyfrowych programów analizy chodu w badaniach nad ilościowym określaniem nieprawidłowości ruchu u myszy. Metoda ta, ze względu na swoją szybkość, prostotę oraz potencjał do badań podłużnych, jest idealna do fenotypowania behawioralnego modeli mysich.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Analiza behawioralna
- Modele mysie
Wstęp
- Analiza śladów stóp stanowi kosztowo efektywną metodę oceny ruchu myszy.
- Jest ona szczególnie przydatna do badania różnych schorzeń neurologicznych.
- Technika ta umożliwia wielokrotne pomiary w czasie.
- Badacze mogą z łatwością wdrożyć tę metodę w swoich badaniach.
Cel badania
- Ilościowe określenie nieprawidłowości ruchowych u myszy.
- Zapewnienie prostej i wydajnej metody fenotypowania behawioralnego.
- Ułatwienie badań nad chorobami neurodegeneracyjnymi i nerwowo-mięśniowymi.
Zastosowane metody
- Aklimatyzacja myszy w pomieszczeniu badawczym przed testem.
- Wykorzystanie tunelu umieszczonego nad paskiem papieru do zbierania odcisków łap.
- Oznaczenie papieru identyfikatorem myszy i datą testu.
- Przeprowadzenie analizy w kontrolowanych warunkach.
Główne wyniki
- Demonstracja procedury analizy śladów stóp.
- Gromadzenie danych na temat wzorców ruchu myszy.
- Identyfikacja nieprawidłowości w ruchu w różnych modelach mysich.
- Potencjalne zastosowania w badaniu chorób neurodegeneracyjnych.
Wnioski
- Analiza śladów jest skutecznym narzędziem dla badaczy.
- Metoda ta wspiera badania podłużne w fenotypowaniu behawioralnym.
- Może ona zwiększyć zrozumienie zaburzeń ruchowych u myszy.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niskokosztowa analiza chodu stanowi dostępną, nieinwazyjną metodę wykrywania wczesnych zmian fenotypowych w modelach mysich chorób nerwowo-mięśniowych, wspierając podłużne fenotypowanie behawioralne w ciągu całego życia zwierząt. Podejście to umożliwia walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez kwantyfikację nieprawidłowości chodu, takich jak długość kroku i rozstaw palców, które korelują z progresją choroby. Jego prostota i powtarzalność ułatwiają interdyscyplinarne zastosowanie w biologii odkrywczej oraz w procesach przesiewowych w badaniach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wykrywanie deficytów chodu w modelach transgenicznych przed i po wystąpieniu objawów.
- Wartość operacyjna: Wspiera biologiczną redukcję ryzyka dzięki mierzalnym metrykom podłużnym, które wyjaśniają funkcjonalne zaangażowanie celu w szlakach neuronów ruchowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe, analogowo-cyfrowe wskaźniki chodu (długość kroku, szerokość kroku, rozstaw palców), które nadają się do standaryzacji i powtarzalności testów.
- Wartość operacyjna: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszej oceny związków poprzez ustanowienie bazowych oraz zmienionych chorobowo fenotypów lokomocji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykazuje użyteczność systemu w kontekście badania chorób poprzez wykrywanie specyficznych dla genotypu różnic w chodu w czasie u mysich modeli zaniku mięśni rdzeniowych i opuszkowych.
- Wartość operacyjna: Wspiera dopasowanie translacyjnych biomarkerów oraz decyzje o postępach skorygowanych o ryzyko dzięki czułym i powtarzalnym odczytom fenotypowym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od wczesnego testowania hipotez, poprzez identyfikację wiodących związków, aż po walidację przedkliniczną, w szczególności w ramach programów badawczych nad chorobami nerwowo-mięśniowymi i neurodegeneracyjnymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez kwantyfikację dysfunkcji motorycznych w modelach chorób.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów dzięki zestandaryzowanym, mierzalnym parametrom śladu, które pozwalają na rzetelną ocenę związków.
- Analityka: Dostarcza mierzalne wyniki (długość kroku, szerokość, rozstaw palców), które pomagają zespołom porównywać warunki i śledzić progresję fenotypową.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z ciągłością przedkliniczną poprzez podłużny monitoring fenotypowy dostosowany do początku i przebiegu choroby.
- Wykorzystanie w organizacji: Funkcjonuje jako wielokrotnego użytku, niskokosztowa metoda w wielu badaniach i systemach modelowych ze względu na minimalne wymagania dotyczące sprzętu i szkolenia.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celu dzięki wczesnemu wykrywaniu skrócenia długości kroku i zwężenia rozstawu palców w modelach objawowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność dzięki zastosowaniu prostych materiałów (nietoksyczna farba, papier, tunel) oraz minimalnej złożoności procedury.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go oraz zmniejszone ryzyko biologiczne na późnych etapach dzięki wczesnej identyfikacji skuteczności fenotypowej w procesie odkrywania leków.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko w oparciu o podłużne zmiany chodu odzwierciedlające efekty interwencji terapeutycznej w całym cyklu życia.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga podstawowej wiedzy naukowej w zakresie obsługi zwierząt i konfiguracji testów behawioralnych.
- Wymaga minimalnego instrumentarium: nietoksycznej zmywalnej farby, papierowego tunelu, linijki, ołówka oraz suwmiarki do pomiarów.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w kryteriach wyboru odcisków łap (np. wykluczenie pierwszych/ostatnich odcisków, punktowanie tylko kroków o stałym odstępie).
- Wymaga uwzględnienia adaptacji w różnych systemach modelowych, szczególnie w odniesieniu do rozmiaru łap i dynamiki chodu w różnych szczepach.
- Ograniczone przez wydajność pomiarów ręcznych oraz ryzyko rozmazania, jeśli nakładanie farby na łapy lub jej usuwanie będą niespójne.
