Tania analiza chodu do fenotypowania behawioralnego mysich modeli choroby nerwowo-mięśniowej

Analiza śladów to tania alternatywa dla cyfrowych programów do analizy chodu dla badaczy kwantyfikujących nieprawidłowości ruchowe u myszy. Ze względu na swoją szybkość, prostotę i potencjał podłużny idealnie nadaje się do fenotypowania behawioralnego modeli mysich.

Analiza śladów stóp jest tanią alternatywą dla digitalizacji programów do analizy chodu dla badaczy kwantyfikujących nieprawidłowości ruchowe u myszy. Ze względu na swoją szybkość, prostotę i potencjał podłużny, metoda ta jest idealna do fenotypowania behawioralnego modeli mysich, w tym modeli chorób neurodegeneracyjnych, chorób nerwowo-mięśniowych lub udaru. Procedurę zademonstruje Virginia Wertman, technik badawczy z mojego laboratorium.

Przed rozpoczęciem eksperymentu należy zaaklimatyzować myszy, które były w pełni przytomne i czujne przez co najmniej pięć minut, do pomieszczenia testowego na 30 minut. Umieść tunel na pasku papieru, który jest nieco szerszy i dłuższy niż długość i szerokość tunelu. Zaznacz papier identyfikatorem myszy i datą testu.

W razie potrzeby dodaj nasiona słonecznika do komory celu, aby uzyskać motywację i mocno zakarp pierwszą mysz, która ma być przetestowana. Używając stożkowych końcówek pędzla o średnicy około 0,5 centymetra, pomaluj cały spód wszystkich palców u nóg i środek każdej przedniej łapy jednym nietoksycznym, zmywalnym kolorem farby na bazie wody. W podobny sposób pokryj tylne łapy kontrastową, nietoksyczną, zmywalną farbą na bazie wody.

Użyj czystego damp płótno, aby usunąć farbę, którą mysz dostanie się na inne części ciała, aby zapobiec smugom, które mogą przeszkadzać w zbieraniu danych. Następnie umieść mysz na początku tunelu. Pozwól myszy przejść przez całą drogę do komory bramki przed odzyskaniem zwierzęcia, aby delikatnie wyczyścić jego stopy zwilżoną wodą szmatką.

Następnie umieść mysz z powrotem w klatce domowej i wytrzyj obszar testowy i tunel środkiem dezynfekującym przed przetestowaniem następnego zwierzęcia. Aby uzyskać dokładne nachylenie, poczekaj, aż ślady stóp całkowicie wyschną, zanim wybierzesz kroki, które są konsekwentnie rozmieszczone z wyraźnymi, nierozmazanymi śladami. Aby wygenerować wystarczające dane dotyczące oceniania, muszą istnieć co najmniej dwa kolejne kroki z każdej stopy.

Nie dołączaj pierwszego i ostatniego odcisku stopy na papierze, ponieważ jest mało prawdopodobne, aby reprezentowały one normalny chód, ponieważ mysz zmieniała prędkość chodzenia. Aby zdefiniować długość kroku jako odległość między dwoma sekwencyjnymi śladami stóp utworzonymi przez tę samą stopę, użyj ołówka, aby narysować okrąg o długości od dwóch do czterech milimetrów wokół obszaru przedniej części stopy obu śladów kończyn przednich w jednym kroku i użyj linijki, aby narysować linię między okręgami. Zapisz odległość między dwoma odciskami od środka każdego okręgu, odpowiednio w prawo przed jednym lub w lewo przed i powtórz pomiar dla każdego z kroków, które można uzyskać.

Następnie uśrednij wszystkie indywidualne zarejestrowane odległości kroku dla każdej kończyny, uśredniając indywidualne wyniki w kohorcie, zgodnie z eksperymentalnie odpowiednimi potrzebami. Aby zdefiniować szerokość kroku jako odległość między lewą i prawą kończyną przednią lub kończyną tylną, narysuj i zmierz linię od zakreślonego obszaru przedniej części stopy jednej kończyny tylnej, która przecina się prostopadle z linią długości kroku na przeciwległej kończynie tylnej. Powtórz ten pomiar dla wszystkich odcisków kończyn tylnych, które można ocenić, i uśrednij pomiary.

Aby zdefiniować rozpiętość palców jako odległość między pierwszym a ostatnim palcem u nogi na pojedynczym odcisku kończyny przedniej lub tylnej, użyj suwmiarki, aby zmierzyć odległość między czubkiem pierwszego odcisku palca a czubkiem ostatniego odcisku palca. Następnie powtórz pomiar dla wszystkich odcisków kończyn tylnych, które można ocenić, i uśrednij pomiary. Przy wystarczającej liczbie zwierząt procedura ta jest w stanie wykryć różnice w chodzie między genotypami myszy w obrębie tego samego szczepu w czasie.

Na przykład pokazano reprezentatywne ślady obrazów odcisków stóp pobranych za pomocą mysiego modelu rdzeniowego i opuszkowego zaniku mięśni sprzężonego z chromosomem X, choroby neurodegeneracyjnej wpływającej na dolne neurony ruchowe i mięśnie szkieletowe. Analiza chodu przedobjawowych i poobjawowych samców myszy transgenicznych i kontrolnych z miotu ujawnia, że przed wystąpieniem choroby myszy transgeniczne wykazują podobną długość kroku, szerokość kroku i rozstaw palców u nóg w porównaniu z ich nietransgenicznymi kontrolami z miotu. Jednak po wystąpieniu choroby zwierzęta transgeniczne wykazują znacznie krótsze kroki.

Podobna analiza podłużna nie wykazała różnic w szerokości kroku w żadnym z badanych grup. Poobjawowe myszy transgeniczne mają również znacznie węższy rozstaw tylnych palców u nóg niż grupy kontrolne z miotu w tym samym wieku. Najlepsze efekty przyniesie odpowiednie nałożenie farby na łapy.

Pamiętaj, że tylko stopnie, które są konsekwentnie rozmieszczone z wyraźnymi, nierozmazanymi śladami, powinny być oceniane. Ta technika jest wystarczająco czuła, aby wykryć drobne zmiany w kroku. A dzięki nieinwazyjnemu podejściu umożliwia badanie grup w całej długości ich życia, prezentacji fenotypowej i interwencji terapeutycznych.