Analiza funkcji komórek satelitarnych podczas regeneracji mięśni szkieletowych przez uszkodzenie kardiotoksyny i wstrzyknięcie samodostarczającego siRNA in vivo

Technika ta pozwala na połączenie domięśniowego wstrzyknięcia kardiotoksyny z jadu węża z domięśniowym wstrzyknięciem samodostarczającego siRNA, umożliwiając w ten sposób analizę regeneracji mięśni szkieletowych. Zastosowanie samodostarczającego siRNA jest eleganckim sposobem badania funkcjonalnej utraty pojedynczych genów podczas regeneracji mięśni, unikając w ten sposób zwierząt transgenicznych. Po potwierdzeniu braku reakcji na szczypanie palca, należy ogolić obszar wstrzyknięcia w dolnej części nogi czaszki od kolana do łapy i usunąć luźne włosy.

Umieść mysz w pozycji leżącej na nożowniku pokrytym sterylną szmatką chirurgiczną i użyj 70% etanolu do dezynfekcji obszaru wstrzyknięcia w dolnej części nogi czaszki. Następnie załaduj strzykawkę insulinową wyposażoną w igłę o rozmiarze 29 z 50 mikrolitrami 20 mikromolowej kardiotoksyny i wbij skórę całkowicie w mięsień, tylko dystalnie do kolana. Gdy igła jest na miejscu, wstrzyknąć kardiotoksynę w ciągu 10 do 20 sekund wzdłuż całej długości mięśnia, jednocześnie przesuwając igłę do przodu iz powrotem, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie kardiotoksyny, uszkadzając w ten sposób cały mięsień piszczelowy przedni.

Następnie umieść mysz z powrotem w klatce na poduszce grzewczej z monitorowaniem aż do pełnego położenia. Trzy dni po zabiegu należy zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia, jak pokazano poniżej. Wstrzyknąć do 50 mikrolitrów siRNA skierowanego przeciwko docelowemu genowi zainteresowania do mięśnia piszczelowego przedniego znieczulonej myszy, jak właśnie pokazano.

Następnie umieść mysz z powrotem w klatce, monitorując ją aż do pełnego leżenia. Przed pobraniem uszkodzonej tkanki mięśniowej owiń ołówek folią i uszczelnij ołówek taśmą, tak aby dno formy zapewniało równą, zamkniętą powierzchnię. Gdy pleśń będzie gotowa, zdezynfekuj całe zwierzę 70% etanolem i użyj bardzo ostrych nożyczek, aby usunąć skórę w kostce.

Przed pobraniem mięśnia użyj cienkich kleszczy, aby uszczypnąć zamknięte kleszcze przez powięź obok kości piszczelowej w kostce zranionej nogi i przesuń kleszcze w kierunku kolana, aby rozerwać powięź, odsłaniając mięsień piszczelowy przedni. Aby wyizolować mięsień piszczelowy przedni, odsłoń ścięgno dystalne i chwyć ścięgno cienkimi kleszczami. Użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć ścięgno i chwyć mięsień ścięgna, aby przyciągnąć mięsień w kierunku kolana.

Aby umożliwić analizę okolicy brzucha, użyj prostych nożyczek, aby przeciąć mięsień piszczelowy przedni w okolicy brzucha na dwie połówki o równej wielkości i napełnij formę ołówkową do połowy roztworem zamrażającym. Włóż dwie połówki mięśnia piszczelowego przedniego do formy zamrażającej w pozycji pionowej, z obszarem brzucha skierowanym w stronę dolnej części formy. Użyj kleszczy, aby przenieść formę zamrażającą do połowy do ciekłego azotu.

Gdy medium zamrażające zmieni kolor z przezroczystego na biały i stanie się stałe, przenieś formę zamrażającą do zamrażarki o temperaturze 80 stopni Celsjusza lub do suchego lodu w celu przyszłego przetworzenia. W mięśniach kontrolnych architektura tkanki pozostaje nienaruszona, co obserwuje lokalizacja jąder na obrzeżach włókien mięśniowych oraz brak akumulacji komórek jednojądrzastych w przestrzeni śródmiąższowej. Siedem dni po urazie za pośrednictwem kardiotoksyny powstają nowe włókna mięśniowe, oznaczone centralnie położonymi jądrami i nagromadzeniem komórek jednojądrzastych składających się głównie z komórek satelitarnych, ale także komórek niemiogennych, takich jak komórki odpornościowe.

W stanie spoczynku komórki satelitarne oznaczone kolorem Pax7 na czerwono znajdują się pod blaszką podstawną, pokazaną na zielono tutaj. Trzy dni po urazie liczba komórek satelitarnych wzrasta, a komórki satelitarne nie znajdują się już pod blaszką podstawną. W 10 dniu po kontuzji liczba satelitów jest nadal zwiększona.

Aby dokładniej przeanalizować proces regeneracji, nowo powstałe włókna mięśniowe można wybarwić przeciwciałami skierowanymi przeciwko rozwojowej miozynie. Dwa dni po wstrzyknięciu siRNA komórki satelitarne można przeanalizować pod kątem obecności znakowanego fluorescencyjnie siRNA. W tym reprezentatywnym eksperymencie około 75% komórek satelitarnych w regenerującym się mięśniu było dodatnich dla znakowanego fluorescencyjnie siRNA.

Co więcej, około 74% wszystkich regenerujących się włókien mięśniowych było również dodatnich dla znakowanego fluorescencyjnie siRNA, co sugeruje, że albo 74% regenerujących się włókien mięśniowych wchłonęło siRNA, albo że komórki satelitarne siRNA-dodatnie połączyły się ze sobą, tworząc nowe włókna mięśniowe, albo że nastąpiła fuzja z już istniejącymi regenerującymi się włóknami mięśniowymi. Najważniejszym krokiem jest doprowadzenie do całkowitego uszkodzenia mięśnia piszczelowego przedniego. Oprócz analizy histologicznej można rejestrować parametry, takie jak generowana siła, w celu analizy regeneracji mięśni szkieletowych w sposób funkcjonalny.