Name: Analiza funkcji komórek satelitarnych podczas regeneracji mięśni szkieletowych przez uszkodzenie kardiotoksyny i wstrzyknięcie samodostarczającego siRNA in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Poznaj metodę analizy funkcji komórek satelitarnych podczas regeneracji mięśni szkieletowych przy użyciu kardiotoksyny i samodostarczającego siRNA in vivo. Technika ta umożliwia badanie regeneracji mięśni bez konieczności stosowania zwierząt transgenicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Departament Opieki nad Zwierzętami Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz (03-048/16; TLV; Bad Langensalza, Niemcy).
1. Uraz mięśni wywołany kardiotoksyną
UWAGA: Wykonuj wszystkie eksperymenty z udziałem żywych myszy zgodnie z krajową ustawą o ochronie zwierząt i w odpowiednich warunkach aseptycznych. Również składanie ofiar ze zwierząt musi odbywać się zgodnie z krajową ustawą o dobrostanie zwierząt.
<ol>
	<li>Zdezynfekować pojemnik inhalacyjny używany do znieczulenia wziewnego oraz obszar operacyjny 70% etanolem. Umieść sterylną ściereczkę chirurgiczną na poduszce grzewczej, w której odbędzie się operacja.</li>
	<li>Włącz poduszkę grzewczą w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Leki przeciwbólowe (np. meloksykam w dawce 1 mg/kg masy ciała należy podać podskórnie) 15 minut przed rozpoczęciem zabiegu. 
	nuta: Do typowego eksperymentu użyj myszy, które mają co najmniej 6 tygodni, są dopasowane płciowo i mają dobrą ogólną kondycję fizyczną.</li>
	<li>Przygotować roztwór kardiotoksyny (20 μM w 0,9 % NaCl), przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Pozwól, aby roztwór kardiotoksyny osiągnął temperaturę pokojową (RT).</li>
	<li>Przenieść mysz do komory inhalacyjnej i wywołać znieczulenie izofluranem (inicjacja 3,5 – 5 % w czystym tlenie). Sprawdź głębokość znieczulenia przy braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.</li>
	<li>Umieść mysz na czystym ręczniku papierowym i utrzymuj znieczulenie za pomocą maski na nos (1,5 – 3 % izofluranu w czystym tlenie). Ogolić obszar wstrzyknięcia w dolnej części nogi czaszki (od kolana do łapy, <silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Usuń nadmiar luźnych włosów. 
	nuta: Fizyczne oddzielenie obszaru golenia i iniekcji w pomieszczeniu zapewni bardziej sterylne warunki do wstrzykiwań.</li>
	<li>Umieść mysz w bocznej pozycji leżącej na poduszce grzewczej pokrytej sterylną ściereczką chirurgiczną i utrzymuj znieczulenie za pomocą maski na nos (1,5 – 3% izofluranu w czystym tlenie).</li>
	<li>Zdezynfekować obszar wstrzyknięcia podudzia czaszki (od kolana do łapy) 70% etanolem.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem wstrzyknięcia domięśniowego należy uszczypnąć palec u nogi, aby zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia.</li>
	<li>Wstrzyknąć 50 μl kardiotoksyny (20 μM w 0,9% NaCl) do mięśnia piszczelowego przedniego za pomocą strzykawki insulinowej z igłą o rozmiarze 29G. Najpierw przebij skórę tuż po dystalnej stronie kolana.</li>
	<li>Wbij igłę całkowicie w mięsień (w orientacji włókien mięśniowych/równolegle do kości piszczelowej) i powoli wstrzyknij kardiotoksynę (10-20 s) wzdłuż całej długości mięśnia, przesuwając igłę do przodu iz powrotem, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie kardiotoksyny, uszkadzając w ten sposób cały mięsień piszczelowy przedni (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B,C). 
	nuta: Uszkadzając mięsień piszczelowy przedni tylko z jednej nogi, przeciwległy mięsień piszczelowy przedni może służyć jako kontrola wewnętrzna w celu ustalenia, czy mięśnie szkieletowe nie były patologicznie dotknięte przed uszkodzeniem kardiotoksyny.</li>
	<li>Przenieś mysz z powrotem do klatki umieszczonej na poduszce grzewczej i monitoruj proces rekonwalescencji, aż zwierzę odzyska przytomność i zacznie chodzić. 
	nuta: Myszy będą wykazywać tylko lekkie utykanie. Jeśli myszy mocno kuleją i w ogóle nie obciążają nogi, poświęć mysz.</li>
	<li>Leki przeciwbólowe należy podawać przez kolejne 2 dni (np. meloksykam w dawce 1 mg/kg masy ciała podskórnie, co 24 godziny) i monitorować je co tydzień.</li>
</ol>
2. Wstrzyknięcie samodostarczającego siRNA do regenerującego się mięśnia piszczelowego przedniego (w 3 dniu po urazie kardiotoksyny)
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór siRNA, ponownie zawieszając siRNA (np. siRNA smart pool) w 0,9% NaCl (końcowe stężenie 2 μg/μL) zgodnie z instrukcją producenta. 
	nuta: SiRNA jest chemicznie modyfikowany, aby ułatwić bierne pobieranie przez komórki i chronić je przed degradacją nukleazy. Nie są potrzebne żadne odczynniki do transfekcji, co zmniejsza toksyczność. Wykorzystanie inteligentnej puli czterech niezależnych sekwencji siRNA ukierunkowanych na ten sam gen zwiększa skuteczność knockdownu.</li>
	<li>Przechowywać siRNA w temperaturze -20 °C i przenieść je na lodzie do sali operacyjnej.</li>
	<li>Zdezynfekować pojemnik inhalacyjny używany do znieczulenia wziewnego oraz obszar operacyjny 70% etanolem. Umieść sterylną ściereczkę chirurgiczną na poduszce grzewczej, w której odbędzie się operacja.</li>
	<li>Włącz poduszkę grzewczą w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przenieść mysz do pojemnika inhalacyjnego i wywołać znieczulenie izofluranem (inicjacja 3,5 – 5% w czystym tlenie). Sprawdź głębokość znieczulenia przy braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.</li>
	<li>Umieść mysz w bocznej pozycji leżącej na poduszce grzewczej pokrytej sterylną ściereczką chirurgiczną i utrzymuj znieczulenie za pomocą maski na nos (1,5 – 3% izofluranu w czystym tlenie).</li>
	<li>Zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia w dolnej części nogi czaszki (od kolana do łapy).</li>
	<li>Przed rozpoczęciem wstrzyknięcia domięśniowego należy uszczypnąć palec u nogi, aby zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia.</li>
	<li>Wstrzyknąć do 50 μl roztworu siRNA (łącznie do 100 μg w 0,9% NaCl; skierowane przeciwko genowi docelowemu; użyć zaszyfrowanego siRNA jako kontroli) do uszkodzonego mięśnia piszczelowego przedniego za pomocą strzykawki insulinowej z igłą 29 G. Najpierw przebij skórę tuż po dystalnej stronie kolana, a następnie wbij igłę w mięsień piszczelowy przedni.</li>
	<li>Wbij igłę całkowicie w mięsień (w orientacji włókien mięśniowych/równolegle do kości piszczelowej) i powoli wstrzyknij roztwór siRNA (10 – 20 s) wzdłuż całej długości mięśnia, przesuwając igłę do przodu iz powrotem, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie siRNA wzdłuż całego mięśnia piszczelowego przedniego.</li>
	<li>Przenieś mysz z powrotem do klatki umieszczonej na poduszce grzewczej i monitoruj proces rekonwalescencji, aż zwierzę odzyska przytomność i zacznie chodzić. 
	nuta: Analgezja niekoniecznie występuje po wstrzyknięciu siRNA.</li>
</ol>
3. Rozwarstwienie mięśnia piszczelowego przedniego
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór do zamrażania (2 części związku OCT i 1 część 30% sacharozy w wodzie dejonizowanej) co najmniej 12 godzin przed użyciem, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Przygotuj foremki do zamrażania, owijając folię aluminiową wokół ołówka i uszczelniając ją taśmą. Ważne jest, aby spód formy zapewniał równą, zamkniętą powierzchnię. 
	nuta: Mniejsze formy zamrażające pozwalają na szybsze zamrożenie mięśnia, unikając artefaktów zamrażania.</li>
	<li>Poświęcić mysz, np. przez wdychanie CO2 , w odpowiednim punkcie regeneracji i spryskać całą mysz i narzędzia preparacyjne 70% etanolem. 
	nuta: Zwichnięcie szyjki macicy można zastosować ponadto, aby uniknąć nadmiernego krwawienia z nogi podczas izolowania mięśnia piszczelowego przedniego.</li>
	<li>Usuń sierść i skórę z uszkodzonej kończyny tylnej, przecinając skórę w kostce bardzo cienkimi ostrymi nożyczkami (krawędź tnąca: 13 mm) i ciągnąc skórę w kierunku kolana za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Aby odsłonić ścięgno piszczelowe przednie w kostce, pociągnij pozostałą skórę w kierunku stopy lub przetnij ostrymi nożyczkami. 
	nuta: Mysz można przypiąć do płyty nośnej, aby umożliwić lepsze mocowanie.</li>
	<li>Przed pobraniem mięśnia piszczelowego przedniego usuń powięź za pomocą cienkich kleszczy (Dumont 5 lub 7, prostych lub zakrzywionych). Ściśnij zamknięte kleszcze przez powięź obok kości piszczelowej przy kostce kontuzjowanej nogi (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A). Przesuń kleszcze w kierunku kolana, rozrywając w ten sposób powięź i odsłaniając mięsień piszczelowy przedni (<silna klasa="xfig">Ryc. 2B).</li>
	<li>Aby wyizolować mięsień piszczelowy przedni, odsłoń dystalne ścięgno i chwyć je cienkimi kleszczami (Dumont 7, zakrzywiony). Przeciąć ścięgno za pomocą nożyczek sprężynowych (krawędź tnąca: 5 mm, średnica końcówki: 0,35 mm) i pociągnąć mięsień (trzymając go przy ścięgnie) w kierunku kolana.</li>
	<li>Aby zebrać mięsień piszczelowy przedni, przetnij go jak najbliżej kolana za pomocą ostrych nożyczek.</li>
	<li>Przed zamrożeniem przetnij mięsień piszczelowy przedni w środkowej części brzucha mięśnia prostymi nożyczkami na dwie połówki o równej wielkości, aby umożliwić analizę obszaru środkowej części brzucha (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C,D).</li>
	<li>Napełnij formę do zamrażania do połowy roztworem do zamrażania.</li>
	<li>Włóż dwie połówki mięśnia piszczelowego przedniego do formy zamrażającej tak, aby środkowy obszar brzucha był skierowany do dolnej części formy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2E). Upewnij się, że przednia połowa kości piszczelowej jest włożona w pozycję pionową, opierając się o ścianę formy zamrażającej, aby uniknąć przechylenia mięśnia. 
	nuta: Im więcej roztworu zamarzającego znajduje się w formie, tym dłużej potrwa zamrażanie, zwiększając w ten sposób ryzyko wystąpienia krioartefaktów.</li>
	<li>Przytrzymaj formę do zamrażania za pomocą kleszczy i przenieś ją do połowy do ciekłego azotu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2F). Upewnij się, że podczas procesu zamrażania do formy zamrażającej nie dostaje się ciekły azot.</li>
	<li>Obserwuj proces zamrażania, medium zamrażające zmienia kolor z przezroczystego na biały i staje się stałe. Zanurz formę zamrażającą w ciekłym azocie na kilka sekund i przenieś formę zamrażającą do zamrażarki o temperaturze -80 °C lub do suchego lodu w celu przyszłego przetwarzania.</li>
	<li>Zamrożone mięśnie należy przechowywać w foremkach do zamrażania w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia. 
	nuta: Formy do zamrażania dobrze mieszczą się w 24-dołkowych płytkach lub probówkach reakcyjnych o pojemności 1,5 ml, co pozwala na etykietowanie i uporządkowane przechowywanie.</li>
	<li>Z mięśniami w foremkach do zamrażania do dalszego użytku należy obchodzić się zawsze na suchym lodzie.</li>
</ol>
4. Kriosekcja regenerującego mięśnia piszczelowego przedniego
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem cięcia należy ustawić temperaturę komory kriostatu na -21 °C, temperaturę obiektu na -20 °C, a grubość cięcia na 10, 12 lub 14 μm (w zależności od przyszłych zastosowań) (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 3A).</li>
	<li>Przenieś próbkę mięśni w formie zamrażającej do kriostatu i pozwól jej dostosować się do temperatury przez kilka minut. W tym czasie oznacz szkiełka mikroskopowe.</li>
	<li>Usuń folię wokół osadzonego mięśnia za pomocą wstępnie schłodzonych kleszczyków wewnątrz kriostatu. Unikaj dotykania próbki, ponieważ kriomedium zaczyna się łatwo rozmrażać.</li>
	<li>Zamontuj próbkę w obszarze środkowego brzucha mięśnia piszczelowego przedniego skierowanego do góry na metalowym uchwycie próbki kriostatu za pomocą kriopożywki. Gwarantuje to, że miejsce cięcia mięśnia (spód formy) jest skierowane w stronę eksperymentatora.</li>
	<li>Włóż uchwyt na próbkę z zamontowaną próbką do mechanizmu tnącego. 
	nuta: Aby zapewnić prawidłowe podział próbki, przed rozpoczęciem należy użyć nowego ostrza.</li>
	<li>Najpierw przyciąć blok próbki (30 μm), aby uzyskać równą płaszczyznę przekroju i dotrzeć do odpowiedniego obszaru mięśnia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B).</li>
	<li>Po przycięciu należy wyciąć kolejne odcinki o odpowiedniej grubości (np. 14 μm).</li>
	<li>Zbierz skrawki na szkiełkach mikroskopowych, przytrzymując szkiełko stroną zadrukowaną w dół nad przekrojem. Sekcja jest dołączana do slajdu (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C).</li>
	<li>Przechowywać skrawki w temperaturze -80 °C lub -20 °C do czasu dalszego użycia lub bezpośredniego użycia do immunofluorescencji lub immunohistochemii.</li>
</ol>
5. Barwienie immunologiczne dla markerów regeneracji
<ol>
	<li>Wszystkie dalsze kroki należy wykonać w nawilżonej komorze.</li>
	<li>Krótko zrównoważyć sekcje w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Utrwal skrawki z 1 ml 2% PFA (w PBS, pH 7,4) na szkiełko przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń 2% roztwór PFA, wlewając go do odpowiedniego pojemnika na odpady.</li>
	<li>Płukać 3 razy 1 ml PBS (pH 7,4) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyjmij PBS, wlewając go do pojemnika na odpady.</li>
	<li>Na szkiełko dodać 1 ml roztworu do permeabilizacji (0,1% Triton X-100, 0,1 M glicyny o pH PBS 7,4) przez 10 minut.</li>
	<li>Usunąć roztwór przepuszczalny, wlewając go do pojemnika na odpady.</li>
	<li>Dodać 150 μl roztworu blokującego (M.O.M. 1:40 w PBS pH 7,4) na szkiełko podstawowe i przykryć szkiełkiem nakrywkowym. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć szkiełko nakrywkowe i roztwór blokujący, nałożyć 100 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego [PAX7, DSHB, mysie IgG1, nierozcieńczone lub devMHC, DSHB, nierozcieńczone, mysie IgG1 i laminina (królik, 1:1,000)] na szkiełko. Przykryj szkiełkiem podstawowym. Inkubować O/N (przez noc) w temperaturze 4 °C. 
	nuta: Wykonaj barwienie kontrolne, pomijając przeciwciała pierwszorzędowe, zamiast tego inkubuj sekcję z roztworem blokującym.</li>
	<li>Płukać 3 razy 1 ml PBS (pH 7,4) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń PBS, wlewając go do pojemnika na odpady.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych (Alexa Fluor 546 kozia anty-mysia IgG1 i Alexa Fluor 488 osła anty-królicza IgG w roztworze blokującym, 1: 1,000) na szkiełko podstawowe i przykryć szkiełkiem nakrywkowym. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubuj szkiełka w ciemności, np. użyj folii aluminiowej do przykrycia lub użyj czarnej nawilżonej komory. 
	nuta: Od tej pory wszystkie kroki powinny być wykonywane w warunkach zmniejszonego oświetlenia, ponieważ niektóre przeciwciała drugorzędowe są wrażliwe na światło.</li>
	<li>Usunąć szkiełko nakrywkowe i roztwór przeciwciał drugorzędowych.</li>
	<li>Płukać 3 razy 1 ml PBS (pH 7,4) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wyjmij PBS, wlewając go do pojemnika na odpady.</li>
	<li>Barwienie DAPI należy przeprowadzić, dodając 1 ml roztworu na szkiełko do końcowego stężenia 10 μg/ml przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń roztwór barwiący DAPI, wlewając go do pojemnika na odpady.</li>
	<li>Umyć 3 razy 1 ml PBS (pH 7,4) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Całkowicie usuń PBS używany do mycia.</li>
	<li>Nałożyć 2 – 3 krople wodnego podłoża mocującego i bezpośrednio przykryć szkiełko nową szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 1 godzinę w temperaturze RT w ciemności.</li>
	<li>Zabarwione skrawki przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu dalszej analizy przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>
6. Barwienie hematoksyliny i eozyny
<ol>
	<li>Wszystkie dalsze kroki należy wykonać w nawilżonej komorze.</li>
	<li>Utrwal skrawki z 1 ml 2% PFA (w PBS, pH 7,4) na szkiełko przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń 2% roztwór PFA, wlewając go do odpowiedniego pojemnika na odpady.</li>
	<li>Przenieś szkiełka do słoika Coplin.</li>
	<li>Delikatnie spłucz szkiełka wodą z kranu. 
	nuta: Nie odkręcaj kranu zbyt wysoko, ponieważ może to spowodować uszkodzenie sekcji.</li>
	<li>Przenieś szkiełka do nawilżonej komory. Usuń płyn.</li>
	<li>Stosować 1 ml roztworu barwiącego Hematoksylinę (Gill No 3) przez 2 minuty.</li>
	<li>Przenieś szkiełka do słoika Coplin.</li>
	<li>Delikatnie spłucz szkiełka wodą z kranu, aż jądra zmienią kolor na niebieski. 
	nuta: Nie odkręcaj kranu zbyt wysoko, ponieważ może to uszkodzić twoje sekcje.</li>
	<li>Przenieś szkiełka do nawilżonej komory. Usuń płyn.</li>
	<li>Nałożyć 1 ml roztworu Eozyny Y i inkubować przez 2 minuty.</li>
	<li>Przenieś szkiełka do słoika Coplin.</li>
	<li>Delikatnie opłucz szkiełka wodą z kranu, aż woda z kranu spływająca ze szkiełków będzie czysta.</li>
	<li>Usuń cały płyn i pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 2 minuty.</li>
	<li>Zamocuj w podłożu montażowym odpowiednim do immunohistochemii.</li>
</ol>

<ol><li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle%3A+a+brief+review+of+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle: a brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li>
<li>Schmidt, M., Schuler, S. C., Huttner, S. S., von Eyss, B., von Maltzahn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+stem+cells+at+work%3A+regenerating+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Adult stem cells at work: regenerating skeletal muscle.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2019).</li>
<li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).</li>
<li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytolology%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytolology. 9, 493-495 (1961).</li>
<li>Shea, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sprouty1+regulates+reversible+quiescence+of+a+self-renewing+adult+muscle+stem+cell+pool+during+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration.</a> Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).</li>
<li>von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7+is+critical+for+the+normal+function+of+satellite+cells+in+adult+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).</li>
<li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7-expressing+satellite+cells+are+indispensable+for+adult+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).</li>
<li>Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+and+the+muscle+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Satellite cells and the muscle stem cell niche.</a> Physiological Reviews. 93 (1), 23-67 (2013).</li>
<li>Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+muscle%3A+molecular+regulation+of+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Building muscle: molecular regulation of myogenesis.</a> Cold Spring Harb Perspectives in Biology. 4 (2), (2012).</li>
<li>Schworer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+stress+responses+induce+muscle+stem-cell+ageing+by+Hoxa9+developmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetic stress responses induce muscle stem-cell ageing by Hoxa9 developmental signals.</a> Nature. 540 (7633), 428-432 (2016).</li>
<li>Sousa-Victor, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geriatric+muscle+stem+cells+switch+reversible+quiescence+into+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Geriatric muscle stem cells switch reversible quiescence into senescence.</a> Nature. 506 (7488), 316-321 (2014).</li>
<li>Dumont, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+expression+in+muscle+stem+cells+regulates+their+polarity+and+asymmetric+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).</li>
<li>von Maltzahn, J., Renaud, J. M., Parise, G., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt7a+treatment+ameliorates+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Wnt7a treatment ameliorates muscular dystrophy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 109 (50), 20614-20619 (2012).</li>
<li>Price, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+JAK-STAT+signaling+stimulates+adult+satellite+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function.</a> Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).</li>
<li>Lukjanenko, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+fibronectin+from+the+aged+stem+cell+niche+affects+the+regenerative+capacity+of+skeletal+muscle+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Loss of fibronectin from the aged stem cell niche affects the regenerative capacity of skeletal muscle in mice.</a> Nature Medicine. 22 (8), 897-905 (2016).</li>
<li>Huttner, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Individual+Myofibers+and+Their+Adjacent+Muscle+Stem+Cells+from+Aged+and+Adult+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Individual Myofibers and Their Adjacent Muscle Stem Cells from Aged and Adult Skeletal Muscle.</a> Methods in Molecular Biology. , (2019).</li>
<li>Hardy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Study+of+Injury+Models+for+Studying+Muscle+Regeneration+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice.</a> PLoS One. 11 (1), e0147198(2016).</li>
<li>Hall, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Skeletal+Muscle+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Skeletal Muscle Stem Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1556, 237-244 (2017).</li>
<li>Dueweke, J. J., Awan, T. M., Mendias, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Skeletal+Muscle+After+Eccentric+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Sport+Rehabilitation%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Skeletal Muscle After Eccentric Injury.</a> Journal of Sport Rehabilitation. 26 (2), 171-179 (2017).</li>
<li>Lepper, C., Conway, S. J., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+satellite+cells+and+embryonic+muscle+progenitors+have+distinct+genetic+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic requirements.</a> Nature. 460 (7255), 627-631 (2009).</li>
<li>Bentzinger, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+regulates+Wnt7a+signaling+and+satellite+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fibronectin regulates Wnt7a signaling and satellite cell expansion.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 75-87 (2013).</li>
</ol>

Chcielibyśmy podziękować Christinie Picker i Christine Poser za doskonałą pomoc techniczną oraz Saskii Steiner za pomoc w określeniu wydajności transfekcji siRNA. Dziękujemy za doskonałe wsparcie techniczne, a w szczególności Sabine Landmann i Lindzie Rothenburger. Dziękujemy również myszy z zakładu dla zwierząt w FLI za doskonałe wsparcie. Prace te zostały wsparte dotacjami z Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA-3975/2-1) i Deutsche Krebshilfe (DKH-JvM-861005) dla J.v.M.

W tym miejscu przedstawiamy metodę badania funkcji określonego genu podczas regeneracji mięśni szkieletowych bez konieczności stosowania zwierząt transgenicznych. Osiąga się to poprzez połączenie uszkodzenia mięśni wywołanego kardiotoksyną z wstrzyknięciem samodostarczającego się siRNA do regenerujących się mięśni szkieletowych w 3 dniu po urazie. Szczegółowo opisaliśmy procedury uszkodzenia mięśni przez kardiotoksynę, wstrzyknięcie samodostarczającego się siRNA i przetwarzanie pobranych mięśni w celu analizy postępu regeneracji. Wykazaliśmy, że wstrzyknięcie kardiotoksyny jadu węża do mięśni szkieletowych skutecznie uszkadza cały mięsień i że samodostarczające się siRNA znajdują się w około 75% wszystkich komórek satelitarnych wśród innych typów komórek dwa dni po ich wstrzyknięciu do regenerującego się mięśnia szkieletowego (ryc. 4, ryc. 5).
Szczególną uwagę należy zwrócić na jednorodne uszkodzenie mięśnia piszczelowego przedniego, ponieważ różne stopnie uszkodzenia wpływają na wynik regeneracji, a tym samym może mieć wpływ na działanie siRNA. Ponadto niezwykle ważne jest, aby cały obszar regenerujący się został wstrzyknięty w samodostarczające się siRNA. W celu analizy procesu regeneracji zaleca się, aby zawsze porównywać podobne obszary regenerującego się mięśnia szkieletowego, dlatego mięsień piszczelowy przedni należy przeciąć na pół, aby zawsze porównywać obszar środkowej brzucha mięśnia. Analizując mięsień, należy przeanalizować całą kriosekcję, ponieważ skład włókien mięśniowych różni się w mięśniu piszczelowym przednim i dlatego może się inaczej regenerować.
Funkcję komórek satelitarnych można badać za pomocą różnych procedur eksperymentalnych, w tym ich hodowli na sąsiednich izolowanych pojedynczych włóknach mięśniowych17, przeszczepu i analizy regeneracji mięśni szkieletowych po indukowanym urazie 18,19. Badanie funkcji komórek satelitarnych za pomocą modelu uszkodzeń indukowanych in vivo, np. wstrzyknięcie kardiotoksyny, daje możliwość analizy funkcji komórek satelitarnych również pod kątem ich interakcji z innymi typami komórek, takimi jak makrofagi oraz badania wpływu czynników ogólnoustrojowych2. Uszkodzenie mięśni szkieletowych można osiągnąć na różne sposoby, np. ćwiczenia ekscentryczne, zamrożenie, wstrzyknięcie BaCl2 lub wstrzyknięcie jadów węży, takich jak kardiotoksyna lub noteksyna18. Podczas gdy ćwiczenia ekscentryczne są prawdopodobnie najbardziej fizjologiczną metodą urazu, uraz jednego konkretnego mięśnia jest ograniczony tylkodo 20. Urazy mrozowe mogą być stosowane, gdy celem badania jest migracja komórek satelitarnych w kierunku miejsca urazu lub powinna zostać uszkodzona tylko określona część mięśnia. Eksperymentalnie rzecz biorąc, wadą urazów spowodowanych zamarzaniem jest otwarta operacja, którą należy wykonać, aby zastosować wstępnie schłodzoną metalową sondę. Wstrzyknięcie BaCl2 lub jadów węży jest najbardziej dramatyczną metodą uszkodzenia, a tym samym stanowi największe wyzwanie dla funkcji komórek satelitarnych. Ponadto wstrzyknięcie jest minimalnie inwazyjne, czas operacji na ogół wynosi mniej niż pięć minut i nie obejmuje szycia itp., co minimalizuje ryzyko infekcji.
Uraz mięśni jest najczęściej wykorzystywany do badania funkcjonalnych konsekwencji utraty funkcji genów, np. utraty Pax7 7,21. Zwłaszcza, jeśli przedmiotem pytania naukowego są myszy w podeszłym wieku, stworzenie lub wykorzystanie myszy transgenicznych jest często niewykonalne. Wstrzyknięcie samodostarczających się siRNA ukierunkowanych na określony gen jest realną alternatywą w tych przypadkach i jest z powodzeniem stosowane22. Krótko mówiąc, mięsień piszczelowy przedni myszy został uszkodzony przez wstrzyknięcie kardiotoksyny, a samodostarczające się siRNA skierowane przeciwko fibronektynie (FN) zostały wstrzyknięte w 3 dniu po urazie. Mięśnie analizowano 10 dni po urazie i zaobserwowano znaczny spadek liczby komórek satelitarnych w warunkach kontroli siFN w porównaniu z zakodowanym siRNA. Skuteczność knockdown określono w lizatach całych mięśni za pomocą ilościowego Real Time PCR 2 dni po wstrzyknięciu siRNA, osiągnięto zmniejszenie poziomów ekspresji o 58%, co sugeruje, że skuteczność dostarczania i knockdown jest wystarczająca do analiz funkcjonalnych22. Alternatywą dla badania skuteczności knockdown są analizy immunoblot lub immunofluorescencji z przeciwciałami skierowanymi przeciwko genowi docelowemu. Skuteczność i swoistość siRNA stosowanego do iniekcji in vivo należy określić przed wstrzyknięciem myszom, np. poprzez badanie skuteczności w izolowanych komórkach satelitarnych lub pierwotnych mioblastach. Zastosowanie inteligentnej puli składającej się z 4 różnych siRNA w porównaniu z pojedynczym siRNA zwiększa skuteczność knockdownu, ale także zwiększa ryzyko niespecyficznego celowania. Specyficzność wszystkich użytych sekwencji siRNA powinna być badana w hodowli komórkowej, aby uniknąć efektów niedocelowych. Jako kontrolę, należy użyć nieukierunkowanego zakodowanego siRNA, ponieważ wstrzyknięcie siRNA samo w sobie może wpłynąć na proces regeneracji z powodu wstrzyknięcia, a tym samym na dodatkowe uszkodzenie mięśnia. Punkt czasowy wstrzykiwania siRNA zależy od pytania naukowego i profilu ekspresji docelowego genu. Ogólnie rzecz biorąc, wstrzyknięcie samodostarczającego siRNA w 3 dniu po uszkodzeniu kardiotoksyny celuje w większość genów ważnych dla proliferacji komórek satelitarnych, ponieważ proliferacja komórek satelitarnych osiąga szczyt około 3 dnia po urazie. Czas na pierwsze wstrzyknięcie siRNA nie powinien być krótszy niż 48 godzin po urazie kardiotoksyny, ponieważ objętość wstrzyknięcia kardiotoksyny jest dość duża, a reabsorpcja płynu powinna nastąpić przed wstrzyknięciem dodatkowych roztworów do mięśnia. Ogólnie rzecz biorąc, możliwe jest wielokrotne wstrzyknięcie siRNA lub kombinacja różnych siRNA, chociaż należy wziąć pod uwagę, że każde wstrzyknięcie do regenerującego się mięśnia powoduje dodatkowe uszkodzenia.
Jednym z ograniczeń opisanej metody jest fakt, że obserwowany efekt niekoniecznie zależy tylko od knockdown genu docelowego w komórkach satelitarnych, ale może być przypisany innym typom komórek, takim jak komórki odpornościowe lub fibro-adipogenne komórki progenitorowe. W związku z tym konieczne jest połączenie tych eksperymentów z eksperymentami badającymi czystą populację komórek satelitarnych. Można przeprowadzić eksperymenty z użyciem pływających kultur włókien miowodnych, w których komórki satelitarne są hodowane na sąsiednich włóknach mięśniowych lub przeprowadzić eksperymenty transplantacyjne przy użyciu izolowanych komórek satelitarnych17.
Alternatywą dla wstrzykiwania samodostarczających się siRNA jest wstrzykiwanie inhibitorów drobnocząsteczkowych lub białek rekombinowanych, które można przeprowadzić, w zależności od pytania naukowego. Na przykład wstrzyknięcie białka macierzy zewnątrzkomórkowej fibronektyny lub małocząsteczkowych inhibitorów sygnalizacji JAK / STAT zostało z powodzeniem przeprowadzone u starszych myszy15,16. Analiza określonej funkcji genu w jednym konkretnym typie komórki podczas regeneracji mięśni szkieletowych, np. w komórkach satelitarnych, jest możliwa tylko dzięki zastosowaniu indukowalnego genetycznego modelu myszy. Wstrzyknięcia samodostarczających się siRNA, rekombinowanych białek lub inhibitorów małocząsteczkowych mogą wpływać na wiele typów komórek w regenerujących się mięśniach szkieletowych.

Mięśnie szkieletowe to największa tkanka ciała stanowiąca około 40% całkowitej masy ciała, umożliwiająca dobrowolne poruszanie się. Architektura tkankowa mięśni szkieletowych składa się głównie z postmitotycznych, terminalnie zróżnicowanych, wielojądrowych włókien mięśniowych, a także różnych innych komórek obwodowego układu nerwowego, układu naczyniowego i komórek śródmiąższowych1. Co ważne, mięśnie szkieletowe mają ogromną zdolność do regeneracji i przywracania funkcji po urazie lub uszkodzeniu2. Proces ten zależy od komórek macierzystych mięśni rezydujących w tkance, zwanych również komórkami satelitarnymi3,4. Komórki satelitarne znajdują się między włóknem mięśniowym a blaszką podstawy i charakteryzują się ekspresją czynnika transkrypcyjnego Pax75,6,7. W warunkach homeostatycznych komórki satelitarne są w stanie spoczynku, ale aktywują się z powodu urazu, np. poprzez ekscentryczne ćwiczenia lub eksperymentalnie poprzez wstrzyknięcie kardiotoksyny jadu węża6,8. Po aktywacji, dodatnie komórki satelitarne Pax7 wykazują koekspresję MyoD i Myf5, co angażuje komórki macierzyste w różnicowanie miogenne. Komórki satelitarne, które są odporne na regulację w górę czynników zaangażowania, zachowają swój potencjał macierzysty i powrócą do stanu spoczynku, aby uzupełnić pulę komórek macierzystych na przyszłe potrzeby. Po rozszerzeniu puli miogennych progenitorów, sieci transkrypcyjne są aktywowane przez czynniki różnicujące, takie jak miogenina, aby zainicjować wyjście z cyklu komórkowego i końcowe różnicowanie. Te mioprogenitory następnie łączą się ze sobą lub z istniejącymi włóknami mięśniowymi, przyczyniając się do utrzymania wielkości domeny mięśniowo-jądrowej. Włókna mięśniowe wyrażają końcowe geny różnicowania mięśni, takie jak ciężki łańcuch miozyny. Wreszcie, nowo powstałe włókna mięśniowe rosną i dojrzewają, aby zbudować jednostki funkcjonalne mięśni szkieletowych9,10.
Na regenerację mięśni szkieletowych mogą wpływać różne warunki, w tym choroby mięśni lub starzenie się11,12, począwszy od łagodnych upośledzeń do stanów zagrażających życiu, np. w dystrofii mięśniowej Duchenne'a13,14. Dlatego medycyna regeneracyjna ma na celu odbudowę uszkodzonej lub nieprawidłowo działającej tkanki mięśni szkieletowych przy użyciu jej wrodzonej mocy regeneracyjnej poprzez ukierunkowanie na funkcję komórki satelitarnej15,16. Aby w pełni wykorzystać jego potencjał, konieczne jest kompleksowe poznanie komórek satelitarnych w ich endogennej niszy podczas regeneracji mięśni szkieletowych. Chociaż istnieją eksperymentalne podejścia do izolowania komórek satelitarnych sąsiadujących z ich włóknami mięśniowymi17, pełna złożoność komórkowych i systemowych interakcji komórek satelitarnych z ich otoczeniem może być podsumowana tylko in vivo. W związku z tym ogromna wiedza na temat regeneracji mięśni szkieletowych została zdobyta za pomocą modeli urazów myszy2,18.
Tutaj przedstawiamy specyficzny eksperymentalny model uszkodzeń myszy do badania regeneracji za pośrednictwem komórek macierzystych wywołanych przez kardiotoksynę uszkodzeń mięśnia piszczelowego przedniego in vivo. Kardiotoksyna, cytolityczna toksyna pochodząca z węża, która powoduje depolaryzację i martwicę włókien mięśniowych, jest wstrzykiwana do mięśnia piszczelowego przedniego, co z kolei wywoła degenerację tkanek, a następnie regenerację. Aby przeanalizować funkcję genów podczas ostrej regeneracji, samodostarczające się siRNA są wstrzykiwane w 3 dniu po urazie, w szczycie ekspansji komórki satelitarnej. Zwierzęta doświadczalne są uśmiercane w różnych punktach czasowych i pobierane są mięśnie piszczelowe przednie. Wypreparowane mięśnie są zamrażane i przetwarzane do dalszej kriosekcji. Mikroskopia immunofluorescencyjna jest następnie wykorzystywana do analizy markerów regeneracji. Metoda ta pozwala na badanie funkcji pojedynczego genu podczas sterowanej komórkami satelitarnymi regeneracji mięśni szkieletowych przy użyciu myszy typu dzikiego.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>Isothesia</td><td>inhalacja narkotyki</td></tr><tr><td>Gorąca płyta 062</td><td>Labotect</td><td>13854</td><td></td></tr><tr><td>System anestezjologiczny (Tec 7) z pudłem inhalacyjnym + maski na nos</td><td>Tem</td><td>Sega Minihub</td><td></td></tr><tr><td>Golarka dla gryzoni</td><td>isis</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>Cardiotoxin</td><td>Latoxan</td><td>L8102</td><td>jad węża potrzebny do kontuzji mięśni</td></tr><tr><td>Accell siRNA inteligentna pula</td><td>Dharmacon</td><td>w zależności od docelowego genu</td><td>samodostarczającego siRNA</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 osioł anty-królik IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21206</td> przeciwciało <td>wtórne</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 kozie przeciwciało przeciw myszom IgG1</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21123</td><td>przeciwciało wtórne</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>631-1574</td><td></td></tr><tr><td>CV Mount</td><td>Leica</td><td>14046430011</td><td>podłoże montażowe do immunohistochemii</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>marker jądrowy</td></tr><tr><td>devMHC przeciwciało</td><td>DHSB</td><td>F.1652</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Thermo Fisher</td><td>73104</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina Gill No3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS316-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa (29 g)</td><td>Terumo</td><td>3SS05M2813</td><td>strzykawka używana do iniekcji mięśniowych</td></tr><tr><td>Przeciwciało lamininowe</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący M.O.M</td><td>Vector labs</td><td>MKB-2213</td><td>blokujący barwienie immunofluorescencyjne</td></tr><tr><td>Meloksykam</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>Metacam</td><td>leki przeciwbólowe</td></tr><tr><td>OCT</td><td>Thermo Fisher</td><td>6502</td><td>osadzanie w tkankach</td></tr><tr><td>przeciwciało Pax7</td><td>DSHB</td><td>Przeciwciało</td><td>swoiste dla komórek satelitarnych</td>PAX7</tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36934</td><td>podłoże montażowe aequos</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Carl Roth</td><td>4621.1</td> do <td>zatapiania tkanek</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Superfrost plus</td><td>Thermo</td><td>J1830AMNZ</td> Scientific</tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Odczynnik</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> do permeabilizacji Amresco 0694-1L<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia do preparacji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont 5, proste</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 7, zakrzywione</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>Bardzo cienkie nożyczki Bonn (krawędź tnąca: 13&nbsp; mm)</td> <td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze o wąskim wzorze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-16</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe (krawędź tnąca: 5&nbsp; mm, średnica końcówki: 0,35&nbsp; mm)</td> <td>Narzędzia do nauki pięknej</td><td>91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza funkcji komórek satelitarnych podczas regeneracji mięśni szkieletowych przez uszkodzenie kardiotoksyny i wstrzyknięcie samodostarczającego sirna in vivo

Analyzing Satellite Cell Function During Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injury and Injection of Self-delivering siRNA In Vivo

Mięśnie szkieletowe posiadają ogromną zdolność do regeneracji po urazach. Proces ten jest napędzany głównie przez komórki macierzyste mięśni, zwane również komórkami satelitarnymi. Komórki satelitarne charakteryzują się ekspresją czynnika transkrypcyjnego Pax7 i ich lokalizacją pod blaszką podstawną w spoczynkowych mięśniach szkieletowych. Po uszkodzeniu komórki satelitarne ulegają aktywacji, ulegają samoodnowie lub różnicowaniu, tworząc nowe włókna mięśniowe lub łącząc się z uszkodzonymi. Funkcjonalność komórek satelitarnych in vivo można badać za pomocą opartego na kardiotoksynach modelu uszkodzenia mięśni szkieletowych. Do badania funkcji jednego genu podczas regeneracji mięśni szkieletowych najczęściej wykorzystuje się transgeniczne modele myszy. W tym miejscu przedstawiamy alternatywną dla myszy transgenicznych metodę, aby zbadać funkcję genów w komórkach satelitarnych podczas regeneracji, np. w przypadkach, gdy myszy transgeniczne nie są dostępne. Łączymy uszkodzenie określonego mięśnia szkieletowego za pośrednictwem kardiotoksyny z wstrzyknięciem samodostarczającego się siRNA do regenerującego się mięśnia, który jest następnie pobierany przez komórki satelitarne między innymi przez komórki. W ten sposób udostępniamy metodę analizy funkcji genów w komórkach satelitarnych podczas regeneracji w warunkach fizjologicznych bez konieczności stosowania myszy transgenicznych.

Typowy wynik barwienia hematoksyliną i eozyną (H&amp;E) mięśnia piszczelowego przedniego przed i po uszkodzeniu wywołanym przez kardiotoksynę przedstawiono na Rysunku 4A,B. W mięśniach kontrolnych architektura mięśnia jest nienaruszona, co widać po lokalizacji jąder na obrzeżach włókien mięśniowych oraz braku gromadzenia się komórek jednojądrzastych w przestrzeni śródmiąższowej (Rysunek 4A). 7 dni po uszkodzeniu wywołanym przez kardiotoksynę powstają nowe włókna mięśniowe, charakteryzujące się centralnie położonymi jądrami (Rysunek 4B). Ponadto można zaobserwować gromadzenie się komórek jednojądrzastych, składających się głównie z komórek satelitarnych, ale także z komórek niemyogenicznych, takich jak komórki odpornościowe. Cały mięsień powinien być uszkodzony, co charakteryzuje się centralnym położeniem wszystkich jąder mięśniowych oraz gromadzeniem się komórek jednojądrzastych w całym przekroju mięśnia.
Aby scharakteryzować przebieg i sukces procesu regeneracji, można przeprowadzić kilka barwień immunofluorescencyjnych z użyciem markerów regeneracji. Liczbę komórek satelitarnych można ocenić poprzez barwienie na Pax7, kanoniczny marker komórek satelitarnych (Rysunek 4C,D). Trzy dni po urazie liczba komórek satelitarnych wzrasta (Rysunek 4D), a komórki satelitarne nie znajdują się już pod błoną podstawną. Aby dalej analizować proces regeneracji, nowo utworzone włókna mięśniowe można zabarwić przeciwciałami skierowanymi przeciwko miozynie rozwojowej (Rysunek 4E). Nowo powstałe włókna mięśniowe wykazują centralnie położone jądra oraz silną ekspresję miozyny rozwojowej. W miarę dojrzewania włókien mięśniowych ekspresja miozyny rozwojowej spada, średnica włókna mięśniowego zwiększa się, a jądra migrują na obwód włókien mięśniowych.
Wpływ pojedynczego genu na proces regeneracji można badać z wykorzystaniem myszy transgenicznych lub, jak pokazano tutaj, poprzez wstrzyknięcie samonaprowadzającego się siRNA. Fluorescencyjnie znakowane, samonaprowadzające się kontrolne siRNA o sekwencji scrambled wstrzyknięto do regenerującego mięśnia piszczelowego przedniego w 3. dniu po urazie, czyli w punkcie czasowym, w którym następuje szczyt proliferacji komórek satelitarnych. Dwa dni po wstrzyknięciu siRNA przeanalizowano komórki satelitarne pod kątem obecności fluorescencyjnie znakowanego siRNA (Rysunek 4F). Przebadano, ile komórek satelitarnych pobrało fluorescencyjnie znakowane siRNA dwa dni po wstrzyknięciu do regenerującego mięśnia (Rysunek 5). Około 75% wszystkich komórek satelitarnych w regenerującym mięśniu było pozytywnych pod kątem fluorescencyjnie znakowanego siRNA. Ponadto ustalono, że około 74% wszystkich regenerujących się włókien mięśniowych było pozytywnych pod kątem fluorescencyjnie znakowanego siRNA, co sugeruje, że albo 74% regenerujących się włókien mięśniowych pobrało siRNA, albo pozytywne pod kątem siRNA komórki satelitarne zfuzowały się ze sobą, tworząc nowe włókna mięśniowe, albo doszło do fuzji z już istniejącymi regenerującymi się włóknami mięśniowymi (Rysunek 5). Sugeruje to, że komórki satelitarne pobierają samonaprowadzające się siRNA i że siRNA utrzymuje się w komórkach satelitarnych przez co najmniej dwa dni.
<img alt="Model mysi: Ultradźwiękowe badanie skóry i iniekcja, proces eksperymentalnego podawania leku." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60194/60194fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Wstrzyknięcie kardiotoksyny do mięśnia piszczelowego przedniego. (AMyszy poddaje się znieczuleniu poprzez inhalację izofluranu, a następnie ogala się kończynę dolną.B) Igłę 29 G wprowadza się do mięśnia piszczelowego przedniego (C) i przemieszczało się wzdłuż kości piszczelowej podczas wstrzykiwania roztworu kardiotoksyny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60194/60194fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces ekstrakcji mięśni myszy; eksperyment naukowy dotyczący przygotowania tkanki do analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60194/60194fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Etapy sekcji i mrożenia uszkodzonego mięśnia piszczelowego przedniego. (A) mięśnie kończyn tylnych zostają odsłonięte (B) i powięź otaczająca mięsień piszczelowy przedni zostaje rozcięta, aby odsłonić mięsień. (CPo usunięciu mięśnia należy przeciąć go w połowie brzuszca na dwie części o podobnej wielkości, używając ostrych nożyczek prostych (D). (EPołówki rozczłonionego mięśnia umieszcza się w formie z folii aluminiowej wypełnionej roztworem mrożącym i zamraża w ciekłym azocie (F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60194/60194fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Seria procesów mikrotomowania: A) konfiguracja mikrotomu; B) uchwyt do próbek; C) przygotowanie szkiełek, histologia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60194/60194fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wyposażenie i etapy procesu kriofragmentacji mięśni piszczelowych przednich. (ATemperatura komory kriostatu zostaje ustawiona na -21 °C. (BMięsień piszczelowy przedni w roztworze mrożącym zostaje zamocowany w uchwycie do próbek.C) Przekroje 14 µm warstwy o określonej grubości są przytwierdzone do szklanych płytek mikroskopowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60194/60194fig03large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy histologiczne i immunofluorescencyjne tkanki mięśniowej; analiza struktury włókien i ekspresji białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60194/60194fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rysunek 4: Reprezentatywne obrazy regenerujących się mięśni piszczelowych przednich. H&amp;Barwienie mięśni piszczelowych przednich przed (A) oraz 7 dni po uszkodzeniu kardiotoksyną (B). (C) W nieuszkodzonym mięśniu komórki satelitarne Pax7-dodatnie (na czerwono) znajdują się pod blaszką podstawną znakowaną lamininą (na zielono). Jądra komórkowe są przeciwbarwione DAPI (na niebiesko). Komórki Pax7-dodatnie zaznaczono strzałką. (D) Po 10 dniach regeneracji włókna mięśniowe charakteryzują się centralnie położonymi jądrami (na niebiesko), Pax7 ukazano na czerwono, a lamininę na zielono. Komórki Pax7-dodatnie zaznaczono strzałką. (ENowo powstałe włókna mięśniowe wykazują ekspresję miozyny rozwojowej (na czerwono) oraz lamininy (na zielono); jądra komórkowe zostały wybarwione DAPI (na niebiesko).F) Fluorescencyjne znakowane samodosiadające siRNA (siRED, przedstawione na czerwono) nadal znajduje się w komórkach satelitnich (Pax7 dodatnie, na zielono, zaznaczone strzałką na powiększeniu) 2 dni po wstrzyknięciu samodosiadającego siRNA do regenerującego się mięśnia piszczelowego przedniego (wstrzyknięcie w 3. dniu po uszkodzeniu indukowanym kardiotoksyną). Lamininę pokazano na biało, jądra komórkowe przeciwbarwiono DAPI (na niebiesko). Pasek skali = 100 µm (A i B), 50 µm (C-E), 25 µm (F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60194/60194fig04large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="wykres efektu siRNA; porównanie komórek Pax7+ i regenerujących się włókien mięśniowych; dołączona tabela danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60194/60194fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Ilościowe oznaczenie poboru siRNA znakowanego fluorescencyjnie. (A) Ilościowe oznaczenie poboru siRNA przez komórki satelitarne (komórki Pax7+) i regenerujące się włókna mięśniowe 2 dni po wstrzyknięciu do regenerującej się mięśni szkieletowej. Wstrzyknięcie wykonano w 3. dobie po uszkodzeniu wywołanym przez kardiotoksynę. n = 3, słupki błędu reprezentują SEM. (B) Ilościowe określenie danych stanowiących podstawę wykresu przedstawionego w punkcie (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60194/60194fig05large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

Opisujemy metodę in vivo do badania funkcjonalnej utraty określonego genu w komórkach satelitarnych za pomocą kombinacji uszkodzenia mięśni szkieletowych za pośrednictwem kardiotoksyny i wstrzyknięcia samodostarczającego siRNA.

Analiza funkcji komórek satelitarnych podczas regeneracji mięśni szkieletowych przez uszkodzenie kardiotoksyny i wstrzyknięcie samodostarczającego siRNA in vivo

Skeletal muscle possesses an enormous capacity to regenerate after injury. This process is mainly driven by muscle stem cells, also termed satellite ...

Technika ta pozwala na połączenie domięśniowego wstrzyknięcia kardiotoksyny z jadu węża z domięśniowym wstrzyknięciem samodostarczającego siRNA, umożliwiając w ten sposób analizę regeneracji mięśni szkieletowych. Zastosowanie samodostarczającego siRNA jest eleganckim sposobem badania funkcjonalnej utraty pojedynczych genów podczas regeneracji mięśni, unikając w ten sposób zwierząt transgenicznych. Po potwierdzeniu braku reakcji na szczypanie palca, należy ogolić obszar wstrzyknięcia w dolnej części nogi czaszki od kolana do łapy i usunąć luźne włosy.Umieść mysz w pozycji leżącej na nożowniku pokrytym sterylną szmatką chirurgiczną i użyj 70% etanolu do dezynfekcji obszaru wstrzyknięcia w dolnej części nogi czaszki. Następnie załaduj strzykawkę insulinową wyposażoną w igłę o rozmiarze 29 z 50 mikrolitrami 20 mikromolowej kardiotoksyny i wbij skórę całkowicie w mięsień, tylko dystalnie do kolana. Gdy igła jest na miejscu, wstrzyknąć kardiotoksynę w ciągu 10 do 20 sekund wzdłuż całej długości mięśnia, jednocześnie przesuwając igłę do przodu iz powrotem, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie kardiotoksyny, uszkadzając w ten sposób cały mięsień piszczelowy przedni.Następnie umieść mysz z powrotem w klatce na poduszce grzewczej z monitorowaniem aż do pełnego położenia. Trzy dni po zabiegu należy zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia, jak pokazano poniżej. Wstrzyknąć do 50 mikrolitrów siRNA skierowanego przeciwko docelowemu genowi zainteresowania do mięśnia piszczelowego przedniego znieczulonej myszy, jak właśnie pokazano.Następnie umieść mysz z powrotem w klatce, monitorując ją aż do pełnego leżenia. Przed pobraniem uszkodzonej tkanki mięśniowej owiń ołówek folią i uszczelnij ołówek taśmą, tak aby dno formy zapewniało równą, zamkniętą powierzchnię. Gdy pleśń będzie gotowa, zdezynfekuj całe zwierzę 70% etanolem i użyj bardzo ostrych nożyczek, aby usunąć skórę w kostce.Przed pobraniem mięśnia użyj cienkich kleszczy, aby uszczypnąć zamknięte kleszcze przez powięź obok kości piszczelowej w kostce zranionej nogi i przesuń kleszcze w kierunku kolana, aby rozerwać powięź, odsłaniając mięsień piszczelowy przedni. Aby wyizolować mięsień piszczelowy przedni, odsłoń ścięgno dystalne i chwyć ścięgno cienkimi kleszczami. Użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć ścięgno i chwyć mięsień ścięgna, aby przyciągnąć mięsień w kierunku kolana.Aby umożliwić analizę okolicy brzucha, użyj prostych nożyczek, aby przeciąć mięsień piszczelowy przedni w okolicy brzucha na dwie połówki o równej wielkości i napełnij formę ołówkową do połowy roztworem zamrażającym. Włóż dwie połówki mięśnia piszczelowego przedniego do formy zamrażającej w pozycji pionowej, z obszarem brzucha skierowanym w stronę dolnej części formy. Użyj kleszczy, aby przenieść formę zamrażającą do połowy do ciekłego azotu.Gdy medium zamrażające zmieni kolor z przezroczystego na biały i stanie się stałe, przenieś formę zamrażającą do zamrażarki o temperaturze 80 stopni Celsjusza lub do suchego lodu w celu przyszłego przetworzenia. W mięśniach kontrolnych architektura tkanki pozostaje nienaruszona, co obserwuje lokalizacja jąder na obrzeżach włókien mięśniowych oraz brak akumulacji komórek jednojądrzastych w przestrzeni śródmiąższowej. Siedem dni po urazie za pośrednictwem kardiotoksyny powstają nowe włókna mięśniowe, oznaczone centralnie położonymi jądrami i nagromadzeniem komórek jednojądrzastych składających się głównie z komórek satelitarnych, ale także komórek niemiogennych, takich jak komórki odpornościowe.W stanie spoczynku komórki satelitarne oznaczone kolorem Pax7 na czerwono znajdują się pod blaszką podstawną, pokazaną na zielono tutaj. Trzy dni po urazie liczba komórek satelitarnych wzrasta, a komórki satelitarne nie znajdują się już pod blaszką podstawną. W 10 dniu po kontuzji liczba satelitów jest nadal zwiększona.Aby dokładniej przeanalizować proces regeneracji, nowo powstałe włókna mięśniowe można wybarwić przeciwciałami skierowanymi przeciwko rozwojowej miozynie. Dwa dni po wstrzyknięciu siRNA komórki satelitarne można przeanalizować pod kątem obecności znakowanego fluorescencyjnie siRNA. W tym reprezentatywnym eksperymencie około 75% komórek satelitarnych w regenerującym się mięśniu było dodatnich dla znakowanego fluorescencyjnie siRNA.Co więcej, około 74% wszystkich regenerujących się włókien mięśniowych było również dodatnich dla znakowanego fluorescencyjnie siRNA, co sugeruje, że albo 74% regenerujących się włókien mięśniowych wchłonęło siRNA, albo że komórki satelitarne siRNA-dodatnie połączyły się ze sobą, tworząc nowe włókna mięśniowe, albo że nastąpiła fuzja z już istniejącymi regenerującymi się włóknami mięśniowymi. Najważniejszym krokiem jest doprowadzenie do całkowitego uszkodzenia mięśnia piszczelowego przedniego. Oprócz analizy histologicznej można rejestrować parametry, takie jak generowana siła, w celu analizy regeneracji mięśni szkieletowych w sposób funkcjonalny.

analyzing-satellite-cell-function-during-skeletal-muscle-regeneration

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Izolacja i hodowla włókien mięśniowych to złoty standard systemu in vitro do badania przejścia komórek satelitarnych przez spoczynek, aktywację i różnicowanie.  Co ważne, system hodowli pojedynczych włókien mięśniowych zachowuje asocjację miofiber/komórki macierzyste, która jest niezbędnym składnikiem niszy komórek macierzystych mięśni.

Izolacja i hodowla poszczególnych włókien mięśniowych i ich komórek satelitarnych z dorosłych mięśni szkieletowych

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące z miogennych komórek macierzystych są obiecującymi kandydatami na strategie terapii komórkowej w leczeniu dystrofii mięśniowych. Protokół ten opisuje przeszczep i pomiary funkcjonalne wymagane do oceny wszczepienia i różnicowania mezoangioblastów pochodzących z iPSC (rodzaj komórek progenitorowych mięśni) w mysich modelach ostrej i przewlekłej regeneracji mięśni.

Przeszczep indukowanych pluripotencjalnych progenitorów miogennych podobnych do mezoangioblastów pochodzących z mezoangioblastów w mysich modelach regeneracji mięśni

Izolacja i hodowla czystej populacji spokojnych komórek satelitarnych, populacji komórek macierzystych mięśni, jest niezbędna do zrozumienia biologii i regeneracji komórek macierzystych mięśni, a także przeszczepu komórek macierzystych do terapii dystrofii mięśniowej i innych chorób zwyrodnieniowych.

Izolacja, hodowla i przeszczep satelitarnych komórek mięśniowych

Ten protokół opisuje izolację komórek satelitarnych z mięśni głowy skrzelowych 9-tygodniowego szczura. Mięśnie wywodzą się z różnych łuków skrzelowych. Następnie komórki satelitarne są hodowane na punktowej powłoce o rozmiarach milimetra w celu zbadania ich różnicowania. Takie podejście pozwala uniknąć rozszerzania się i przechodzenia komórek satelitarnych.

Izolacja i charakterystyka komórek satelitarnych z mięśni skrzelowych głowy szczura

Opisujemy protokół in vivo do pomiaru zgięcia grzbietowego stopy po stymulacji nerwu strzałkowego i skurczu przedniego przedziału podudniowego kończyny tylnej szczura. Takie pomiary są niezastąpionym narzędziem translacyjnym do oceny patologii mięśni szkieletowych i podejść inżynierii tkankowej do naprawy i regeneracji mięśni.

Zastosowania testów funkcjonalnych in vivo kości piszczelowej szczura przedniego do oceny naprawy mięśni szkieletowych za pomocą inżynierii tkankowej

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół indukcji ostrej regeneracji mięśni szkieletowych u dorosłych myszy i późniejszych manipulacji mięśni, takich jak rozwarstwienie, zamrażanie, cięcie, rutynowe barwienie i analiza obszaru przekroju poprzecznego włókien mięśniowych.

Indukcja ostrej regeneracji mięśni szkieletowych przez wstrzyknięcie kardiotoksyny

W tym protokole opisana jest metoda hodowli in vitro i analizy funkcjonalnej komórek macierzystych mięśni, która zachowuje większość ich interakcji z ich endogenną niszą.

Test pojedynczej hodowli włókien mięśniowych do oceny funkcjonalności dorosłych komórek macierzystych mięśni ex vivo

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia identyfikację i wielowymiarową analizę komórek macierzystych i progenitorowych mięśni za pomocą jednokomórkowej cytometrii masowej oraz ich oczyszczanie przez FACS w celu dogłębnych badań ich funkcji. Podejście to można zastosować do badania dynamiki regeneracji w modelach chorobowych i testowania skuteczności interwencji farmakologicznych.

Identyfikacja i analiza progenitorów miogennych in vivo podczas ostrego uszkodzenia mięśni szkieletowych za pomocą wysokowymiarowej cytometrii masowej pojedynczej komórki

Protokół ten zapewnia ustandaryzowaną metodę izolowania i wzbogacania pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i noworodków myszy poprzez dysocjację tkanek, filtrację sekwencyjną, wstępne nakładanie oraz określone warunki hodowlane, umożliwiając tworzenie i utrzymanie hodowli mioblastów pochodzących z komórek satelitarnych do dalszych zastosowań eksperymentalnych.

Izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy

Ten protokół opisuje metodę efektywnej transfekcji siRNA w świeżo wyizolowanych ludzkich cytotrofoblastach kosmkowych za pomocą mikroporacji i identyfikacji kompleksów DNA-białko w tych komórkach. Transfekowane komórki mogą być monitorowane za pomocą analiz Western blot i EMSA podczas 4-dniowego czasu hodowli.

Transfekcja siRNA i analizy EMSA na świeżo wyizolowanych ludzkich cytotrofoblastach kosmkowych

Poznaj metodę analizy funkcji komórek satelitarnych podczas regeneracji mięśni szkieletowych przy użyciu kardiotoksyny i samodostarczającego siRNA in vivo. Technika ta umożliwia badanie regeneracji mięśni bez konieczności stosowania zwierząt transgenicznych.

Analiza funkcji komórek satelitarnych podczas regeneracji mięśni szkieletowych przez uszkodzenie kardiotoksyny i wstrzyknięcie samodostarczającego siRNA in vivo (Wideo) | JoVE Journal

Analiza funkcji komórek satelitarnych podczas regeneracji mięśni szkieletowych przez uszkodzenie kardiotoksyny i wstrzyknięcie samodostarczającego siRNA in vivo

Przeglądaj więcej filmów