Analiza funkcji komórek satelitarnych podczas regeneracji mięśni szkieletowych przez uszkodzenie kardiotoksyny i wstrzyknięcie samodostarczającego siRNA in vivo
18 września 2019
Opisujemy metodę in vivo do badania funkcjonalnej utraty określonego genu w komórkach satelitarnych za pomocą kombinacji uszkodzenia mięśni szkieletowych za pośrednictwem kardiotoksyny i wstrzyknięcia samodostarczającego siRNA.
Technika ta pozwala na połączenie domięśniowego wstrzyknięcia kardiotoksyny z jadu węża z domięśniowym wstrzyknięciem samodostarczającego siRNA, umożliwiając w ten sposób analizę regeneracji mięśni szkieletowych. Zastosowanie samodostarczającego siRNA jest eleganckim sposobem badania funkcjonalnej utraty pojedynczych genów podczas regeneracji mięśni, unikając w ten sposób zwierząt transgenicznych. Po potwierdzeniu braku reakcji na szczypanie palca, należy ogolić obszar wstrzyknięcia w dolnej części nogi czaszki od kolana do łapy i usunąć luźne włosy.
Umieść mysz w pozycji leżącej na nożowniku pokrytym sterylną szmatką chirurgiczną i użyj 70% etanolu do dezynfekcji obszaru wstrzyknięcia w dolnej części nogi czaszki. Następnie załaduj strzykawkę insulinową wyposażoną w igłę o rozmiarze 29 z 50 mikrolitrami 20 mikromolowej kardiotoksyny i wbij skórę całkowicie w mięsień, tylko dystalnie do kolana. Gdy igła jest na miejscu, wstrzyknąć kardiotoksynę w ciągu 10 do 20 sekund wzdłuż całej długości mięśnia, jednocześnie przesuwając igłę do przodu iz powrotem, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie kardiotoksyny, uszkadzając w ten sposób cały mięsień piszczelowy przedni.
Następnie umieść mysz z powrotem w klatce na poduszce grzewczej z monitorowaniem aż do pełnego położenia. Trzy dni po zabiegu należy zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia, jak pokazano poniżej. Wstrzyknąć do 50 mikrolitrów siRNA skierowanego przeciwko docelowemu genowi zainteresowania do mięśnia piszczelowego przedniego znieczulonej myszy, jak właśnie pokazano.
Następnie umieść mysz z powrotem w klatce, monitorując ją aż do pełnego leżenia. Przed pobraniem uszkodzonej tkanki mięśniowej owiń ołówek folią i uszczelnij ołówek taśmą, tak aby dno formy zapewniało równą, zamkniętą powierzchnię. Gdy pleśń będzie gotowa, zdezynfekuj całe zwierzę 70% etanolem i użyj bardzo ostrych nożyczek, aby usunąć skórę w kostce.
Przed pobraniem mięśnia użyj cienkich kleszczy, aby uszczypnąć zamknięte kleszcze przez powięź obok kości piszczelowej w kostce zranionej nogi i przesuń kleszcze w kierunku kolana, aby rozerwać powięź, odsłaniając mięsień piszczelowy przedni. Aby wyizolować mięsień piszczelowy przedni, odsłoń ścięgno dystalne i chwyć ścięgno cienkimi kleszczami. Użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć ścięgno i chwyć mięsień ścięgna, aby przyciągnąć mięsień w kierunku kolana.
Aby umożliwić analizę okolicy brzucha, użyj prostych nożyczek, aby przeciąć mięsień piszczelowy przedni w okolicy brzucha na dwie połówki o równej wielkości i napełnij formę ołówkową do połowy roztworem zamrażającym. Włóż dwie połówki mięśnia piszczelowego przedniego do formy zamrażającej w pozycji pionowej, z obszarem brzucha skierowanym w stronę dolnej części formy. Użyj kleszczy, aby przenieść formę zamrażającą do połowy do ciekłego azotu.
Gdy medium zamrażające zmieni kolor z przezroczystego na biały i stanie się stałe, przenieś formę zamrażającą do zamrażarki o temperaturze 80 stopni Celsjusza lub do suchego lodu w celu przyszłego przetworzenia. W mięśniach kontrolnych architektura tkanki pozostaje nienaruszona, co obserwuje lokalizacja jąder na obrzeżach włókien mięśniowych oraz brak akumulacji komórek jednojądrzastych w przestrzeni śródmiąższowej. Siedem dni po urazie za pośrednictwem kardiotoksyny powstają nowe włókna mięśniowe, oznaczone centralnie położonymi jądrami i nagromadzeniem komórek jednojądrzastych składających się głównie z komórek satelitarnych, ale także komórek niemiogennych, takich jak komórki odpornościowe.
W stanie spoczynku komórki satelitarne oznaczone kolorem Pax7 na czerwono znajdują się pod blaszką podstawną, pokazaną na zielono tutaj. Trzy dni po urazie liczba komórek satelitarnych wzrasta, a komórki satelitarne nie znajdują się już pod blaszką podstawną. W 10 dniu po kontuzji liczba satelitów jest nadal zwiększona.
Aby dokładniej przeanalizować proces regeneracji, nowo powstałe włókna mięśniowe można wybarwić przeciwciałami skierowanymi przeciwko rozwojowej miozynie. Dwa dni po wstrzyknięciu siRNA komórki satelitarne można przeanalizować pod kątem obecności znakowanego fluorescencyjnie siRNA. W tym reprezentatywnym eksperymencie około 75% komórek satelitarnych w regenerującym się mięśniu było dodatnich dla znakowanego fluorescencyjnie siRNA.
Co więcej, około 74% wszystkich regenerujących się włókien mięśniowych było również dodatnich dla znakowanego fluorescencyjnie siRNA, co sugeruje, że albo 74% regenerujących się włókien mięśniowych wchłonęło siRNA, albo że komórki satelitarne siRNA-dodatnie połączyły się ze sobą, tworząc nowe włókna mięśniowe, albo że nastąpiła fuzja z już istniejącymi regenerującymi się włóknami mięśniowymi. Najważniejszym krokiem jest doprowadzenie do całkowitego uszkodzenia mięśnia piszczelowego przedniego. Oprócz analizy histologicznej można rejestrować parametry, takie jak generowana siła, w celu analizy regeneracji mięśni szkieletowych w sposób funkcjonalny.
Przegląd
To badanie przedstawia metodę in vivo do badania utraty funkcji określonego genu w komórkach satelitarnych poprzez uszkodzenie pośredniczone przez kardiotoxinę i wstrzyknięcie samodzielnie dostarczającej się siRNA. Technika umożliwia analizę regeneracji mięśni bez konieczności stosowania zwierząt transgenicznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Medycyna regeneracyjna
Tło
- Komórki satelitarne odgrywają kluczową rolę w regeneracji mięśni.
- Badanie funkcji genów w tych komórkach jest niezbędne do zrozumienia mechanizmów naprawy mięśni.
- Tradycyjne metody często wymagają modeli transgenicznych, co może być ograniczające.
- Samodostarczająca się siRNA oferuje nowatorskie podejście do wyciszania genów in vivo.
Cel badania
- Rozwój metody oceny funkcji genu w komórkach satelitarnych podczas regeneracji mięśni.
- Wykorzystanie kardiotoxiny do wywoływania uszkodzenia mięśni i ułatwienia analizy genów.
- Ocena skuteczności samodzielnie dostarczającej się siRNA w dotarciu do określonych genów.
Zastosowane metody
- Wstrzyknięcie domięśniowe kardiotoxiny w celu wywołania uszkodzenia mięśni.
- Wstrzyknięcie samodzielnie dostarczającej się siRNA ukierunkowanej na gen o interesującej funkcji.
- Analiza histologiczna tkanki mięśniowej po uszkodzeniu.
- Ocena aktywności komórek satelitarnych i regeneracji włókien mięśniowych.
Główne wyniki
- Udało się wywołać uszkodzenie przedniego mięśnia piszczelowego.
- Obserwowano zwiększoną obecność komórek satelitarnych i włókien mięśniowych w fazie regeneracji po uszkodzeniu.
- Około 75% komórek satelitarnych i 74% włókien mięśniowych w fazie regeneracji było pozytywnych na oznaczone fluorescencyjnie siRNA.
- Analiza funkcjonalna wskazywała na skuteczną regenerację mięśni.
Wnioski
- Metoda zapewnia niezawodne podejście do badania funkcji genów w regeneracji mięśni.
- Samodostarczająca się siRNA jest skutecznym narzędziem do wyciszania genów in vivo.
- Ta technika może poszerzyć naszą wiedzę na temat biologii mięśni i procesów regeneracyjnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Direct in vivo interrogation of gene function in satellite cells during skeletal muscle regeneration addresses a critical gap in early discovery and target validation for muscle repair therapeutics. This method enables mechanistic de-risking and predictive confidence without reliance on transgenic models, accelerating portfolio triage and target prioritization. The approach supports enterprise R&D by providing a scalable, physiologically relevant system for functional genomics in regenerative medicine.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional loss-of-gene studies in satellite cells under physiological regeneration conditions.
- Supports mechanistic de-risking by isolating gene-specific effects on muscle repair.
- Facilitates target validation in the absence of transgenic animal models.
- Provides predictive confidence for advancing gene targets in muscle regeneration pipelines.
Screening & Assay Development
- Prepares validated in vivo models for downstream screening of gene function.
- Delivers quantitative outputs via histological and functional muscle assessments.
- Enables reproducible siRNA delivery and uptake measurement in target cell populations.
- Supports assay standardization for gene silencing efficiency and regenerative outcomes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models of muscle injury and repair.
- Maintains translational continuity from gene silencing to functional tissue regeneration.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on in vivo gene function data.
- Supports biomarker alignment through quantifiable regenerative endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling gene function analysis in regenerative contexts, supporting both early target validation and preclinical model development.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification for muscle regeneration targets.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts of gene silencing and regenerative efficacy.
- Analytics: Delivers measurable outputs such as siRNA uptake rates and histological regeneration markers.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical validation in physiologically relevant systems.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for functional genomics across diverse gene targets in muscle biology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows by eliminating the need for transgenic models and enabling scalable gene function studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust in vivo data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of regenerative medicine assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in in vivo muscle injury models and siRNA delivery techniques.
- Demands access to histological and functional muscle analysis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for injury induction and siRNA administration protocols.
- Adaptation may be needed for different muscle groups or species as supported by the protocol.
- Critical to achieve complete and reproducible muscle injury for consistent regenerative analysis.
