Protokół krio-proszkowania do przetwarzania łap myszy w celu oceny molekularnych szlaków zapalenia tkanek w modelu zapalenia stawów wywołanego kolagenem

Ocena profili molekularnych w tkankach lokalnych jest kluczowym krokiem w zrozumieniu mechanizmu działania substancji czynnych, ponieważ są one oceniane w modelach przedklinicznych istotnych dla choroby. W dziedzinie badań nad zapaleniem stawów lokalnym środowiskiem tkankowym, które jest przedmiotem zainteresowania, są małe stawy obciążone, które składają się ze złożonej mieszaniny kości, chrząstek, mięśni i komórek odpornościowych. W tym miejscu opisujemy niezawodną, solidną metodę mechanicznego rozbijania i/lub sproszkowania tego złożonego środowiska tkankowego w kontrolowanym środowisku kriogenicznym.

Metoda ta może być następnie wykorzystana do generowania dalszych wysiłków w zakresie profilowania proteomicznego i transkrypcyjnego w celu ustalenia molekularnych sygnatur choroby z jednego jednolitego źródła próbki. Ta metoda generuje jednorodny proszek, w przeciwieństwie do wielu innych starych technik. Dodatkowo stara procedura izolacji temperaturowej pozwala na izolację wysokiej jakości RNA.

Metoda ta może być następnie wykorzystana do generowania dalszego profilowania proteomicznego i transkrypcyjnego, co umożliwi molekularną charakterystykę odpowiednich szlaków chorobowych będących przedmiotem zainteresowania. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat każdej dziedziny badań, która wyprowadza sygnatury molekularne z tkanek. Metodę tę można rozszerzyć na dowolny złożony układ tkankowy, który ma gęste i trudne do dysocjacji składniki.

Chociaż nie przeprowadziliśmy oceny do tej pory, możemy zaobserwować potencjalne zastosowanie do gęstych tkanek chrzęstnych, takich jak uszy lub kości. Krytyczny czasowo charakter przenoszenia proszku do probówek w celu zważenia wymaga praktyki. Jeśli zajmie to zbyt dużo czasu, proszek zacznie się rozmrażać i stanie się amorficzny.

Ważne jest, aby ograniczyć liczbę próbek do 10 do 15, dopóki nie poczujesz się komfortowo z procedurą. W dniu obróbki tkanek należy schłodzić wszystkie potrzebne narzędzia na suchym lodzie przez co najmniej 10 minut. Noś rękawice termiczne, aby uniknąć uszkodzenia przez ekstremalne zimno.

Następnie przenieś każdą z przygotowanych łap myszy do osobnej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej i natychmiast zamroź w ciekłym azocie. Przechowuj zamrożone łapy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, napełnij młyn zamrażarki ciekłym azotem i pozwól mu się zrównoważyć przez co najmniej 10 minut.

Umieść nieprzetworzoną próbkę na suchym lodzie i przechowuj ją tam, aby uniknąć cykli zamrażania/rozmrażania. Następnie przenieś jedną tylną łapę do wstępnie schłodzonej dużej fiolki do mielenia z poliwęglanu z dolną stalową zatyczką. Włóż wstępnie schłodzony stalowy udar i zamknij fiolkę do mielenia z poliwęglanu wstępnie schłodzoną górną stalową zatyczką.

Przenieś duże fiolki do mielenia z poliwęglanu z próbkami do wstępnie napełnionego młynka zamrażającego i zamknij pokrywę gumowym zatrzaskiem znajdującym się z przodu urządzenia. Pozostawić próbki do ostygnięcia w ciekłym azocie przez jedną minutę. Następnie ustaw młyn zamrażarkowy na program jednominutowy z 10 cyklami na sekundę.

Naciśnij przycisk uruchamiania i poczekaj, aż młyn zamrażający zakończy swój cykl. Następnie otwórz pokrywę młynka zamrażarki i wyjmij dużą fiolkę do mielenia z poliwęglanu. Umieść fiolkę do mielenia w ekstraktorze i wyjmij górną stalową zatyczkę, naciskając w dół na uchwyt, aż stalowa zatyczka wysunie się z rurki poliwęglanowej.

Przenieś otwartą fiolkę do mielenia na suchy lód i użyj wstępnie schłodzonych kleszczyków, aby usunąć stalowy udar. Przenieś zamrożony proszek do wstępnie schłodzonej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Odważyć od 30 do 50 miligramów zamrożonego proszku do wielopoziomowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 mililitra do ekstrakcji RNA i od 100 do 200 miligramów do ekstrakcji białka.

Sproszkowane próbki należy przechowywać w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza i w ciągu 24 godzin poddać izolacji RNA i białek. Najpierw dodaj 10 mikrolitrów beta-merkaptoetanolu na każdy mililitr buforu RLT. Obliczyć objętość buforu RLT odpowiadającą stosunkowi 23,3 mililitra na miligram tkanki i dodać odpowiednią objętość buforu RLT z beta-merkaptoetanolem do probówki z zamrożonym proszkiem.

Wirować próbkę z prędkością 3 000 obr./min przez 10 sekund. Za pomocą pipetara o pojemności jednego mililitra energicznie pipetuj w górę i w dół 10 razy, a następnie ponownie wiruj próbkę z prędkością 3 000 obr./min przez 20 sekund. Wirować przy 13 000 g przez dwie minuty i przenieść 700 mikrolitrów supernatantu do świeżej probówki.

Dodaj 700 mikrolitrów 70% etanolu do tej probówki i załaduj 700 mikrolitrów próbki do kolumny oczyszczającej RNA. Odwirować probówkę z prędkością co najmniej 10 000 razy g przez 30 sekund. Odrzucić przepływowy płyn i załadować pozostałą część próbki do kolumny RNeasy i ponownie odwirować probówkę z prędkością co najmniej 10 000 razy g przez 30 sekund.

Odrzucić przepływowy płyn i przemyć kolumnę, dodając 700 mikrolitrów buforu RW1 i odwirowując z prędkością co najmniej 10 000 razy g przez 30 sekund. W przypadku przeprowadzania opcjonalnego trawienia DNAzy, przed leczeniem DNAzy dodaje się 350 mikrolitrów RW1. A po leczeniu DNAzą dodaje się dodatkowe 350 mikrolitrów RW1.

Następnie przemyć kolumnę dwukrotnie, dodając 500 mikrolitrów buforu RPE i odwirować z prędkością co najmniej 10 000 razy g przez 30 sekund, upewniając się, że za każdym razem odrzucono przepływ. Następnie wysuszyć kolumnę, odwirowując ją z prędkością co najmniej 10 000 razy g przez dwie minuty. Eluować RNA, dodając 50 mikrolitrów wody i odwirowując z prędkością co najmniej 10 000 razy g przez dwie minuty.

Zbierz przepływ i przenieś go do nowej rurki o pojemności 1,5 mililitra. Określ ilość RNA za pomocą wybranej przez badacza metody i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przed dalszą analizą. Rozcieńczyć 10-krotny roztwór podstawowy do lizy komórek do 1-krotnego roztworu podstawowego do lizy komórek wodą o jakości do hodowli komórkowych.

Rozpuść zestaw koktajli inhibitorów proteazy jeden z jednym mililitrem wody, aby uzyskać 100-krotny zapas inhibitora proteazy. Dodaj 100 mililitrów inhibitora proteazy do 9,9 mililitra buforu do lizy komórek 1X, aby uzyskać 1X końcowy roztwór podstawowy. Dodaj cztery mikrolitry lodowatego buforu do lizy komórek na każdy miligram sproszkowanej tkanki i dodaj jeden pięciomilimetrowy koralik ze stali nierdzewnej do probówki.

Obracaj rurkę z prędkością 3 000 obr./min przez 60 sekund. Przenieść probówkę do mokrego lodu i przejść do następnej próbki. Ponadto naukowcy mogą uznać, że umieszczenie pudełka w pozycji pionowej może ułatwić lepsze mieszanie z koralikiem.

Po godzinie odwirować probówki w temperaturze 10 000 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Przenieś supernatanty do świeżej probówki, uważając, aby uniknąć warstwy tłuszczu na górze. Określ całkowite stężenie białka.

Każdą próbkę podzielić na 1,5 mililitrowe probówki wirówkowe i przechowywać w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do momentu przygotowania do przeprowadzenia dalszej analizy. W tym badaniu metoda mielenia kriogenicznego jest stosowana do przetwarzania mysich łap w celu poprawy wydajności i jakości RNA lub białka wyekstrahowanego z tkanek oraz umożliwienia analizy profili molekularnych związanych z reakcjami zapalnymi. Reprezentatywna wizualizacja obrazu żelu pokazuje RNA wyekstrahowane z przednich łap myszy CIA.

Pasma 28S rRNA i 18S rRNA wskazują, że wszystkie próbki mają wystarczającą ilość nienaruszonego RNA. Reprezentatywny wykres punktowy całkowitych stężeń białka na podstawie analizy BCA białka jest pokazany tutaj. Całkowite stężenia białka u myszy nieleczonych wcześniej, myszy CIA lub myszy CIA poddanych różnym terapiom są porównywalne we wszystkich grupach.

Następnie przeprowadza się analizy Luminex w celu określenia stężeń cytokin zapalnych i chemokin w ekstrakcie białkowym. Reprezentatywny wykres rozproszenia stężeń znormalizowanych cytokin i chemokin ujawnia, że w porównaniu z myszami naiwnymi, kilka cytokin jest podwyższonych u myszy CIA, a leczenie przeciwciałem anty-IL17A znacznie hamuje produkcję kilku cytokin. Analiza mikromacierzy jest wykonywana w celu oceny zmian transkryptomu w CIA i efektów związanych z leczeniem.

Reprezentatywny wykres mapy cieplnej genów znacznie wzrósł u myszy CIA w porównaniu z myszami naiwnymi. Podczas wykonywania tej procedury naukowcy muszą zminimalizować czas, w którym probówka i proszek są trzymane z dala od suchego lodu. Pomaga to zapobiec rozmrażaniu proszku i późniejszym problemom ze zdegradowanym RNA i białkiem.

Wysoka jakość sygnatur molekularnych generowanych przez tę technikę pozwala naukowcom na zbadanie unikalnego profilu, jaki nada terapia, a ponadto pozwala na różnicowanie mechanizmów, które można wykorzystać w leczeniu stanów zwyrodnieniowych stawów. Technika ta może być wykorzystana do ekstrakcji wielu gęstych tkanek, takich jak uszy i kości, w celu dalszej oceny sygnatur molekularnych w tych tkankach. Zrozumienie, w jaki sposób terapie modulują molekularne sygnatury choroby, pozwala nam lepiej ocenić, jakie konkretne szlaki sygnałowe są modulowane.

I, co być może nawet ważniejsze, które szlaki nie są regulowane przez oceniany mechanizm terapeutyczny. Podczas pracy z ciekłym azotem i suchym lodem konieczne jest stosowanie środków ochrony osobistej, w tym odpowiednio dobranych rękawic i przyłbic. Narażenie skóry na dłużej niż kilka sekund może spowodować poważne oparzenia.

Podczas pracy z dużymi ilościami suchego lodu ważne jest, aby pracować w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, ponieważ suchy lód uwalnia dwutlenek węgla.