Name: Protokół krio-proszkowania do przetwarzania łap myszy w celu oceny molekularnych szlaków zapalenia tkanek w modelu zapalenia stawów wywołanego kolagenem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Poznaj metodę kriogenicznego mielenia łap myszy w celu izolacji wysokiej jakości RNA i białek. Technika ta umożliwia analizę profili molekularnych związanych z zapaleniem w modelu zapalenia stawów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Edith Janssen za krytyczną recenzję rękopisu oraz Navinowi Rao i Jennifer Towne za wsparcie publikacji tego rękopisu.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) firmy Janssen R&D.
1. Metoda proszkowania oparta na młynie do zamrażania kriogenicznego
<ol>
	<li>Po zakończeniu badania CIA należy złożyć ofiary na myszach z 1,5% izofluranem, a następnie zwichnąć szyjkę macicy.</li>
	<li>W dniu przetwarzania tkanek należy wstępnie schłodzić wszystkie narzędzia (szpatułki, fiolki do mielenia itp.) na suchym lodzie przez co najmniej 10 minut. Nosić rękawice termiczne, aby uniknąć uszkodzeń spowodowanych zamarzaniem.</li>
	<li>Odetnij tylne łapy nożycami na linii futra, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1A.</li>
	<li>Przenieś każdą łapę do jednej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, natychmiast zamroź w ciekłym azocie i przechowuj zamrożone łapy w temperaturze -80 °C. Nie przechowywać próbek w stanie zamrożonym dłużej niż jeden tydzień.</li>
	<li>Napełnij młyn zamrażarki ciekłym azotem, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1B i pozwól mu się zrównoważyć przez co najmniej 10 minut.</li>
	<li>Nieprzetworzoną próbkę należy przechowywać na suchym lodzie i unikać cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
	<li>Przenieś jedną tylną łapę do wstępnie schłodzonej dużej fiolki do mielenia z poliwęglanu z dolną stalową zatyczką, włóż wstępnie schłodzony stalowy impaktor i zamknij fiolkę do mielenia z poliwęglanu wstępnie schłodzoną górną stalową zatyczką (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Przenieś duże fiolki do mielenia z poliwęglanu wraz z próbkami do młynka zamrażarki wstępnie napełnionego płynem i zamknij pokrywę gumowym zatrzaskiem znajdującym się z przodu urządzenia.</li>
	<li>Pozwól próbkom ostygnąć w ciekłym azocie przez 1 minutę.</li>
	<li>Ustaw młynek zamrażarkowy na program 1-minutowy z 10 cyklami na sekundę i naciśnij przycisk start. Poczekaj, aż młyn zamrażający zakończy swój cykl. 
	nuta: Maszyna wydaje dźwięk bębnienia, gdy stalowy impaktor porusza się w przód iw tył. Używaj zatyczek do uszu, aby uniknąć utraty słuchu.</li>
	<li>Otwórz pokrywę młynka zamrażarki, wyjmij dużą fiolkę do mielenia z poliwęglanu i umieść ją w ekstraktorze, jak pokazano na <silna klasa = "xfig">Rysunek 1D. Zdejmij górną stalową zatyczkę, naciskając w dół na uchwyt, aż stalowa zaślepka wysunie się z rurki poliwęglanowej.</li>
	<li>Przenieść otwartą dużą fiolkę do mielenia z poliwęglanu na suchy lód. Zdejmij stalowy impaktor za pomocą wstępnie schłodzonych kleszczy.</li>
	<li>Przenieść zamrożony proszek do wstępnie schłodzonej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odważyć 30-50 mg zamrożonego proszku do wytarowanej zamrożonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml do ekstrakcji RNA i 100-200 mg zamrożonego proszku do ekstrakcji białka. 
	nuta: Zamrożony proszek powinien wyglądać jak biały lub jasnoróżowy drobny piasek, jak pokazano na Rysunek 1E.</li>
	<li>Sproszkowane próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C i w ciągu 24 godzin poddać izolacji RNA i białek.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja RNA
<ol>
	<li>Dodać 10 μl β-merkaptoetanolu (β-ME) na 1 ml buforu RLT.</li>
	<li>Obliczyć objętość buforu RLT odpowiadającą stosunkowi 23,3 ml/mg tkanki i dodać odpowiednią objętość buforu RLT z β-ME do probówki z zamrożonym proszkiem. Stosunek ten został empirycznie określony jako idealny dla łap myszy.</li>
	<li>Wirować próbkę z prędkością 3,000 obr./min przez 10 s.</li>
	<li>Dobrze wymieszać, energicznie pipetując 10 razy w górę i w dół za pomocą pipetora o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Ponownie wirować próbkę z prędkością 3,000 obr./min przez 20 s.</li>
	<li>Odwirować probówkę o masie 13 000 x g przez 2 minuty.</li>
	<li>Przenieść 700 μl supernatantów do świeżej probówki i dodać 700 μl 70% etanolu. 
	nuta: Jeśli w probówce znajduje się <700 μl, dopuszczalne jest kontynuowanie, nadal dodając równoważną objętość 70% etanolu.</li>
	<li>Załadować 700 μl próbki do kolumny oczyszczającej RNA.</li>
	<li>Odwirować probówkę o stężeniu 10 000 x g ≥ przez 30 s.</li>
	<li>Odrzucić przepływ i załadować pozostałą część próbki do kolumny RNeasy.</li>
	<li>Odwirować probówkę o stężeniu 10 000 x g ≥ przez 30 s.</li>
	<li>Odrzucić przepływ i przepłukać kolumnę, dodając 700 μl buforu RW1 z odwirowaniem ≥10 000 x g przez 30 s. W przypadku przeprowadzania opcjonalnej mineralizacji DNASE, przed poddaniem działaniu DNASE dodaje się 350 μl RW1. A po poddaniu działaniu DNASE dodaje się dodatkowe 350 μl RW1</li>.
	<li>Opcjonalnie) Wykonaj etap mineralizacji DNazy zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przemyć probówkę dwukrotnie, dodając 500 μl buforu RPE, a następnie odwirować przy ≥10 000 x g przez 30 s. Za każdym razem wyrzuć przepływ</li>.
	<li>Wysuszyć kolumnę przez odwirowanie w stężeniu 10 000 x g ≥ przez 2 min.</li>
	<li>Eluować RNA, dodając 50 μl wody z odwirowaniem w ≥10 000 x g przez 2 min. Zebrać przepływ i przenieść do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Określić ilość RNA przy użyciu metody wybranej przez badacza i przechowywać w temperaturze -80 °C przed dalszą analizą.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja białka
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 10-krotny roztwór podstawowy do lizy komórek w 1-krotnym roztworze podstawowym do lizy komórek, używając wody o jakości do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Rozpuść zestaw koktajli inhibitorów proteazy I w 1 ml wody, aby uzyskać 100-krotny zapas inhibitora proteazy.</li>
	<li>Dodaj 100 μl inhibitora proteazy do 9,9 ml 1x lizy komórek, aby uzyskać 1x końcowy roztwór podstawowy.</li>
	<li>Dodaj 4 μl lodowatego lodu 1x bufor do lizy komórek na mg sproszkowanej tkanki (np. 800 μl buforu do lizy na 200 mg proszku tkankowego).</li>
	<li>Dodaj jeden koralik ze stali nierdzewnej o średnicy 5 mm do tuby.</li>
	<li>Wirować probówkę z prędkością 3 000 obr./min przez 60 s. Przenieść probówkę do mokrego lodu i kontynuować do następnej próbki.</li>
	<li>Umieścić wszystkie probówki z próbkami w pudełku i potrząsać pojemnikiem wirówki na kołysce z prędkością 1 000 obr./min, 4 °C przez 1 godzinę. 
	nuta: Naukowcy mogą uznać, że umieszczenie pudełka w pozycji pionowej może ułatwić lepsze mieszanie z koralikiem.</li>
	<li>Odwirować probówki o ciśnieniu 10 000 x g i temperaturze 4 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Przenieś supernatanty do świeżej probówki i omijaj warstwę tłuszczu na wierzchu.</li>
	<li>Określ całkowite stężenie białka. 10 do 30-krotne rozcieńczenie lizatu białkowego jest idealne do testu BCA.</li>
	<li>Podwielokrotność próbki rozlać do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C przed dalszą analizą.</li>
</ol>

<ol><li>Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+mechanisms+in+the+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> Journal of Clinical Rheumatology. 11, S39-S44 (2005).</li>
<li>McInnes, I. B., Schett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of rheumatoid arthritis.</a> New England Journal of Medicine. 365, 2205-2219 (2011).</li>
<li>Ahlqvist, E., Hultqvist, M., Holmdahl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+value+of+animal+models+in+predicting+genetic+susceptibility+to+complex+diseases+such+as+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">The value of animal models in predicting genetic susceptibility to complex diseases such as rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Research and Therapy. 11, 226(2009).</li>
<li>David, C. S., Taneja, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+major+histocompatibility+complex+genes+in+murine+collagen-induced+arthritis%3A+a+model+for+human+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+the+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of major histocompatibility complex genes in murine collagen-induced arthritis: a model for human rheumatoid arthritis.</a> American Journal of the Medical Sciences. 327, 180-187 (2004).</li>
<li>Tarkowski, A., Holmdahl, R., Klareskog, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+factors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Monographs+in+Allergy%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid factors in mice.</a> Monographs in Allergy. 26, 214-229 (1989).</li>
<li>Schurgers, E., Billiau, A., Matthys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-induced+arthritis+as+an+animal+model+for+rheumatoid+arthritis%3A+focus+on+interferon-gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Interferon+%26+Cytokine+Research%22%5BJournal%5D)">Collagen-induced arthritis as an animal model for rheumatoid arthritis: focus on interferon-gamma.</a> Journal of Interferon & Cytokine Research. 31, 917-926 (2011).</li>
<li>Joosten, L. A., Helsen, M. M., van de Loo, F. A., van den Berg, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticytokine+treatment+of+established+type+II+collagen-induced+arthritis+in+DBA%2F1+mice.+A+comparative+study+using+anti-TNF+alpha+anti-IL-1+alpha%2Fbeta%2C+and+IL-1Ra%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Anticytokine treatment of established type II collagen-induced arthritis in DBA/1 mice. A comparative study using anti-TNF alpha anti-IL-1 alpha/beta, and IL-1Ra.</a> Arthritis & Rheumatology. 39, 797-809 (1996).</li>
<li>Asquith, D. L., Miller, A. M., McInnes, I. B., Liew, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Animal models of rheumatoid arthritis.</a> European Journal of Immunology. 39, 2040-2044 (2009).</li>
<li>Williams, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-induced+arthritis+as+a+model+for+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Collagen-induced arthritis as a model for rheumatoid arthritis.</a> Methods in Molecular Medicine. 98, 207-216 (2004).</li>
<li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Blockade+of+TNF-alpha+and+IL-17A+Alleviates+Progression+of+Collagen-Induced+Arthritis+without+Causing+Serious+Infections+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Combined Blockade of TNF-alpha and IL-17A Alleviates Progression of Collagen-Induced Arthritis without Causing Serious Infections in Mice.</a> Journal of Immunology. 202, 2017-2026 (2019).</li>
</ol>

Autorzy BJ, SH, ML, RM, ML, TO i FS są pracownikami Janssen Research & Development Inc i są udziałowcami spółki macierzystej, Johnson & Johnson, Inc.

Chociaż istnieją silne naukowe przesłanki do oceny szlaków molekularnych w tkankach maziowych, wiele doniesień na temat profilowania immunologicznego mysiego modelu CIA koncentrowało się na krwi obwodowej, podczas gdy dane z analizy białek i RNA łap w stanie zapalnym są raczej ograniczone. Istnieje kilka możliwych przyczyn tego uprzedzenia: mysie stawy skokowe nie są większe niż ~2 cm; Dotknięte obszary składają się ze skóry, kości i tkanek łącznych, które często są trudne do homogenizacji przy użyciu tradycyjnych metod,...

Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) jest przewlekłą ogólnoustrojową chorobą zapalną z utrzymującym się symetrycznym zapaleniem stawów i dodatkowym zajęciem stawowym narządów, takich jak skóra, serce, płuca i oczy1. Chociaż ogólnoustrojowe objawy odpowiedzi immunologicznej są widoczne u ludzi, jedną z cech charakterystycznych patologii RZS jest infiltracja komórek odpornościowych w tkance maziowej i proliferacja komórek fibroblastów maziowych2.
Podobnie jak u człowieka, model zapalenia stawów wywołanego kolagenem myszy (CIA) wywołuje silne zapalenie tkanek z aktywnymi odpowiedziami immunologicznymi w tkankach maziowych i przedziałach ogólnoustrojowych. Podatność różnych szczepów myszy na model CIA łączy się z haplotypem głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) oraz interakcjami limfocytów T i limfocytów B specyficznych dla antygenu3,4. Ponadto w tym modelu widocznych jest również wiele szlaków patogennych w ludzkim RZS, w tym wytwarzanie autoprzeciwciał, odkładanie kompleksu immunologicznego, aktywacja komórek szpikowych, objawy wielostawowe i tworzenie łuszczycy z infiltracją immunologiczną błony maziowej5,6. Badacze wykorzystali ten dobrze znany model CIA do zbadania efektów leczenia cytokinami przeciwzapalnymi7. Wiele leków biologicznych zatwierdzonych do leczenia chorób autoimmunologicznych lub zapalnych, takich jak anty-TNFα i anty-IL-6, okazuje się skutecznych w modelu CIA8,9.
Profilowanie interakcji układu odpornościowego w tkance maziowej jest kluczowe dla wyjaśnienia mechanizmów molekularnych związanych z patogenezą RZS. W warunkach klinicznych u ludzi powszechną praktyką jest wykonywanie biopsji maziowej igłowej pod kierunkiem obrazowania ultrasonograficznego. W warunkach przedklinicznych mniejsza architektura mysich stawów sprawia, że procedury biopsji są znacznie trudniejsze, jeśli nie niemożliwe. Niedawno zademonstrowaliśmy wykorzystanie mysiego modelu CIA do oceny kombinacji leków w celu wpływu na rozbieżne punkty końcowe i rozwiązania choroby w podejściu kombinatorycznym10. Zastosowano metodę proszkowania opartą na młynie kriogenicznym w zamrażarce, aby przetworzyć zapalone łapy myszy na jednorodne drobne proszki i ustalić dalsze procesy ekstrakcji RNA i białek. Metoda ta chroni RNA i białko przed enzymatycznymi i chemicznymi procesami degracyjnymi i umożliwia zastosowanie wielu metod analitycznych do jednego homogenizowanego źródła próbki.

<table><tbody><tr><td>Koralik ze stali nierdzewnej 5 mm</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>beta-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>Środek redukujący próbki, który hamuje enzymy RNASE</td></tr><tr><td>Zestaw bioanalizatora</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>Zestaw kwalifikacyjny RNA</td></tr><tr><td>b-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy hodowli komórkowej</td><td>Corning</td><td>25-055-CI</td><td>Woda</td></tr><tr><td>Roztwór podstawowy do lizy komórek</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9803</td><td></td></tr><tr><td>Probówka Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td>Probówki do mikrofuge</td></tr><tr><td>Skrzynka wirówkowa probówkowa Eppendorf</td><td>Nalgene</td><td>5055</td><td>Skrzynka do trzymania probówek eppendorf w poziomym układzie probówek</td></tr><tr><td>Everlast 247 o zmiennej prędkości</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BR5000</td><td></td></tr><tr><td>Młyn zamrażarkowy</td><td>Spex Sample Prep</td><td>6875</td><td>Zamrażarka/młyn do przetwarzania łap na sproszkowany proszek</td></tr><tr><td>Fiolka do mielenia</td><td>Spex Sample Prep</td><td>6801</td><td>Fiolka z poliwęglanu do przetwarzania łap na sproszkowany proszek</td></tr><tr><td>Zestaw Pierce BCA</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td>Zestaw do ilościowego oznaczania całkowitego białka</td></tr><tr><td>Zestaw koktajli inhibitorów proteazy 1</td><td>Calbiochem</td><td>539131</td><td>Inhibitory</td></tr> <tr><td>proteazyZestaw białkowy BCA</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Quantigene</td><td>Zestaw do analizy bDNA</td><td>Thermofisher</td><td>QP1013</td></tr><tr><td>Mikrowirówka z chłodzeniem</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Wirowanie</td></tr><tr><td>Bufor RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Bufor do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>Mini zestaw RNeasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td>, <td>w tym kolumna RNeasy, bufor RLT i bufor RW1</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BR5000</td> Szpatułka <td>kołyskowa/wytrząsarka</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>10806-412</td><td>Szpatułka do przenoszenia proszku</td></tr><tr><td>Koralik ze stali nierdzewnej</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td>Koralik do mieszania podczas ekstrakcji białek</td></tr><tr><td>Ekstraktor do probówek</td><td>Spex Sample Prep</td><td>6884</td><td>Ekstraktor do usuwania górnej części fiolki do mielenia</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td>Mieszanie próbek</td></tr></tbody></table>

protokół krio-proszkowania do przetwarzania łap myszy w celu oceny molekularnych szlaków zapalenia tkanek w modelu zapalenia stawów wywołanego kolagenem

A Cryo-pulverization Protocol for Processing Mouse Paws to Evaluate Molecular Pathways of Tissue Inflammation in a Collagen Induced Arthritis Model

Profilowanie zmian molekularnych w lokalnych tkankach jest kluczowe dla zrozumienia mechanizmu(ów) działania kandydatów na terapię in vivo. W dziedzinie badań nad zapaleniem stawów wiele badań koncentruje się na stanach zapalnych stawów, które składają się ze złożonej mieszaniny kości, chrząstek, mięśni, komórek zrębu i komórek odpornościowych. W tym miejscu opracowaliśmy niezawodną i solidną mechaniczną metodę rozbijania zapalnych łap myszy na jednorodne, sproszkowane próbki w kontrolowanym środowisku kriogenicznym. Lizaty białek i RNA poddano obróbce, aby umożliwić uzyskanie proteomicznych i transkrypcyjnych punktów końcowych oraz molekularną charakterystykę istotnych szlaków chorobowych w tkance lokalnej.

Poniżej, na Rysunku 2A, przedstawiamy reprezentacyjny obraz wizualizacji żelu dla RNA wyekstrahowanego z przednich łap myszy w modelu CIA. Prążki 28S rRNA oraz 18S rRNA wskazują, że wszystkie próbki zawierają wystarczającą ilość nienaruszonego RNA. Następnie, na Rysunku 2B>, prezentujemy reprezentacyjny wykres rozrzutu stężeń całkowitego białka wyznaczonego na podstawie analizy BCA białek. Stężen...

Metoda rozdrabniania kriogenicznego do przetwarzania mysich łap za pomocą młyna zamrażającego ciekły azot została opracowana w celu poprawy wydajności i jakości RNA lub białka ekstrahowanego z tkanek i umożliwienia analizy profili molekularnych związanych z reakcjami zapalnymi.

Protokół krio-proszkowania do przetwarzania łap myszy w celu oceny molekularnych szlaków zapalenia tkanek w modelu zapalenia stawów wywołanego kolagenem

Profiling molecular changes in local tissues is crucial to understand the mechanism(s) of action of therapeutic candidates in vivo. In the field of ...

Ocena profili molekularnych w tkankach lokalnych jest kluczowym krokiem w zrozumieniu mechanizmu działania substancji czynnych, ponieważ są one oceniane w modelach przedklinicznych istotnych dla choroby. W dziedzinie badań nad zapaleniem stawów lokalnym środowiskiem tkankowym, które jest przedmiotem zainteresowania, są małe stawy obciążone, które składają się ze złożonej mieszaniny kości, chrząstek, mięśni i komórek odpornościowych. W tym miejscu opisujemy niezawodną, solidną metodę mechanicznego rozbijania i/lub sproszkowania tego złożonego środowiska tkankowego w kontrolowanym środowisku kriogenicznym.Metoda ta może być następnie wykorzystana do generowania dalszych wysiłków w zakresie profilowania proteomicznego i transkrypcyjnego w celu ustalenia molekularnych sygnatur choroby z jednego jednolitego źródła próbki. Ta metoda generuje jednorodny proszek, w przeciwieństwie do wielu innych starych technik. Dodatkowo stara procedura izolacji temperaturowej pozwala na izolację wysokiej jakości RNA.Metoda ta może być następnie wykorzystana do generowania dalszego profilowania proteomicznego i transkrypcyjnego, co umożliwi molekularną charakterystykę odpowiednich szlaków chorobowych będących przedmiotem zainteresowania. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat każdej dziedziny badań, która wyprowadza sygnatury molekularne z tkanek. Metodę tę można rozszerzyć na dowolny złożony układ tkankowy, który ma gęste i trudne do dysocjacji składniki.Chociaż nie przeprowadziliśmy oceny do tej pory, możemy zaobserwować potencjalne zastosowanie do gęstych tkanek chrzęstnych, takich jak uszy lub kości. Krytyczny czasowo charakter przenoszenia proszku do probówek w celu zważenia wymaga praktyki. Jeśli zajmie to zbyt dużo czasu, proszek zacznie się rozmrażać i stanie się amorficzny.Ważne jest, aby ograniczyć liczbę próbek do 10 do 15, dopóki nie poczujesz się komfortowo z procedurą. W dniu obróbki tkanek należy schłodzić wszystkie potrzebne narzędzia na suchym lodzie przez co najmniej 10 minut. Noś rękawice termiczne, aby uniknąć uszkodzenia przez ekstremalne zimno.Następnie przenieś każdą z przygotowanych łap myszy do osobnej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej i natychmiast zamroź w ciekłym azocie. Przechowuj zamrożone łapy w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, napełnij młyn zamrażarki ciekłym azotem i pozwól mu się zrównoważyć przez co najmniej 10 minut.Umieść nieprzetworzoną próbkę na suchym lodzie i przechowuj ją tam, aby uniknąć cykli zamrażania/rozmrażania. Następnie przenieś jedną tylną łapę do wstępnie schłodzonej dużej fiolki do mielenia z poliwęglanu z dolną stalową zatyczką. Włóż wstępnie schłodzony stalowy udar i zamknij fiolkę do mielenia z poliwęglanu wstępnie schłodzoną górną stalową zatyczką.Przenieś duże fiolki do mielenia z poliwęglanu z próbkami do wstępnie napełnionego młynka zamrażającego i zamknij pokrywę gumowym zatrzaskiem znajdującym się z przodu urządzenia. Pozostawić próbki do ostygnięcia w ciekłym azocie przez jedną minutę. Następnie ustaw młyn zamrażarkowy na program jednominutowy z 10 cyklami na sekundę.Naciśnij przycisk uruchamiania i poczekaj, aż młyn zamrażający zakończy swój cykl. Następnie otwórz pokrywę młynka zamrażarki i wyjmij dużą fiolkę do mielenia z poliwęglanu. Umieść fiolkę do mielenia w ekstraktorze i wyjmij górną stalową zatyczkę, naciskając w dół na uchwyt, aż stalowa zatyczka wysunie się z rurki poliwęglanowej.Przenieś otwartą fiolkę do mielenia na suchy lód i użyj wstępnie schłodzonych kleszczyków, aby usunąć stalowy udar. Przenieś zamrożony proszek do wstępnie schłodzonej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Odważyć od 30 do 50 miligramów zamrożonego proszku do wielopoziomowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 mililitra do ekstrakcji RNA i od 100 do 200 miligramów do ekstrakcji białka.Sproszkowane próbki należy przechowywać w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza i w ciągu 24 godzin poddać izolacji RNA i białek. Najpierw dodaj 10 mikrolitrów beta-merkaptoetanolu na każdy mililitr buforu RLT. Obliczyć objętość buforu RLT odpowiadającą stosunkowi 23,3 mililitra na miligram tkanki i dodać odpowiednią objętość buforu RLT z beta-merkaptoetanolem do probówki z zamrożonym proszkiem.Wirować próbkę z prędkością 3 000 obr./min przez 10 sekund. Za pomocą pipetara o pojemności jednego mililitra energicznie pipetuj w górę i w dół 10 razy, a następnie ponownie wiruj próbkę z prędkością 3 000 obr./min przez 20 sekund. Wirować przy 13 000 g przez dwie minuty i przenieść 700 mikrolitrów supernatantu do świeżej probówki.Dodaj 700 mikrolitrów 70% etanolu do tej probówki i załaduj 700 mikrolitrów próbki do kolumny oczyszczającej RNA. Odwirować probówkę z prędkością co najmniej 10 000 razy g przez 30 sekund. Odrzucić przepływowy płyn i załadować pozostałą część próbki do kolumny RNeasy i ponownie odwirować probówkę z prędkością co najmniej 10 000 razy g przez 30 sekund.Odrzucić przepływowy płyn i przemyć kolumnę, dodając 700 mikrolitrów buforu RW1 i odwirowując z prędkością co najmniej 10 000 razy g przez 30 sekund. W przypadku przeprowadzania opcjonalnego trawienia DNAzy, przed leczeniem DNAzy dodaje się 350 mikrolitrów RW1. A po leczeniu DNAzą dodaje się dodatkowe 350 mikrolitrów RW1.Następnie przemyć kolumnę dwukrotnie, dodając 500 mikrolitrów buforu RPE i odwirować z prędkością co najmniej 10 000 razy g przez 30 sekund, upewniając się, że za każdym razem odrzucono przepływ. Następnie wysuszyć kolumnę, odwirowując ją z prędkością co najmniej 10 000 razy g przez dwie minuty. Eluować RNA, dodając 50 mikrolitrów wody i odwirowując z prędkością co najmniej 10 000 razy g przez dwie minuty.Zbierz przepływ i przenieś go do nowej rurki o pojemności 1,5 mililitra. Określ ilość RNA za pomocą wybranej przez badacza metody i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przed dalszą analizą. Rozcieńczyć 10-krotny roztwór podstawowy do lizy komórek do 1-krotnego roztworu podstawowego do lizy komórek wodą o jakości do hodowli komórkowych.Rozpuść zestaw koktajli inhibitorów proteazy jeden z jednym mililitrem wody, aby uzyskać 100-krotny zapas inhibitora proteazy. Dodaj 100 mililitrów inhibitora proteazy do 9,9 mililitra buforu do lizy komórek 1X, aby uzyskać 1X końcowy roztwór podstawowy. Dodaj cztery mikrolitry lodowatego buforu do lizy komórek na każdy miligram sproszkowanej tkanki i dodaj jeden pięciomilimetrowy koralik ze stali nierdzewnej do probówki.Obracaj rurkę z prędkością 3 000 obr./min przez 60 sekund. Przenieść probówkę do mokrego lodu i przejść do następnej próbki. Ponadto naukowcy mogą uznać, że umieszczenie pudełka w pozycji pionowej może ułatwić lepsze mieszanie z koralikiem.Po godzinie odwirować probówki w temperaturze 10 000 g i w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut. Przenieś supernatanty do świeżej probówki, uważając, aby uniknąć warstwy tłuszczu na górze. Określ całkowite stężenie białka.Każdą próbkę podzielić na 1,5 mililitrowe probówki wirówkowe i przechowywać w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza do momentu przygotowania do przeprowadzenia dalszej analizy. W tym badaniu metoda mielenia kriogenicznego jest stosowana do przetwarzania mysich łap w celu poprawy wydajności i jakości RNA lub białka wyekstrahowanego z tkanek oraz umożliwienia analizy profili molekularnych związanych z reakcjami zapalnymi. Reprezentatywna wizualizacja obrazu żelu pokazuje RNA wyekstrahowane z przednich łap myszy CIA.Pasma 28S rRNA i 18S rRNA wskazują, że wszystkie próbki mają wystarczającą ilość nienaruszonego RNA. Reprezentatywny wykres punktowy całkowitych stężeń białka na podstawie analizy BCA białka jest pokazany tutaj. Całkowite stężenia białka u myszy nieleczonych wcześniej, myszy CIA lub myszy CIA poddanych różnym terapiom są porównywalne we wszystkich grupach.Następnie przeprowadza się analizy Luminex w celu określenia stężeń cytokin zapalnych i chemokin w ekstrakcie białkowym. Reprezentatywny wykres rozproszenia stężeń znormalizowanych cytokin i chemokin ujawnia, że w porównaniu z myszami naiwnymi, kilka cytokin jest podwyższonych u myszy CIA, a leczenie przeciwciałem anty-IL17A znacznie hamuje produkcję kilku cytokin. Analiza mikromacierzy jest wykonywana w celu oceny zmian transkryptomu w CIA i efektów związanych z leczeniem.Reprezentatywny wykres mapy cieplnej genów znacznie wzrósł u myszy CIA w porównaniu z myszami naiwnymi. Podczas wykonywania tej procedury naukowcy muszą zminimalizować czas, w którym probówka i proszek są trzymane z dala od suchego lodu. Pomaga to zapobiec rozmrażaniu proszku i późniejszym problemom ze zdegradowanym RNA i białkiem.Wysoka jakość sygnatur molekularnych generowanych przez tę technikę pozwala naukowcom na zbadanie unikalnego profilu, jaki nada terapia, a ponadto pozwala na różnicowanie mechanizmów, które można wykorzystać w leczeniu stanów zwyrodnieniowych stawów. Technika ta może być wykorzystana do ekstrakcji wielu gęstych tkanek, takich jak uszy i kości, w celu dalszej oceny sygnatur molekularnych w tych tkankach. Zrozumienie, w jaki sposób terapie modulują molekularne sygnatury choroby, pozwala nam lepiej ocenić, jakie konkretne szlaki sygnałowe są modulowane.I, co być może nawet ważniejsze, które szlaki nie są regulowane przez oceniany mechanizm terapeutyczny. Podczas pracy z ciekłym azotem i suchym lodem konieczne jest stosowanie środków ochrony osobistej, w tym odpowiednio dobranych rękawic i przyłbic. Narażenie skóry na dłużej niż kilka sekund może spowodować poważne oparzenia.Podczas pracy z dużymi ilościami suchego lodu ważne jest, aby pracować w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, ponieważ suchy lód uwalnia dwutlenek węgla.

a-cryo-pulverization-protocol-for-processing-mouse-paws-to-evaluate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film prezentuje terapię komórkową autoimmunologicznego zapalenia stawów u myszy. Komórkom regulatorowym T pochodzącym z iPSC, wyrażającym receptory specyficzne dla albuminy jaja kurzego, wstrzykuje się metylowaną albuminę surowicy bydlęcej (mBSA) emulgowaną w adiuwancie. Mysie komórki prezentujące antygen (APC) przetwarzają i prezentują mBSA limfocytom T, wywołując aktywację limfocytów T i migrację do błony maziowej stawu kolanowego. Kolejne wstrzyknięcia obejmują samo mBSA w lewym kolanie...

Terapia komórkowa autoimmunologicznego zapalenia stawów w modelu mysim

Opracowaliśmy wywołaną miarę bólu stawów i połączyliśmy ją ze standardową metodą pomiaru spontanicznego bólu w różnych mysich modelach chemicznie wywołanego zapalenia stawów. Miary te są czułe i powtarzalne dla różnych rodzajów bólu stawów.

Spontaniczne i wywołane pomiary bólu w mysich modelach jednostawowego bólu kolana

Tutaj prezentujemy trzy metody oceny migracji i infiltracji neutrofili zarówno in vivo, jak i in vitro. Metody te mogą być wykorzystane do odkrycia obiecujących terapii ukierunkowanych na migrację neutrofili.

Wykrywanie migracji i infiltracji neutrofili u myszy

Obecny protokół opisuje kontrolowane zadrapania mikroostrza na powierzchni chrząstki stawowej po destabilizacji kolana myszy poprzez przecięcie przyśrodkowego więzadła minipiszczelowego. Ten model zwierzęcy przedstawia przyspieszoną postać choroby zwyrodnieniowej stawów (OA) odpowiednią do badania tworzenia osteofitów, osteosklerozy i bólu we wczesnym stadium.

Destabilizacja przyśrodkowego łąkotki i chrząstki rys mysiego modelu przyspieszonej choroby zwyrodnieniowej stawów

Niniejsze badanie dostarcza zmodyfikowany protokół izolacji makrofagów i fibroblastów maziowych z mysiej tkanki zapalnego zapalenia stawów.

Izolacja i hodowla pierwotnych makrofagów maziowych i fibroblastów z mysiej tkanki zapalenia stawów

Przedstawiamy protokół manipulacji Tuina wykonywanej na szczurach z chorobą zwyrodnieniową stawu kolanowego wywołaną gipsem. Na podstawie wstępnych wyników zasugerowano, że skuteczność metody zależy od zmniejszenia stanu zapalnego i utraty chrząstki.

Manipulacja Tuina w celu zmniejszenia stanu zapalnego i utraty chrząstki u szczurów z chorobą zwyrodnieniową stawu kolanowego

Badanie pokazuje rolę skóry w modulacji odpowiedzi immunologicznych u myszy poprzez immunizację epikutanną (EC). Szczepienie EC antygenem białkowym może hamować odpowiedzi immunologiczne w przypadku nadwrażliwości kontaktowej lub odwracać supresję indukowaną przez skórę, gdy jest połączona z molekularnymi wzorcami związanymi z patogenem. Szczepienia EC wykazują obiecujące zastosowanie jako skuteczne, bezigłowe podejście do immunoterapii.

Model murinowy immunomodulacji indukowanej przez skórę

Obrazowanie stawów in vivo to cenna technika wykrywająca migracyjne zachowania leukocytów oraz dynamikę molekularną w obrębie zapalonych stawów. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół obrazowania stawów in vivo z wykorzystaniem modelu myszego zapalenia stawów wywołanego kolagenem II (CIA).

In Vivo Obrazowanie ujawnia migracyjne zachowanie leukocytów w stawach

Tutaj przedstawiamy protokół ustanawiający mysi model reumatoidalnego zapalenia stawów (RA) poprzez adoptywny transfer limfocytów T CD4+ od myszy SKG, dostarczając szybkiego i niezawodnego narzędzia eksperymentalnego do badania mechanizmów immunologicznych, patologicznego postępu i rozwoju nowych metod leczenia RZS.

Adoptywny model transferowy reumatoidalnego zapalenia stawów u myszy

Komórki M w wyspecjalizowanym nabłonku związanym z mieszykami, pokrywającym kępki Peyera, odgrywają istotną rolę w nadzorze immunologicznym błony śluzowej w tkance limfatycznej związanej z jelitami. W niniejszej pracy opisaliśmy metodę oceny transcytozy bakteryjnej przez komórki M in vivo. Metoda ta pozwala na zrozumienie funkcji komórek M w układzie odpornościowym.

Zastosowanie testu pętli jelitowej z podwiązaną plamką Peyer’a u myszy do oceny wychwytu bakterii przez komórki M

Poznaj metodę kriogenicznego mielenia łap myszy w celu izolacji wysokiej jakości RNA i białek. Technika ta umożliwia analizę profili molekularnych związanych z zapaleniem w modelu zapalenia stawów.

Protokół krio-proszkowania do przetwarzania łap myszy w celu oceny molekularnych szlaków zapalenia tkanek w modelu zapalenia stawów wywołanego kolagenem (Wideo) | JoVE Journal

Protokół krio-proszkowania do przetwarzania łap myszy w celu oceny molekularnych szlaków zapalenia tkanek w modelu zapalenia stawów wywołanego kolagenem

Przeglądaj więcej filmów